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弓形虫微线体蛋白6,7,8与宿主Spata3,Dkk2蛋白相互作用的研究 被引量:2
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作者 刘卿 李法财 +3 位作者 杨文彬 刘国华 赵权 朱兴全 《经济动物学报》 CAS 2017年第2期68-74,共7页
为了研究弓形虫微线体蛋白6(MIC6)、7(MIC7)及8(MIC8)是否与宿主精子生成相关蛋白3(Spata3)和Dickkopf相关蛋白2(Dkk2)互作,首先从弓形虫RH虫株cDNA中扩增了弓形虫MIC6、MIC7及MIC8基因,并从小鼠cDNA中扩增了Spata3和Dkk2基因。然后分... 为了研究弓形虫微线体蛋白6(MIC6)、7(MIC7)及8(MIC8)是否与宿主精子生成相关蛋白3(Spata3)和Dickkopf相关蛋白2(Dkk2)互作,首先从弓形虫RH虫株cDNA中扩增了弓形虫MIC6、MIC7及MIC8基因,并从小鼠cDNA中扩增了Spata3和Dkk2基因。然后分别构建pGADT7-MIC6、pGADT7-MIC7和pGADT7-MIC8捕获载体及pGBKT7-Spata3和pGBKT-Dkk2诱饵载体。利用Clon Tech公司的MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid系统,将诱饵载体分别转化Y2HGold酵母菌,将捕获载体分别转化Y187酵母菌,最后通过酵母点对点验证分析弓形虫MIC6、MIC7和MIC8蛋白是否与宿主Spata3和Dkk2蛋白互作。结果表明:在酵母双杂交系统里MIC7和MIC8蛋白分别能够与宿主Spata3和Dkk2蛋白互作,而MIC6不能够与宿主Spata3和Dkk2蛋白互作。 展开更多
关键词 弓形虫 微线体蛋白 蛋白互作 Spata3 Dkk2
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肠艾美耳球虫重组微线蛋白2对家兔免疫保护效果评价
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作者 陈浩 郝哥 +7 位作者 蒲家艳 肖洁 熊常明 何维 朱煜华 许力文 姜庆 杨光友 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期2588-2598,共11页
本研究旨在评价肠艾美耳球虫重组微线蛋白2(rEiMIC2)对兔的免疫保护效果,为肠艾美耳球虫重组亚单位疫苗的研究提供参考。在肠艾美耳球虫转录组数据中筛选出EiMIC2基因,进行克隆、原核表达和蛋白纯化,并采用免疫印迹检测重组蛋白的免疫... 本研究旨在评价肠艾美耳球虫重组微线蛋白2(rEiMIC2)对兔的免疫保护效果,为肠艾美耳球虫重组亚单位疫苗的研究提供参考。在肠艾美耳球虫转录组数据中筛选出EiMIC2基因,进行克隆、原核表达和蛋白纯化,并采用免疫印迹检测重组蛋白的免疫反应性。将35日龄无球虫新西兰幼兔32只随机分为4组(未免疫未攻虫组、未免疫攻虫组、pET-32a(+)载体组和rEiMIC2免疫组),每组8只,未免疫未攻虫组和未免疫攻虫组每只颈部皮下注射1 mL无菌PBS,pET-32a(+)载体组和rEiMIC2免疫组每只分别接种100μg pET-32a(+)载体蛋白、rEiMIC2,首免后2周进行二免。二免14 d后,除去未免疫未攻虫组,其余3组每只新西兰兔口服接种5×10^(4)个肠艾美耳球虫孢子化卵囊;攻虫14 d后安乐死所有新西兰兔。重组蛋白免疫兔后通过观察临床症状、肠道病变、测定兔的相对增重率、卵囊减少率、抗球虫指数(ACI)值和料肉比以及检测血清中特异性IgG、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ综合评价rEiMIC2的免疫保护效果。结果显示,EiMIC2基因开放阅读框长度为1 605 bp,编码的蛋白分子质量约为57.68 ku。免疫印迹显示rEiMIC2能够被阳性血清所识别,表明其具有良好的免疫反应性。免疫保护试验显示:攻虫后各组幼兔陆续出现精神沉郁和腹泻的症状,未免疫攻虫组和rEiMIC2免疫组各有1只兔死亡;rEiMIC2免疫组相对增重率为73.97%,卵囊减少率为69.98%,ACI值为136.97,料肉比为3.98∶1,与未免疫攻虫组差异显著(P<0.05);rEiMIC2免疫组肠道病变与未免疫攻虫组相比较轻,血清中特异性IgG水平显著高于未免疫攻虫组(P<0.05)。综上,rEiMIC2免疫兔后,能有效减少卵囊排出和增重损失,减轻肠道损伤,具有一定的保护效果。 展开更多
关键词 肠艾美耳球虫 微线蛋白2 免疫保护
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不同来源柔嫩艾美耳球虫虫株微线体3基因的克隆和序列分析
3
作者 王新秋 高艳 +4 位作者 吴林林 刘少芬 刘丽丹 翁亚彪 林瑞庆 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第6期31-37,共7页
