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题名无义突变型荧光素酶稳定表达细胞株的建立
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作者
谢骁祥
袁辉
王震宇
程静
吴磊
杜柳涛
江高峰
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机构
武汉科技大学附属天佑医院中心实验室
武汉科技大学医学院公共卫生学院
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出处
《药物分析杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2017年第4期583-588,共6页
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基金
国家自然科学基金资助项目(项目编号81373302)
武汉市中青年医学骨干人才培养工程
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文摘
目的:建立稳定表达含无义突变位点荧光素酶的细胞株,用以筛选新的无义突变通读剂。方法:酶切质粒p GL4-WT和p GL4-MUT,得到野生型和无义突变荧光素酶编码c DNA,分别插入到慢病毒载体p LVX-IRES-Neo多克隆位点。酶切及PCR鉴定后,将重组载体包装成慢病毒颗粒,感染HEK 293细胞,单克隆细胞抗性筛选获得稳定细胞株,提取总RNA,经逆转录PCR方法验证荧光素酶m RNA表达。最后用已知阳性无义突变通读剂G 418处理细胞,Western blot方法检测处理前后荧光素酶蛋白表达水平,同时分析荧光素酶活性。结果:经酶切获得2.7 kb长野生型和无义突变荧光素酶编码c DNA,与p LVX-IRES-Neo连接获得重组慢病毒载体p LVX-WT、p LVX-MUT,EcoRⅠ单酶切、NheⅠ与BamHⅠ双酶切结果证明序列正确插入,PCR也扩增出目的片段;稳定感染慢病毒的HEK293WT和HEK293MUT细胞经逆转录PCR方法成功检测到荧光素酶m RNA表达;阳性通读剂G 418处理细胞后发现,HEK293WT细胞在处理前后均表达荧光素酶蛋白,荧光素酶活性也基本相同,而HEK293MUT细胞在处理前不表达荧光素酶蛋白,无荧光素酶活性,处理后恢复了部分荧光素酶蛋白表达,其荧光素酶活性相当于HEK293WT细胞的20%。结论:成功建立了稳定表达无义突变荧光素酶的细胞株,可用于筛选新的无义突变通读剂。
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关键词
基因治疗药物筛选
无义突变通读剂
提前终止密码子
荧光素酶
蛋白质截短试验
双荧光素酶报告基因检测方法
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Keywords
gene therapy drug screening
nonsense mutation readthrough agent
premature termination codons
luciferase
protein truncation test
dual luciferase reporter gene assay
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分类号
R917
[医药卫生—药物分析学]
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