DNA聚合酶β在食管癌组织中的修复功能 被引量：4

1

作者 赵四敏 陈旭东 +2 位作者 张成娟 赵国强 董子明 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2010年第23期2460-2463,共4页

目的:观察突变型DNA聚合酶β(DNA polymerase β,polβ)的碱基切除修复(base excision repair,BER)功能的改变.方法:将polβ真核表达载体pcDNA4-C-polβ1,pcDNA4-C-polβ2以脂质体介导方式转染polβ基因敲除的EC9706细胞,G418筛选得到... 目的:观察突变型DNA聚合酶β(DNA polymerase β,polβ)的碱基切除修复(base excision repair,BER)功能的改变.方法:将polβ真核表达载体pcDNA4-C-polβ1,pcDNA4-C-polβ2以脂质体介导方式转染polβ基因敲除的EC9706细胞,G418筛选得到稳定转染pcDNA4-C-polβ1,pcDNA4-C-polβ2的细胞克隆;通过镍柱亲和层析法纯化蛋白;退火合成含有单碱基缺失的DNA底物,与纯化的野生型和突变型polβ蛋白进行BER修复实验.结果:G418筛选得到稳定转染pcDNA4-C-polβ1,pcDNA4-C-polβ2的EC9706细胞;提取并纯化出polβ1、polβ2蛋白与退火合成单碱基缺口的DNA底物进行BER实验.在BER实验中,野生型polβ能够在DNA底物的酶切位点处将其完全切开,而突变型polβ仅将其部分切开.结论:野生型的polβ能够修复单碱基缺失的DNA底物,而突变型的polβ碱基切除修复功能明显减弱. 展开更多

关键词 DNA聚合酶Β 镍柱亲和层析 碱基切除修复

下载PDF 职称材料

胸腺肽α_1的温度诱导原核可溶性表达与简易纯化 被引量：3

2

作者 陈培富 李红芳 +1 位作者 鲁琼芬 陈俊 《云南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期183-187,共5页

将人工合成的人胸腺肽α1(Tα1)基因插入到载体pBV222,转化大肠杆菌DH5α菌株并置42℃诱导表达可溶性融合蛋白。融合蛋白经镍亲和层析柱纯化,加入肠激酶切割,再将酶切反应体系回到镍亲和层析柱。所获穿过液中的重组胸腺肽α1(rTα1),经... 将人工合成的人胸腺肽α1(Tα1)基因插入到载体pBV222,转化大肠杆菌DH5α菌株并置42℃诱导表达可溶性融合蛋白。融合蛋白经镍亲和层析柱纯化,加入肠激酶切割,再将酶切反应体系回到镍亲和层析柱。所获穿过液中的重组胸腺肽α1(rTα1),经十二烷基硫酸钠-聚苯烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离及分析,纯度分别为94.5%和72%。以癌症患者外周血淋巴细胞开展玫瑰花环试验,所获rTα1纯品显示出与化学合成Tα1(sTα1)相同的生物学活性。 展开更多

关键词 胸腺肽Α1 原核表达系统 镍亲和层析 反相高效液相色谱 玫瑰花环试验

下载PDF 职称材料

蛋白质层析系统在实验教学中的应用 被引量：2

3

作者 赵玉红 李欣 +5 位作者 崔建林 赵立青 李小菊 李登文 张金红 周浩 《实验技术与管理》 CAS 北大核心 2016年第5期48-51,57,共5页

设计"KTAprime plus蛋白质层析系统纯化绿色荧光蛋白(GFP)"的综合实验,以GFP蛋白为研究对象,在大肠杆菌中大量表达重组GFP蛋白,经镍柱亲和层析、离子交换层析以及凝胶过滤层析3种常用层析技术逐步纯化,各步纯化样品经SDS-P... 设计"KTAprime plus蛋白质层析系统纯化绿色荧光蛋白(GFP)"的综合实验,以GFP蛋白为研究对象,在大肠杆菌中大量表达重组GFP蛋白,经镍柱亲和层析、离子交换层析以及凝胶过滤层析3种常用层析技术逐步纯化,各步纯化样品经SDS-PAGE鉴定分析,最终获得高纯度的GFP蛋白。通过该实验使学生深入、全面、系统地掌握生命科学研究中最新的蛋白质分离纯化技术,提高学生的科研水平和综合能力。 展开更多