以8株不同来源柔嫩艾美耳球虫分离株为研究对象,对其艾美耳球虫微线体3(Eimeria tenella microneme protein,EtMIC3)基因进行了RT-PCR扩增、测序及序列分析,并与GenBank上已发表的柔嫩艾美尔球虫相关序列进行比较,研究Et-MIC3基因遗传... 以8株不同来源柔嫩艾美耳球虫分离株为研究对象,对其艾美耳球虫微线体3(Eimeria tenella microneme protein,EtMIC3)基因进行了RT-PCR扩增、测序及序列分析,并与GenBank上已发表的柔嫩艾美尔球虫相关序列进行比较,研究Et-MIC3基因遗传变异情况。结果获得2976bp的目的片段,各株与FJ374765.1CDs的序列相似性在99.8%~99.9%之间,各株之间的序列相似性为99.9%~100.0%,各株编码的氨基酸序列与GenBank登记的柔嫩艾美耳球虫EtMIC3蛋白(ACJ11219)相似性在99.6%~99.9%之间,不同地理来源或耐药性虫株之间没有明显差异。本研究首次对中国EtMIC3基因进行了序列分析,结果显示不同来源株EtMIC3基因高度保守,为有效的疫苗候选因子,为进一步进行柔嫩艾美耳球虫基因工程疫苗构建的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 柔嫩艾美球虫 RT-PCR 微线体3 序列分析
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荧光蛋白报告载体观察刚地弓形虫SAGl、MIC3、ROP2鸡尾酒DNA疫苗的表达及其免疫原性的研究 被引量:6
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作者 王燕娟 曹建平 +2 位作者 孙雅雯 徐馀信 沈玉娟 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期368-371,376,共5页
目的构建能同时表达多个基因的刚地弓形虫DNA鸡尾酒疫苗并初步观察其免疫原性。方法从基因组DNA扩增刚地弓形虫表面抗原(surface antigen,SAG)、微线体蛋白(microneme,MIC)和棒状体蛋白(rhoptry protein,ROP)基因片段,克隆到真核荧光表... 目的构建能同时表达多个基因的刚地弓形虫DNA鸡尾酒疫苗并初步观察其免疫原性。方法从基因组DNA扩增刚地弓形虫表面抗原(surface antigen,SAG)、微线体蛋白(microneme,MIC)和棒状体蛋白(rhoptry protein,ROP)基因片段,克隆到真核荧光表达载体pShuttle-CMV-MCS-EF1α-Am Cyan,pLVX-IRES-Zsgreen及pLVX-IRES-rfp中,构建pShuttle-SAG1,pLVX-Zsgreen-MIC3和pLVX-rfp-ROP2表达质粒。通过聚乙烯亚胺法用混合质粒转染293F细胞48 h,荧光显微镜下观察3个基因的表达情况。将30只C57BL/6雄性小鼠随机分为A、B、C组,分别肌内注射生理盐水(50μl)、pShuttle+pLVX-Zsgreen+pLVX-rfp混合空质粒(2μg/μl,各17μl)、pShuttle-SAG1+pLVX-Zsgreen-MIC3+pLVX-rfp-ROP2混合重组质粒(2μg/μl,各17μl)。免疫28 d后,ELISA检测血清抗刚地弓形虫IgG抗体水平,初步评价该疫苗的免疫原性。结果从刚地弓形虫基因组成功扩增出1、1.1及1.7 kb的SAG1、MIC3和ROP2序列。成功构建了pShuttle-SAG1、pLVX-Zsgreen-MIC3和pLVX-rfp-ROP2真核荧光表达质粒,转染293F细胞后观察到相应的蓝、绿、红报告荧光。免疫小鼠后28 d,ELISA测得A、B、C组IgG抗体的吸光度(A450值)分别为(0.620±0.029)、(0.741±0.040)、(1.561±0.131),C组显著高于A、B组(P<0.01)。结论刚地弓形虫SAG1、MIC3和ROP2基因混合重组质粒组成的DNA鸡尾酒疫苗能诱导小鼠产生良好的免疫原性,且多个荧光蛋白真核表达载体能够较好地指示目的基因的表达。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 基因重组 表面抗原 微线体蛋白 棒状体蛋白 鸡尾酒疫苗 免疫原性
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载体介导的艾美耳球虫微线体蛋白疫苗的研制现状
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作者 李文桂 陈雅棠 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2022年第7期848-851,共4页
艾美耳球虫是鸡球虫病的病原体,疫苗研发是当前的热点领域之一。微线体蛋白免疫原性良好,本研究就卡介苗(rBCG-AMA1/RB)、乳酸乳球菌(rLL-AMA1)、植物乳杆菌(rLp-EtMIC1/EtMIC2/TA4-AMA1)、鼠伤寒沙门氏菌(rSt-5401/EnMIC2/MIC5)、根癌... 艾美耳球虫是鸡球虫病的病原体,疫苗研发是当前的热点领域之一。微线体蛋白免疫原性良好,本研究就卡介苗(rBCG-AMA1/RB)、乳酸乳球菌(rLL-AMA1)、植物乳杆菌(rLp-EtMIC1/EtMIC2/TA4-AMA1)、鼠伤寒沙门氏菌(rSt-5401/EnMIC2/MIC5)、根癌农杆菌(rAt-MIC2)、酵母(rPP-EtMIC2)和鸡痘病毒(rFPV-RB)等载体介导的艾美耳球虫微线体蛋白疫苗的研究进展进行综述。 展开更多
