目的本研究目的为构建重组穿梭载体,拯救带有增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)重组病毒,为重组二联苗的研制奠定基础。方法选择已经证实的US区域的US2-SORF3、US7-US8和UL区域中的UL15-UL18的非编码区作为...目的本研究目的为构建重组穿梭载体,拯救带有增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)重组病毒,为重组二联苗的研制奠定基础。方法选择已经证实的US区域的US2-SORF3、US7-US8和UL区域中的UL15-UL18的非编码区作为插入位点构建穿梭载体P-US2-SORF3-EGFP,P-UL15-UL18-EGFP,P-US7-US8-EGFP。在已感染疫苗毒的鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblasts,CEFs)中转染穿梭载体,经细胞同源重组,收集细胞上清,进行噬斑筛选及纯化。结果成功构建了三个带有EGFP标签的穿梭载体,p Blusecript II SK构建的穿梭载体未成功筛选到重组噬斑而用p UC18构建的穿梭载体成功筛选到重组噬斑。结论拯救鸭瘟重组毒的研究中,p Blusecript II SK载体可能不是最佳的适用载体,也可能是插入位点为病毒复制的必须区。展开更多
利用蚀斑试验方法对牛疱疹病毒1型(BHV-1)和牛副流感病毒3型(BPIV-3)的混合病毒进行分离纯化及鉴定,为BHV-1、BPIV-3感染的诊断提供科学依据。将不同稀释度的BHV-1和BPIV-3混合病毒接种至牛肾原代细胞,加营养琼脂培养,产生蚀斑后扩增并R...利用蚀斑试验方法对牛疱疹病毒1型(BHV-1)和牛副流感病毒3型(BPIV-3)的混合病毒进行分离纯化及鉴定,为BHV-1、BPIV-3感染的诊断提供科学依据。将不同稀释度的BHV-1和BPIV-3混合病毒接种至牛肾原代细胞,加营养琼脂培养,产生蚀斑后扩增并RT-PCR鉴定。将纯化后毒液分别进行二次蚀斑纯化及鉴定。结果 BHV-1和BPIV-3混合病毒第6~7 d可产生明显蚀斑。鉴定阳性的BHV-1和BPIV-3进行二次蚀斑,鉴定结果均为阳性,且分离的两种病毒TCID_(50)测定结果为10^(-8.5)/0.1 m L、10^(-6.5)/0.1 m L。首次通过蚀斑试验,成功分离并得到了两株毒力较高且纯化的BHV-1和BPIV-3病毒株。展开更多
文摘目的从轮状病毒阳性的牛粪便标本中,分离出一株G6P[1]型牛轮状病毒(Bovine Rotavirus,BRV),对其进行培养和鉴定。方法用PBS溶液重悬粪便标本并离心,将其上清过滤除菌和胰酶处理后,利用MA104细胞进行分离培养;通过逆转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction,RT-PCR)对样本VP4和VP7基因进行扩增和测序,与GenBank上的参考序列进行同源性分析,构建进化树,分析确定其G/P基因分型。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法(Polyacrylamine Gel Electrophoresis,PAGE)、噬斑实验和电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)等技术对分离到的病毒进行鉴定和纯化。绘制病毒生长动力学曲线。结果分离培养了1株BRV毒株,将其命名BLL。VP7和VP4基因测序结果显示此毒株为G6P[1]型轮状病毒。PAGE胶结果显示分离株电泳型为长型,条带呈现A组轮状病毒排列电泳图谱;通过噬斑实验将毒株进行了纯化。电镜检测到典型的轮状病毒颗粒。病毒生长动力学曲线可发现病毒在感染后6 h已经开始复制。结论本研究成功分离到G6P[1]型牛型轮状病毒,为研究G6P[1]型轮状病毒的病原学特征提供实验基础和技术参考。
文摘目的本研究目的为构建重组穿梭载体,拯救带有增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)重组病毒,为重组二联苗的研制奠定基础。方法选择已经证实的US区域的US2-SORF3、US7-US8和UL区域中的UL15-UL18的非编码区作为插入位点构建穿梭载体P-US2-SORF3-EGFP,P-UL15-UL18-EGFP,P-US7-US8-EGFP。在已感染疫苗毒的鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblasts,CEFs)中转染穿梭载体,经细胞同源重组,收集细胞上清,进行噬斑筛选及纯化。结果成功构建了三个带有EGFP标签的穿梭载体,p Blusecript II SK构建的穿梭载体未成功筛选到重组噬斑而用p UC18构建的穿梭载体成功筛选到重组噬斑。结论拯救鸭瘟重组毒的研究中,p Blusecript II SK载体可能不是最佳的适用载体,也可能是插入位点为病毒复制的必须区。
文摘利用蚀斑试验方法对牛疱疹病毒1型(BHV-1)和牛副流感病毒3型(BPIV-3)的混合病毒进行分离纯化及鉴定,为BHV-1、BPIV-3感染的诊断提供科学依据。将不同稀释度的BHV-1和BPIV-3混合病毒接种至牛肾原代细胞,加营养琼脂培养,产生蚀斑后扩增并RT-PCR鉴定。将纯化后毒液分别进行二次蚀斑纯化及鉴定。结果 BHV-1和BPIV-3混合病毒第6~7 d可产生明显蚀斑。鉴定阳性的BHV-1和BPIV-3进行二次蚀斑,鉴定结果均为阳性,且分离的两种病毒TCID_(50)测定结果为10^(-8.5)/0.1 m L、10^(-6.5)/0.1 m L。首次通过蚀斑试验,成功分离并得到了两株毒力较高且纯化的BHV-1和BPIV-3病毒株。