关键词 蛋白质层析系统 蛋白质分离纯化 镍柱亲和层析 离子交换层析 凝胶过滤层析

下载PDF 职称材料

Tum5蛋白多克隆抗体的制备及纯化

4

作者 李迪 张更 +5 位作者 武国军 刘飞 王禾 秦卫军 袁建林 于磊 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期9-13,共5页

目的制备Tum5蛋白多克隆抗体并纯化。方法利用pQE30-Tum5重组质粒在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗Tum5多克隆抗体,ELISA方法检测抗体滴度,亲和层析法纯化兔抗Tum... 目的制备Tum5蛋白多克隆抗体并纯化。方法利用pQE30-Tum5重组质粒在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗Tum5多克隆抗体,ELISA方法检测抗体滴度,亲和层析法纯化兔抗Tum5多克隆抗体。结果利用pQE30-Tum5重组质粒,经原核表达和亲和层析获得Tum5蛋白;利用Tum5蛋白制备多克隆抗体,纯度大于95%。结论利用原核表达的Tum5蛋白成功地制备了兔抗Tum5多克隆抗体。 展开更多

关键词 Tum5 亲和层析纯化 多克隆抗体

下载PDF 职称材料

重组甜味蛋白Monellin在E.coli中的表达条件及其对ICR小鼠血糖的影响

5

作者 杨冬梅 王晨璐 +4 位作者 刘嘉健 方越 葛瑛 韩淳致 曹荣月 《中国调味品》 CAS 北大核心 2021年第7期1-6,共6页

实验探究了重组Monellin菌株的最佳培养条件,并对其进行了甜味阈值确认和血糖值影响实验。实验所用菌种为实验室构建保存的BL21(DE3)-pET28a Monellin菌种,利用不同浓度的乳糖和IPTG诱导该菌种生成目的蛋白,探究其最佳诱导条件,利用镍... 实验探究了重组Monellin菌株的最佳培养条件,并对其进行了甜味阈值确认和血糖值影响实验。实验所用菌种为实验室构建保存的BL21(DE3)-pET28a Monellin菌种,利用不同浓度的乳糖和IPTG诱导该菌种生成目的蛋白,探究其最佳诱导条件,利用镍柱亲和层析纯化目的蛋白后进行相对甜度和甜味阈值实验,随后设置甜度梯度,对小鼠进行灌胃比较蔗糖和Monellin的升血糖作用及不同浓度Monellin对血糖的影响。实验结果表明,0.9 mmol/L IPTG诱导5 h的Monellin表达量最多,其甜味阈值为100μg/mL,相对甜度为蔗糖的800倍。灌胃结果表明,Monellin升血糖作用不显著,并且在一定范围内对血糖的影响不随其浓度的改变而发生变化。该实验为Monellin在糖尿病等代糖食品市场上的应用提供了科学的理论依据。 展开更多

关键词 甜味蛋白Monellin 诱导条件 镍柱亲和层析 甜味阈值 血糖值

下载PDF 职称材料

人β-NGF在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定 被引量：2

6

作者 李佳楠 杨薇 +1 位作者 吴红梅 汤华东 《中国药学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第20期1785-1790,共6页