关键词 艾美耳球虫 微线体蛋白 疫苗 综述
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弓形虫GJS株pcDNA3-MIC3核酸疫苗的研究 被引量:7
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作者 张燕丽 曹丽艳 +5 位作者 芦赟 蔡志杰 王艳华 付宝权 李文卉 张德林 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期1299-1302,共4页
根据GenBank中MIC3基因序列设计1对引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因片段,克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴... 根据GenBank中MIC3基因序列设计1对引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因片段,克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定。重组质粒pcDNA3-MIC3肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测血清特异抗体;经腹腔攻击感染弓形虫GJS株速殖子,观察小鼠的生存时间。结果成功构建了pcD-NA3-MIC3质粒;免疫组小鼠血清检测到特异性抗体;攻击感染后免疫组小鼠平均存活时间较对照组明显延长。表明该核酸疫苗具有较好的免疫原性,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白3(MIC3) 核酸疫苗 免疫保护
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刚地弓形虫GJS株微线体蛋白3基因真核表达质粒的构建及在BHK-21细胞中的表达 被引量:9
7
作者 张燕丽 曹丽艳 +5 位作者 芦赟 苟惠天 王艳华 付宝权 李文卉 张德林 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期125-129,共5页
采用PCR技术从刚地弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因,并克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定。将重组质粒转染BHK-21细胞。间接... 采用PCR技术从刚地弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因,并克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定。将重组质粒转染BHK-21细胞。间接免疫荧光染色证明,质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达。Western-blot分析证实,细胞裂解液及上清样品中有1条约39.2 ku的条带,可被山羊抗刚地弓形虫超免疫血清所识别,大小与预测值相符。表明,真核表达质粒pcDNA3-MIC3中的MIC3基因在BHK-21细胞中获得表达且表达产物具有抗原性。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白3 基因克隆 真核表达
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斯氏艾美耳球虫MIC-5与兔IL-15基因在真核细胞中的共表达 被引量:7
8
作者 孟庆玲 乔军 +3 位作者 才学鹏 田广孚 闫鸿斌 骆学农 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第19期4096-4101,共6页
【目的】构建能在真核细胞中共表达斯氏艾美耳球虫微线蛋白5(MIC-5)和兔IL-15重组载体,为进一步研究抗斯氏艾美耳球虫的免疫调节性DNA疫苗奠定基础。【方法】将斯氏艾美耳球虫MIC-5和兔IL-15基因,克隆到真核双表达载体pBudce4.1中,应用... 【目的】构建能在真核细胞中共表达斯氏艾美耳球虫微线蛋白5(MIC-5)和兔IL-15重组载体,为进一步研究抗斯氏艾美耳球虫的免疫调节性DNA疫苗奠定基础。【方法】将斯氏艾美耳球虫MIC-5和兔IL-15基因,克隆到真核双表达载体pBudce4.1中,应用脂质体介导法将构建的重组质粒pB-MIC-5-IL-15转染BHK-21细胞。在转染后,用RT-PCR法和间接免疫荧光试验(IFA)分别检测MIC-5和IL-15基因在BHK-21细胞中的转录和表达情况。【结果】在重组质粒pB-MIC-5-IL-15转染BHK-21细胞24 h后即可检测到MIC-5、IL-15基因进行了转录;在转染36、48、72h后,MIC-5和IL-15基因可同时在BHK-21细胞中表达。【结论】成功构建了含有斯氏艾美耳球虫MIC-5和兔IL-15基因的重组载体,实现了两种基因在真核细胞中的共表达,为抗斯氏艾美耳球虫的免疫调节性DNA疫苗研制奠定了基础。 展开更多
