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戊型肝炎病毒多拷贝重组质粒的构建及在毕赤酵母中的表达 被引量：2
1
作者 郭敏 雷清 +1 位作者 刘晓 蒋琳 《微生物学免疫学进展》 2014年第6期31-35,共5页
目的体外构建戊型肝炎病毒(HEV)ORF2128-660多拷贝重组表达质粒,以提高HEVORF2128-660在毕赤酵母中的表达水平。方法采用PCR技术扩增目的基因ORF2128-660(E),然后将ORF2128-660(E)同义点突变为ORF2128-660,构建重组表达质粒ORF212 8-660... 目的体外构建戊型肝炎病毒(HEV)ORF2128-660多拷贝重组表达质粒,以提高HEVORF2128-660在毕赤酵母中的表达水平。方法采用PCR技术扩增目的基因ORF2128-660(E),然后将ORF2128-660(E)同义点突变为ORF2128-660,构建重组表达质粒ORF212 8-660/p AO815(单拷贝),Bam HⅠ和BglⅡ双酶切获得的目的基因表达盒(AOX-ORF2128-660)插入去磷酸化的质粒ORF2128-660/p AO815,得到2(AOX-ORF2128-660)/p AO815(2拷贝)质粒。重复上述方法依次构建3(AOX-ORF2128-660)/p AO815(3拷贝)、4(AOX-ORF2128-660)/p AO815(4拷贝)等多拷贝重组质粒。得到的多拷贝重组质粒电转化毕赤酵母菌GS115,甲醇诱导表达,SDS-PAGE分析比较不同拷贝数转化子的表达产量,ELISA检测表达产物的生物活性。结果构建了戊型肝炎病毒(HEV)ORF2128-660多拷贝重组表达质粒,表达的目的蛋白相对分子质量约为59 000,4拷贝重组质粒表达水平高于其他拷贝数重组质粒表达水平。结论成功构建了HEVORF2128-660多拷贝表达质粒,提高了其在毕赤酵母中的表达水平。 展开更多
关键词 戊型肝炎病毒 多拷贝表达盒 同义点突变 毕赤酵母 pao815载体
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戊型肝炎病毒多拷贝分泌表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达 被引量：1
2
作者 郭敏 雷清 +1 位作者 刘晓 蒋琳 《中国新药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期271-275,302,共6页
目的:将胞内表达载体p AO815改建成分泌型表达载体,并体外构建戊型肝炎病毒ORF2128-660多拷贝重组表达质粒,进一步比较不同转化子在毕赤酵母中的表达水平,以得到高表达重组菌株。方法:利用重叠PCR技术将α-factor信号肽基因与目的基因OR... 目的:将胞内表达载体p AO815改建成分泌型表达载体,并体外构建戊型肝炎病毒ORF2128-660多拷贝重组表达质粒,进一步比较不同转化子在毕赤酵母中的表达水平,以得到高表达重组菌株。方法:利用重叠PCR技术将α-factor信号肽基因与目的基因ORF2128-660拼接后插入去磷酸化的p AO815载体,得到分泌型表达重组质粒α-ORF2128-660/p AO815(单拷贝),然后将Bam HⅠ和BglⅡ双酶切获得的目的基因表达盒(AOX-α-ORF2128-660)插入到去磷酸化的重组质粒α-ORF2128-660/p AO815中,得到2(AOX-α-ORF2128-660)/p AO815(2拷贝),电转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导,SDS-PAGE分析不同拷贝数转化子的表达产量,ELISA检测表达产物的生物活性。结果:α-factor信号肽基因与目的基因ORF2128-660已克隆入表达载体中,目的蛋白分泌至诱导液上清中,相对分子质量约为59 000,与阴性对照比,单拷贝、2拷贝转化子表达的产物均有生物活性但表达水平无区别。结论:成功改建成分泌型表达载体,构建了多拷贝重组表达质粒,并且成功表达了目的蛋白,为利用改造的p AO815载体表达其他蛋白奠定了基础。 展开更多
关键词 戊型肝炎病毒 重叠PCR 多拷贝表达盒 毕赤酵母 pao815载体 胞内表达载体 分泌型表 达载体
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人血管内皮抑制素基因在毕赤甲醇酵母中的表达
3
作者 曹志飞 李新平 +1 位作者 潘春娟 邱玲娅 《苏州科技学院学报（自然科学版）》 CAS 2005年第4期57-60,72,共5页
对发生突变的人血管内皮抑制素基因进行了PCR修正,并将其连接到pAO815载体上,然后克隆进大肠杆菌TOP10F’中,提取质粒测序,证实序列正确。再用电激法转化毕赤甲醇酵母KM71,利用RDB平板和PCR技术筛选出阳性克隆菌落后,甲醇诱导表达,SDS-P... 对发生突变的人血管内皮抑制素基因进行了PCR修正,并将其连接到pAO815载体上,然后克隆进大肠杆菌TOP10F’中,提取质粒测序,证实序列正确。再用电激法转化毕赤甲醇酵母KM71,利用RDB平板和PCR技术筛选出阳性克隆菌落后,甲醇诱导表达,SDS-PAGE电泳检测显示重组的人血管内皮抑制素蛋白在毕赤甲醇酵母KM71中获得了有效表达。 展开更多
关键词 人血管内皮抑制素 PCR定点突变 毕赤甲醇酵母 pao815载体 诱导表达
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利用套叠PCR技术改造酵母表达载体pAO815的研究 被引量：3
4
作者 周鹏 郭安平 黎小瑛 《生命科学研究》 CAS CSCD 2002年第4期310-313,共4页
利用套叠PCR技术将α factor信号肽基因插入pAO815之EcoRⅠ位点,构建成分泌型表达载体pAO815α A.在不改变原克隆位点EcoRⅠ的条件下,借助pAO815之第873位的HindⅢ位点,将pAO815AOX1启动子873 940片段连同α factor信号肽基因序列(246bp... 利用套叠PCR技术将α factor信号肽基因插入pAO815之EcoRⅠ位点,构建成分泌型表达载体pAO815α A.在不改变原克隆位点EcoRⅠ的条件下,借助pAO815之第873位的HindⅢ位点,将pAO815AOX1启动子873 940片段连同α factor信号肽基因序列(246bp)插入pAO815之HindⅢ EcoRⅠ之间,构建成含α factor信号肽基因的分泌型表达载体pAO815α A. 展开更多
关键词 套叠PCR技术 改造 酵母表达载体 pao815 分泌型表达载体
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