目的利用大肠杆菌表达系统表达经密码子突变的重组人神经生长因子(rhβ-NGF),并对表达产物进行分离纯化和生物学活性鉴定。方法利用化学合成法合成经密码子突变后的人神经生长因子β亚基成熟肽段基因及前导肽基因;构建原核表达载体pET28... 目的利用大肠杆菌表达系统表达经密码子突变的重组人神经生长因子(rhβ-NGF),并对表达产物进行分离纯化和生物学活性鉴定。方法利用化学合成法合成经密码子突变后的人神经生长因子β亚基成熟肽段基因及前导肽基因;构建原核表达载体pET28a(+)+[rhβ-NGF],转化大肠杆菌株BL21(λDE3),获得基因工程菌;利用IPTG诱导rhβ-NGF在基因工程菌中表达并收集菌体;分离纯化包涵体蛋白,经体外复性及肠激酶切割去除前导肽后进一步通过镍柱亲和色谱获得rhβ-NGF;通过PC12细胞存活法检测rhβ-NGF的活性。结果构建的基因工程菌能大量表达包涵体蛋白,体外稀释复性后获得的重组蛋白经SDS-PAGE电泳检测其纯度大于95%,Western blot检测其为目标蛋白;重组蛋白经肠激酶切割及进一步分离纯化后得到的目的蛋白经SDS-PAGE电泳检测为单一条带,纯度大于99%;经Western blot鉴定其为rhβ-NGF;生物学活性检测结果显示其比活性约为500 000 u·mg-1。结论通过优化设计密码子,建立重组人神经生长因子大肠杆菌表达系统,并实现其在大肠杆菌中的高水平表达。 展开更多

关键词 大肠杆菌表达系统 密码子优化 前导肽 镍柱亲和色谱

原文传递

基因工程菌Escherichia coli BL21/pET-pel重组果胶酶的纯化及酶学性质 被引量：2

7

作者 徐伟 姚晓静 付大伟 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第23期245-248,共4页

采用超声波破碎法、镍离子亲合层析柱法,纯化重组菌Escherichia coli BL21/p ET-pel表达的胞内重组果胶酶,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide pelelectrophoresis,SDSPAGE)检测,研究纯化的... 采用超声波破碎法、镍离子亲合层析柱法,纯化重组菌Escherichia coli BL21/p ET-pel表达的胞内重组果胶酶,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide pelelectrophoresis,SDSPAGE)检测,研究纯化的重组果胶酶酶学性质。结果表明:重组果胶酶纯化倍数为1.71,回收率为88.5%,分子质量约为44 k D。最适p H值为9.0~9.5,在p H 7.0~10.0之间催化性质较稳定;最适作用温度范围为45~55℃,在60℃下保温30 min还剩余40%的酶活力;在离子浓度为1 mmol/L时,Ca2+和Co2+对该酶有较强的促进作用,而Fe2+则对其有较强的抑制作用。 展开更多

关键词 重组果胶酶 胞内酶 镍离子亲合层析 酶学性质

下载PDF 职称材料

胱抑素C原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化 被引量：1

8

作者 唐红卫 刘一凡 +4 位作者 孙禅 端永艳 李迪 李绵洋 王成彬 《解放军医学院学报》 CAS 2013年第10期1055-1058,共4页

目的构建胱抑素C(cystatin C,Cys-C)原核表达载体并表达、纯化、鉴定目的蛋白。方法根据GeneBank报道的Cys-C基因序列,采用RT-PCR技术从人胚肾细胞系HEK293中获得Cys-C的cDNA序列,经PCR、酶切及测序确认最终获得重组载体pET-30a(+)-CysC... 目的构建胱抑素C(cystatin C,Cys-C)原核表达载体并表达、纯化、鉴定目的蛋白。方法根据GeneBank报道的Cys-C基因序列,采用RT-PCR技术从人胚肾细胞系HEK293中获得Cys-C的cDNA序列,经PCR、酶切及测序确认最终获得重组载体pET-30a(+)-CysC,转化大肠埃希菌Rosetta,通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-Dthiogalac-topyranoside,IPTG)诱导表达、经镍柱亲和层析法纯化获得Cys-C融合蛋白。结果序列分析表明,人Cys-C基因成熟肽编码区编码122个氨基酸;与GeneBank(NM-000099.2)中已报道的序列有100%的同源性。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和ELISA分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的20%,重组蛋白相对分子质量约为20 000,经Ni2+-NTA agarose纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带并与商品化的人Cys-C单抗呈特异性反应。结论在大肠埃希菌中获得了Cys-C的表达,并经镍柱亲和层析得到较纯的胱抑素。 展开更多