关键词 斯氏艾美耳球虫 MIC-5 兔IL-15 共表达
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鸡毒害艾美耳球虫LZ株MIC5基因的重组表达及其表达产物的抗原性分析 被引量:5
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作者 刘红霞 贾万忠 +4 位作者 郭爱疆 张少华 闫鸿斌 岳城 才学鹏 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期1575-1580,共6页
根据已发表的鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)微线蛋白5(Microneme protein 5,MIC-5)基因的核苷酸序列设计引物,以毒害艾美耳球虫(E.necatrix)DNA为模板,利用PCR方法扩增出EnMIC-5部分基因片段。将基因片段与pMD18-T simple载体连接... 根据已发表的鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)微线蛋白5(Microneme protein 5,MIC-5)基因的核苷酸序列设计引物,以毒害艾美耳球虫(E.necatrix)DNA为模板,利用PCR方法扩增出EnMIC-5部分基因片段。将基因片段与pMD18-T simple载体连接,重组质粒测序结果表明EnMIC-5基因大小为1 470 bp,编码490个氨基酸。EnMIC-5与pET-28a(+)载体构建重组表达质粒pET-EnMIC-5,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。经SDS-PAGE检测,表达产物为相对分子质量约57.5 ku的融合蛋白。Western-blot分析结果表明表达蛋白可被鸡感染E.necatrix阳性血清识别。用重组蛋白免疫昆明鼠,一免后15 d即可检测到相应抗体,且抗体在三免后40 d仍维持较高水平,证实重组蛋白具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体。 展开更多
关键词 毒害艾美耳球虫 微线蛋白5 基因克隆 重组表达 免疫原性
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柔嫩艾美耳球虫EtMIC2的酵母表面展示 被引量:5
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作者 孙慧 刘卿 +7 位作者 张杰 陈佩佩 王龙江 王甜甜 王方昆 李宏梅 肖一红 赵孝民 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期231-235,共5页
利用酿酒酵母表面展示系统展示柔嫩艾美耳球虫微线蛋白基因EtMIC2,为下一步研制活载体疫苗奠定基础。参照GenBank中柔嫩艾美耳球虫EtMIC2基因序列设计引物,以柔嫩艾美耳球虫的RNA为模板,利用RT-PCR扩增得到预期长度的产物,双酶切连接到... 利用酿酒酵母表面展示系统展示柔嫩艾美耳球虫微线蛋白基因EtMIC2,为下一步研制活载体疫苗奠定基础。参照GenBank中柔嫩艾美耳球虫EtMIC2基因序列设计引物,以柔嫩艾美耳球虫的RNA为模板,利用RT-PCR扩增得到预期长度的产物,双酶切连接到酿酒酵母表面展示的载体pCTCON2,转化大肠杆菌TOP10,提取阳性质粒转化酿酒酵母菌株EBY100,诱导表达后,用抗EtMIC2蛋白质特异性抗体,做间接免疫荧光(IFA)检测EtMIC2蛋白的表达。结果显示,EtMIC2成功展示到酵母细胞表面,测得最佳诱导时间为48h。 展开更多
关键词 柔嫩艾美耳球虫 酵母表面展示 微线蛋白-2
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柔嫩艾美耳球虫LZ株MIC-5基因的克隆与表达 被引量:3
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作者 孟庆玲 乔军 +3 位作者 才学鹏 景志忠 田广孚 闫鸿斌 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 2007年第6期8-12,共5页
