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内含子序列对CART基因转录调控作用的初步研究 被引量：6
1
作者 张静 王思涵 +7 位作者 杨印祥 姚海雷 陈琳 吕洋 南雪 岳文 李艳华 裴雪涛 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期272-277,共6页
目的研究内含子序列对可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript,CART)基因转录水平的调控作用。方法分别以HeLa细胞和人源性间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的基因组DNA为模板,PCR扩增CART内... 目的研究内含子序列对可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript,CART)基因转录水平的调控作用。方法分别以HeLa细胞和人源性间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的基因组DNA为模板,PCR扩增CART内含子Ⅰ(Intron)、CART截短内含子Ⅰ(去除NRSE基序,NRSEnonIntron)序列,克隆入载体pGL3-Basic-CART32,构建pGL3-Basic-CART32-Intron、pGL3-Basic-CART32-NRSEnon Intron荧光素酶报告载体。经质粒酶切和DNA测序进行鉴定。将报告载体瞬时转染入NT2/CloneD1细胞系,进行荧光素酶活性的分析。取1×107NT2/CloneD1细胞,采用抗NRSF和抗IgG抗体进行染色质免疫共沉淀,分析NRSF与CART内含子区NRSE的体内结合情况。结果构建的pGL3-Basic-CART32-Intron、pGL3-Basic-CART32-NRSEnonIntron报告载体经酶切和测序鉴定正确。pGL3-Basic-CART32-Intron荧光素酶活性相对pGL3-Basic-CART32下调57.9%(P<0.05),pGL3-Basic-CART32-NRSEnon Intron相对pGL3-Basic-CART32-Intron上调53.8%(P<0.05)。在NT2/CloneD1细胞中,CART内含子区NRSE调控元件能与NRSF蛋白结合。结论研究结果表明,CART内含子序列对CART基因转录发挥负调控作用,内含子中的NRSE序列参与介导了其对CART基因的转录负调控作用。 展开更多
关键词 可卡因-苯丙胺调节转录肽 内含子 转录调控 神经元限制性沉默因子 神经元限制性沉默元件
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神经元抑制性沉默元件双链RNA慢病毒载体的构建与鉴定 被引量：1
2
作者 李宏图 刘晓玉 庞希宁 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期760-764,803,共6页
目的构建神经元抑制性沉默元件(RE-1/NRSE)双链RNA的慢病毒载体。方法根据RE-1/NRSE序列合成靶序列的寡核苷酸序列,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后的pGC-LV载体连接产生L-smRE-1/NRSE慢病毒载体,采用PCR和测序对阳性克隆进... 目的构建神经元抑制性沉默元件(RE-1/NRSE)双链RNA的慢病毒载体。方法根据RE-1/NRSE序列合成靶序列的寡核苷酸序列,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后的pGC-LV载体连接产生L-smRE-1/NRSE慢病毒载体,采用PCR和测序对阳性克隆进行鉴定。用L-smRE-1/NRSE和包装质粒pHelper 1.0、pHelper2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,在倒置荧光显微镜下观察293T细胞中绿色荧光蛋白的表达量,并计算病毒滴度,初步观察其对大鼠间充质干细胞的转染效率。结果PCR和测序证实,构建出了RE-1/NRSE双链RNA的慢病毒载体L-smNRSE/RE-1。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为4×108TU/ml。慢病毒颗粒能稳定转染大鼠间充质干细胞,当感染复数为80时,感染效率达100%。结论成功构建了RE-1/NRSE dsRNA的慢病毒表达载体。 展开更多
关键词 神经元抑制性沉默元件 双链RNA 慢病毒载体
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