关键词 胱抑素C 基因表达 大肠埃希菌 镍柱亲和层析

下载PDF 职称材料

小菜蛾溶菌酶Pxlys的基因克隆及其重组蛋白的抗菌活性分析 被引量：1

9

作者 宁燕夏 苏月华 杨梅 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第7期781-789,共9页

【目的】本研究旨在通过研究小菜蛾Plutella xylostella溶菌酶的功能,进一步认识小菜蛾的免疫防御机理,为小菜蛾的生物防治提供新的思路。【方法】利用RACE技术克隆小菜蛾溶菌酶基因。构建原核表达载体pET-29a-Pxlys,利用原核表达系统... 【目的】本研究旨在通过研究小菜蛾Plutella xylostella溶菌酶的功能,进一步认识小菜蛾的免疫防御机理,为小菜蛾的生物防治提供新的思路。【方法】利用RACE技术克隆小菜蛾溶菌酶基因。构建原核表达载体pET-29a-Pxlys,利用原核表达系统表达并用镍柱亲和层析纯化重组蛋白Pxlys。利用牛津杯法检测重组蛋白Pxlys对停滞棒杆菌Corynebacterium stationis、藤黄微球菌Micrococcus luteus、金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus、大肠杆菌Escherichia coli、志贺氏菌Shigella sp.、沙门氏菌Salmonella sp.和苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis的抑菌活性,并利用扫描电子显微镜观察重组蛋白Pxlys对停滞棒杆菌和大肠杆菌的溶菌特征。【结果】克隆获得开放阅读框长423 bp的小菜蛾溶菌酶基因Pxlys(GenBank登录号:MN702780)序列,它编码140个氨基酸,相对分子质量为15.79 kD。抑菌试验表明,重组蛋白Pxlys不仅对革兰氏阳性细菌的停滞棒杆菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑菌活性(抑菌圈直径分别为20.0±1.1,19.0±0.5和16.5±0.5 mm),而且对革兰氏阴性细菌大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌也有抑菌活性(抑菌圈直径分别为16.3±0.5,15.0±0.5和14.0±1.1 mm),重组蛋白Pxlys对革兰氏阳性细菌比对革兰氏阴性细菌表现出更强的抑菌活性。另外,重组蛋白Pxlys还表现出对苏云金芽胞杆菌的抑菌活性。扫描电子显微镜下,经重组蛋白Pxlys处理过的停滞棒杆菌和大肠杆菌的溶菌特征不同。【结论】Pxlys具有广谱的抗微生物活性,其对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的抑菌机理可能存在不同。研究结果为深入研究小菜蛾免疫防御系统提供基础。 展开更多

关键词 小菜蛾 溶菌酶 RACE技术 镍柱亲和层析 牛津杯法 抗微生物活性

下载PDF 职称材料

人防御素hβD-3基因在大肠埃希菌中的融合表达 被引量：1

10

作者 孔杰 曾珍 +2 位作者 吴志伟 褚梦 赵亚华 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期493-497,共5页