提取柔嫩艾美耳球虫兰州株孢子化卵囊总RNA,运用RT-PCR技术扩增&MIC-5基因片段进行测序,并克隆入大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达.结果表明,该基因片段长918bp,编码306个氨基酸.与GenBank报道的柔嫩艾美耳球虫Houghton株MI... 提取柔嫩艾美耳球虫兰州株孢子化卵囊总RNA,运用RT-PCR技术扩增&MIC-5基因片段进行测序,并克隆入大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达.结果表明,该基因片段长918bp,编码306个氨基酸.与GenBank报道的柔嫩艾美耳球虫Houghton株MIC-5基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列同源性为99.2%和99.6%.在推导的MIC-5氨基酸序列中,第15~89、90~160、173~242和245~306位保守的cys残基形成4个Apple样结构域(A-domain).推测该蛋白可能在虫体与宿主细胞的黏附中起重要作用.转化重组质粒pETMIC-5的BL21(DE3)经IPTG诱导后,SDS—PAGE和western blot分析证实目的蛋白成功表达,重组蛋白的表达量可占菌体蛋白的15.2%. 展开更多
关键词 柔嫩艾美耳球虫 微线蛋白5基因 克隆 表达
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重组刚地弓形虫MIC8 CTD蛋白及其多克隆抗体的制备 被引量:5
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作者 郑斌 尹志奎 +1 位作者 何蔼 詹希美 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2011年第8期581-584,共4页
目的制备弓形虫微线体蛋白8羧基端胞质尾(MIC8 CTD)重组蛋白及其多克隆抗体。方法以弓形虫基因组为模板,PCR扩增MIC8 CTD基因片段,构建MIC8 CTD/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC8CTD融合蛋白;用纯化的融合蛋白加免疫佐剂免... 目的制备弓形虫微线体蛋白8羧基端胞质尾(MIC8 CTD)重组蛋白及其多克隆抗体。方法以弓形虫基因组为模板,PCR扩增MIC8 CTD基因片段,构建MIC8 CTD/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC8CTD融合蛋白;用纯化的融合蛋白加免疫佐剂免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,亲和层析纯化并分析抗体的特异性及效价。结果构建了MIC8 CTD原核表达系统,表达并纯化了GST-MIC8 CTD融合蛋白;获得了抗该蛋白的兔源性抗血清,纯化后的多克隆抗体能特异识别MIC8 CTD,ELISA测定抗体效价为1∶8 000。结论制备的GST-MIC8 CTD融合蛋白具有免疫原性,用该抗原免疫动物可获得高效价的多克隆抗体。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白8 羧基末端胞质尾 多克隆抗体
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抗弓形虫MIC3单抗的制备及其在速殖子免疫荧光观察中的应用 被引量:4
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作者 刘钊 禹海杰 +2 位作者 卓洵辉 周前进 杜爱芳 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期1030-1033,共4页
为开展弓形虫速殖子阶段蛋白表达和定位的相关研究,利用弓形虫重组微线体蛋白3(MIC3)抗原研制单克隆抗体,筛选出适合在虫体内用免疫荧光观察该蛋白的单抗分泌株,建立了弓形虫间接免疫荧光观察方法。结果显示,经4轮亚克隆后得到3株稳定... 为开展弓形虫速殖子阶段蛋白表达和定位的相关研究,利用弓形虫重组微线体蛋白3(MIC3)抗原研制单克隆抗体,筛选出适合在虫体内用免疫荧光观察该蛋白的单抗分泌株,建立了弓形虫间接免疫荧光观察方法。结果显示,经4轮亚克隆后得到3株稳定分泌抗MIC3单抗的分泌株:4G1、1G12和5D7;经测定,3株MIC3单抗4G1、1G12和5D7的亚型分别为IgG1、IgG2b、IgG2b,效价分别为1∶3 200、1∶12 800、1∶1 600。筛选得到的2株MIC3单抗(4G1和1G12)可用于间接免疫荧光检测MIC3蛋白在虫体中的分布。通过弓形虫阳性感染猪血液样品推片的免疫荧光试验,验证了这3株单抗具有特异性。结果表明,研制的MIC3单抗和虫体荧光观察体系可用于速殖子MIC3蛋白在虫体表达定位和其他研究,也可作为其他速殖子抗原荧光观察的比较对象。 展开更多
关键词 弓形虫 微线体蛋白3 单克隆抗体 免疫荧光观察 蛋白表达定位
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弓形虫MIC2胞质尾段蛋白及其多克隆抗体的制备 被引量:4
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作者 尹志奎 郑斌 詹希美 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期45-48,共4页
