目的通过基因克隆方法制备鲍曼不动杆菌外膜蛋白W(outer membrane protein W,OmpW),为研究其生物学活性及耐药机制奠定实验基础。方法通过PCR方法扩增鲍曼不动杆菌临床株A1株的外膜蛋白W基因(OmpW),构建原核表达载体pET30a/ompW,采用PC...目的通过基因克隆方法制备鲍曼不动杆菌外膜蛋白W(outer membrane protein W,OmpW),为研究其生物学活性及耐药机制奠定实验基础。方法通过PCR方法扩增鲍曼不动杆菌临床株A1株的外膜蛋白W基因(OmpW),构建原核表达载体pET30a/ompW,采用PCR方法和测序鉴定扩增产物。筛选阳性表达载体后转化至大肠埃希菌表达宿主菌BL21中,IPTG诱导表达重组蛋白并进行纯化。结果 pET30a/ompW原核表达重组载体构建成功,基因测序鉴定,其在原核表达系统中高表达,表达产物分子质量单位约为43ku,与预期值相符。表达产物经8mol/L尿素和Tris-HCl处理纯化,得到高纯度的重组OmpW蛋白。结论成功构建鲍曼不动杆菌OmpW蛋白基因重组原核表达系统,并获得高纯度的重组OmpW蛋白,为研究鲍曼不动杆菌外膜蛋白W的生物学活性以及耐药机制奠定了基础。展开更多
目的Rv1973是人型结核分枝杆菌(M.tuberculosis,Mt)RD区(region of differences)基因表达的一个外膜蛋白(OMP),其功能尚不明确。分枝杆菌和革兰氏阴性菌的外膜结构与其毒力、耐药性等常密切相关。本研究拟构建Mt-Rv1973及其耻垢分枝杆菌...目的Rv1973是人型结核分枝杆菌(M.tuberculosis,Mt)RD区(region of differences)基因表达的一个外膜蛋白(OMP),其功能尚不明确。分枝杆菌和革兰氏阴性菌的外膜结构与其毒力、耐药性等常密切相关。本研究拟构建Mt-Rv1973及其耻垢分枝杆菌(M.smegmatis,Ms)同源基因MSMEG_0353(Ms-Rv1973)重组表达载体并建立其异源性表达的菌株,用于目的蛋白的诱导表达及其生物学功能的相关研究。方法将密码子优化的Mt-Rv1973与Ms-Rv1973的编码序列重组入pMAL-c6T载体并转化入低内毒素的ClearColi BL21(DE3)大肠杆菌中获得异源性Mt-Rv1973与Ms-Rv1973融合表达菌株,并通过对目的蛋白进行诱导表达、SDS-PAGE分析和液相色谱-质谱(LC-MS)鉴定、Ni2+亲和层析和标签切割等获得纯化的目的蛋白。结果成功构建了Mt-Rv1973与Ms-Rv1973表达载体和异源性表达菌株,并经诱导表达和纯化获得了目的蛋白。结论为研究该蛋白的功能奠定了基础。展开更多
文摘目的通过基因克隆方法制备鲍曼不动杆菌外膜蛋白W(outer membrane protein W,OmpW),为研究其生物学活性及耐药机制奠定实验基础。方法通过PCR方法扩增鲍曼不动杆菌临床株A1株的外膜蛋白W基因(OmpW),构建原核表达载体pET30a/ompW,采用PCR方法和测序鉴定扩增产物。筛选阳性表达载体后转化至大肠埃希菌表达宿主菌BL21中,IPTG诱导表达重组蛋白并进行纯化。结果 pET30a/ompW原核表达重组载体构建成功,基因测序鉴定,其在原核表达系统中高表达,表达产物分子质量单位约为43ku,与预期值相符。表达产物经8mol/L尿素和Tris-HCl处理纯化,得到高纯度的重组OmpW蛋白。结论成功构建鲍曼不动杆菌OmpW蛋白基因重组原核表达系统,并获得高纯度的重组OmpW蛋白,为研究鲍曼不动杆菌外膜蛋白W的生物学活性以及耐药机制奠定了基础。
文摘目的Rv1973是人型结核分枝杆菌(M.tuberculosis,Mt)RD区(region of differences)基因表达的一个外膜蛋白(OMP),其功能尚不明确。分枝杆菌和革兰氏阴性菌的外膜结构与其毒力、耐药性等常密切相关。本研究拟构建Mt-Rv1973及其耻垢分枝杆菌(M.smegmatis,Ms)同源基因MSMEG_0353(Ms-Rv1973)重组表达载体并建立其异源性表达的菌株,用于目的蛋白的诱导表达及其生物学功能的相关研究。方法将密码子优化的Mt-Rv1973与Ms-Rv1973的编码序列重组入pMAL-c6T载体并转化入低内毒素的ClearColi BL21(DE3)大肠杆菌中获得异源性Mt-Rv1973与Ms-Rv1973融合表达菌株,并通过对目的蛋白进行诱导表达、SDS-PAGE分析和液相色谱-质谱(LC-MS)鉴定、Ni2+亲和层析和标签切割等获得纯化的目的蛋白。结果成功构建了Mt-Rv1973与Ms-Rv1973表达载体和异源性表达菌株,并经诱导表达和纯化获得了目的蛋白。结论为研究该蛋白的功能奠定了基础。