研究了人类防御素hβD-3基因在大肠埃希菌细胞中的融合表达,采用pET-32a(+)载体在BL21(DE3)溶原菌中进行了F-βD-3蛋白的融合表达.结果表明,F-βD-3蛋白的表达量达到127.23μg/mL,融合蛋白经镍柱亲和层析与肠激酶酶切后,最终得到hβD-3... 研究了人类防御素hβD-3基因在大肠埃希菌细胞中的融合表达,采用pET-32a(+)载体在BL21(DE3)溶原菌中进行了F-βD-3蛋白的融合表达.结果表明,F-βD-3蛋白的表达量达到127.23μg/mL,融合蛋白经镍柱亲和层析与肠激酶酶切后,最终得到hβD-3蛋白的量为18.17μg/mL.经对大肠埃希菌K12D31的抑菌试验鉴定,肠激酶酶切后产物为有抑菌活性的重组hβD-3蛋白. 展开更多

关键词 人Β防御素3 融合基因表达 镍柱亲和层析

下载PDF 职称材料

抗肿瘤多肽Peptide30的纯化及抗肿瘤活性研究

11

作者 郑天虎 刘兴汉 +1 位作者 赵玲 王立新 《哈尔滨医科大学学报》 CAS 2020年第2期121-124,共4页

目的采用镍离子亲和层析从含有PTYB21-His-p30质粒的菌株中提取抗肿瘤多肽30肽,即Peptide30,检测Peptide30对肿瘤细胞和实体瘤的抗肿瘤活性。方法培养PTYB21菌株,IPTG诱导表达,经超声离心等方法后,取其上清(含30肽融合蛋白),DTT裂解目... 目的采用镍离子亲和层析从含有PTYB21-His-p30质粒的菌株中提取抗肿瘤多肽30肽,即Peptide30,检测Peptide30对肿瘤细胞和实体瘤的抗肿瘤活性。方法培养PTYB21菌株,IPTG诱导表达,经超声离心等方法后,取其上清(含30肽融合蛋白),DTT裂解目的蛋白后,经镍柱层析分离Peptide30肽后G25凝胶过滤层析除盐,然后检测Peptide30肽浓度和纯度,经细胞克隆形成实验和动物实验检测Peptide30的抗肿瘤活性。结果经镍柱亲和层析纯化的Peptide30浓度为:451μg/mL,纯度为:95.5%;细胞克隆形成实验结果表明Peptide30肽能够显著降低U251胶质瘤细胞和HGC27胃癌细胞的存活率,动物实验结果显示:Peptide30的抑瘤率达到63.49%,高于41肽抑瘤率。结论加入His标签的PTYB21-30肽质粒转入大肠埃希菌Rosetta(DE3) pLysSS后,经诱导表达及镍柱亲和层析纯化后能够得到高纯度的抗肿瘤多肽Peptide30,该Peptide30具有较好的体外、体内抗肿瘤活性。 展开更多

关键词 抗肿瘤多肽 蛋白质纯化 镍离子亲和层析 抗肿瘤活性

原文传递

条斑紫菜TPS基因0.6Kb片段的原核表达及抗血清的制备

12

作者 孟庆芹 王斌 +2 位作者 徐丽娟 孙牧君 郭宝太 《青岛农业大学学报（自然科学版）》 2013年第4期295-299,共5页

以pET22b为起始载体,构建了条斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因(PyTPS)0.6Kb片段的原核表达载体,并命名为pET22b-PyTPS0.6。重组菌BL21(pET22b-PyTPS0.6)经ITPG诱导后,SDS-PAGE分析显示菌体总蛋白的电泳图谱上有分子量约为23kDa的特异性蛋... 以pET22b为起始载体,构建了条斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因(PyTPS)0.6Kb片段的原核表达载体,并命名为pET22b-PyTPS0.6。重组菌BL21(pET22b-PyTPS0.6)经ITPG诱导后,SDS-PAGE分析显示菌体总蛋白的电泳图谱上有分子量约为23kDa的特异性蛋白条带,即PyTPS基因0.6Kb片段得到了原核表达。用溶菌酶裂解细菌提取包涵体,再利用镍离子亲和层析柱从包涵体中纯化出TPS重组蛋白。用获得的高纯度重组蛋白作抗原免疫家兔获得了抗血清,间接ELISA测定显示一份抗血清的效价为1∶16000,另一份为1∶32000。本研究制备的抗血清为进行转基因植物中PyTPS基因翻译产物的免疫学检测奠定了基础。 展开更多