目的:制备弓形虫微线体蛋白2胞质尾段(MIC2C)蛋白片段及其多克隆抗体。方法:以弓形虫cDNA文库为模板,PCR扩增135bp MIC2C基因片段,构建MIC2C/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC2C融合蛋白;用纯化的融合蛋白加免疫佐剂背部皮内... 目的:制备弓形虫微线体蛋白2胞质尾段(MIC2C)蛋白片段及其多克隆抗体。方法:以弓形虫cDNA文库为模板,PCR扩增135bp MIC2C基因片段,构建MIC2C/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC2C融合蛋白;用纯化的融合蛋白加免疫佐剂背部皮内注射免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,亲和层析纯化并分析抗体的效价。结果:构建了MIC2C原核表达系统,表达并纯化了GST-MIC2C融合蛋白,蛋白的浓度为3.07mg/ml;获得了抗该蛋白的兔源性抗血清,纯化后的多克隆抗体效价为1:16 000。结论:在体外制备并纯化了GST-MIC2C融合蛋白及其多克隆抗体,为后续弓形虫入侵机制的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白2 胞质尾 多克隆抗体
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重组刚地弓形虫微线料体蛋白MIC10的制备与特性分析 被引量:2
15
作者 周伟 宋丽君 +4 位作者 沈双 殷旭仁 许永良 刘茜 余传信 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第9期979-983,共5页
目的制备重组刚地弓形虫微线体蛋白10(MIC10),并对其免疫学特性进行分析。方法利用逆转录PCR(RT-PCR)技术从弓形虫总RNA中反转录制备第一链cDNA,再利用特异性引物从cDNA中扩增出编码MIC10的基因片段,构建重组表达质粒pET28a-MIC10,转化... 目的制备重组刚地弓形虫微线体蛋白10(MIC10),并对其免疫学特性进行分析。方法利用逆转录PCR(RT-PCR)技术从弓形虫总RNA中反转录制备第一链cDNA,再利用特异性引物从cDNA中扩增出编码MIC10的基因片段,构建重组表达质粒pET28a-MIC10,转化入大肠埃希菌BL21(DE3)后用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,通过镍螯合亲和层析法纯化重组MIC10蛋白。用纯化的重组蛋白免疫家兔,制备抗MIC10多克隆抗体,采用Western blot分析重组MIC10蛋白的免疫学特性。结果采用RT-PCR法从弓形虫cDNA中反转录扩增到长度约为416bp的特异性DNA,基因序列分析证实为编码MIC10的基因片段;制备的重组表达质粒pET28a-MIC10转化大肠埃希菌BL21(DE3)后经IPTG诱导,能表达重组MIC10蛋白;用纯化的重组MIC10蛋白免疫家兔,血清抗体效价达到1∶200 000以上。Western blot分析显示该抗体能识别弓形虫排泄分泌抗原中的天然MIC10分子而不识别弓形虫成虫抗原,证明MIC10为外分泌蛋白。结论制备了具有天然免疫原性的重组弓形虫MIC10蛋白,并证明该蛋白为外分泌蛋白。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白10 免疫原性 免疫诊断
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弓形虫微线体蛋白4的表达及其应用 被引量:2
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作者 王宁 薛俊欣 +1 位作者 李健 赵俊龙 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1782-1787,共6页
根据已发表的弓形虫微线体蛋白4(MIC4)序列进行生物信息学分析并设计引物扩增RH株中的目的基因,将扩增产物链接到pET-28a(+)载体并转化大肠杆菌感受态细胞进行诱导表达,用纯化后去除内毒素的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,通过监测抗体水平、W... 根据已发表的弓形虫微线体蛋白4(MIC4)序列进行生物信息学分析并设计引物扩增RH株中的目的基因,将扩增产物链接到pET-28a(+)载体并转化大肠杆菌感受态细胞进行诱导表达,用纯化后去除内毒素的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,通过监测抗体水平、Western blot和激光共聚焦方法鉴定其免疫原性并初步分析其生物学功能。结果显示,mic4基因ORF编码580个氨基酸残基,去除信号肽(25个氨基酸残基)后的PCR产物长度为1 686 bp,重组蛋白的理论相对分子质量为63 830,与其他物种的同源性较低,在pH7.5和IPTG浓度为0.5 mmol/L时18℃培养可溶性表达,血液中的抗体水平随着免疫次数的增加而升高,3免之后抗体滴度达到1∶8 000以上,抗体可以识别排泄分泌抗原(ESA)中的MIC4,MIC4主要位于速殖子前部的细胞质和膜表面。结果表明,重组MIC4是ESA的成分并且分泌之前分布于虫体前部,具有良好的特异性和免疫原性。 展开更多