关键词 PyTPS基因 原核表达 镍离子亲和层析 重组蛋白 抗血清

下载PDF 职称材料

人肝再生增强因子真核表达及其对顺铂诱导肝癌细胞凋亡的影响

13

作者 郑钰 李小芳 +1 位作者 孙航 刘杞 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期1065-1070,共6页

目的:构建人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,h ALR)15k D亚型的真核表达系统,并探索ALR对顺铂(Cisplatin,DDP)诱导的人肝癌细胞株QGY凋亡的影响。方法:用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法和基... 目的:构建人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,h ALR)15k D亚型的真核表达系统,并探索ALR对顺铂(Cisplatin,DDP)诱导的人肝癌细胞株QGY凋亡的影响。方法:用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法和基因重组技术,从重组质粒p PIC9K-rh ALR中扩增出编码rh ALR基因片段,将其克隆入p PICZαA质粒中构建重组质粒p PICZα-A-rh ALR。重组质粒SacⅠ酶切线性化后电转入酵母GS115中,并在1%的甲醇诱导下表达。表达上清蛋白经Western blot(ALR多克隆抗体和His-tag标签抗体)鉴定和镍柱亲和层析纯化。MTS试剂检测rh ALR体外对人肝癌细胞(Hep G2、QGY)的促增殖活性,及流式细胞仪检测rh ALR在顺铂诱导QGY细胞凋亡中的抗凋亡作用。结果:PCR、双酶切、DNA测序均鉴定重组质粒构建与预期一致。分泌表达的rh ALR约占上清总蛋白的70%,目的分子量约17 k D,Western blot均可见单一条带。纯化后的rh ALR对Hep G2和QGY的体外促增殖作用呈浓度依赖性增强(Hep G2组:F=246.729,P=0.000;QGY组:F=246.004,P=0.000),且在QGY细胞顺铂诱导凋亡时也发挥着浓度梯度式抗凋亡作用(F=101.061,P=0.000)。结论:成功构建高效分泌表达rh ALR的p PICZα-A-rh ALR GS115真核表达系统;体外实验证实rh ALR对顺铂诱导人肝癌细胞有呈浓度依赖性的抗凋亡作用。 展开更多

关键词 肝再生增强因子 酵母表达 生物学活性 镍柱亲和层析

下载PDF 职称材料

新型镍离子亲和色谱介质的制备及其性能考察

14

作者 徐莉莉 陈革豫 +5 位作者 张腾 张忠旗 韩广 李乾 赵金礼 刘建利 《色谱》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期232-239,共8页

以氯甲基化聚苯乙烯交联微球(氯球)为载体基质、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)催化,将合成的Lys(Boc)-OEt、氯乙酸乙酯连接到微球上。经水解使羧基裸露,与Ni^(2+)螯合,制得新型镍离子亲和色谱介质。将其应用于Hi... 以氯甲基化聚苯乙烯交联微球(氯球)为载体基质、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)催化,将合成的Lys(Boc)-OEt、氯乙酸乙酯连接到微球上。经水解使羧基裸露,与Ni^(2+)螯合,制得新型镍离子亲和色谱介质。将其应用于His-Lys-Tyr三肽及Phe-His-Thr三肽纯化研究。以不含组氨酸的六肽作为杂质模型,用所制备的镍离子亲和介质进行分离。结果表明,所制备的镍离子亲和介质对两个含组氨酸的三肽具有很好的亲和作用,并实现了与不含组氨酸六肽的分离。 展开更多

关键词 氯甲基化聚苯乙烯交联微球 镍离子亲和色谱介质 含组氨酸短肽

下载PDF 职称材料