关键词 弓形虫 微线体蛋白4 排泄分泌抗原 原核表达 免疫原性
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Detection of Antibodies against Toxoplasma gondii by ELISA with Recombinant Microneme Protein 3
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作者 JIANG Tao YAO Bao-an ZHAO Jun-long 《Animal Husbandry and Feed Science》 CAS 2009年第8期30-31,39,共3页
[Objective] To develop a new method for serodiagnosis of swine toxoplasmosis. [Method] With the purified recombinant microneme protein 3 (rMIC3) as coating antigens, an indirect ELISA was developed for detection of ... [Objective] To develop a new method for serodiagnosis of swine toxoplasmosis. [Method] With the purified recombinant microneme protein 3 (rMIC3) as coating antigens, an indirect ELISA was developed for detection of antibodies against Toxoplasma gondii. [ Result] The optimal working concentration of rMIC3 was 3. 40 ug/ml, and the optimal degree of dilution of sera was 1:160. Cross-reaction was not observed between the Toxoplasma gondii-positive sera and the positive sera against classical swine fever virus or some other pathogens. The developed ELISA had 92.56% coincidence rate with latex agglutination test. [ Conclusion] The developed ELISA is sensitive, rapid, specific and reproducible, and thus it can be applied in serodiagnosis and seroprevalence investigation of swine toxoplasmosis. 展开更多
关键词 Toxoplasma gondii Recombinant microneme protein 3 Enzyme linked immunosorbent assay ANTIBODIES
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TgMIC6的优化表达及其多克隆抗体的制备 被引量:1
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作者 李婧旸 韩成建 +2 位作者 刘志远 张德然 余莉 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第2期155-160,共6页
目的原核表达弓形虫微线体蛋白6(TgMIC6)结构功能域,并制备其多克隆抗体。方法运用Optigene TM密码子优化分析平台对弓形虫MIC6(TgMIC6)功能区的编码序列进行密码子优化,合成优化后的编码基因,并将其克隆入pET30a原核表达载体,构建pET30... 目的原核表达弓形虫微线体蛋白6(TgMIC6)结构功能域,并制备其多克隆抗体。方法运用Optigene TM密码子优化分析平台对弓形虫MIC6(TgMIC6)功能区的编码序列进行密码子优化,合成优化后的编码基因,并将其克隆入pET30a原核表达载体,构建pET30a-MIC6重组质粒;重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,经His亲和层析纯化后以His单克隆抗体为一抗进行Western blot鉴定。用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,抗体纯化后分别运用ELISA和Western blot对其效价和特异性进行分析。结果成功构建了pET30a-MIC6原核表达载体。表达的TgMIC6融合蛋白相对分子质量为45×10~3,与预期相符,纯化后浓度为0.5 mg/ml。以纯化的融合蛋白为抗原制备兔源性抗血清,ELISA测定其效价为1∶25 600,抗体浓度3.2 mg/ml,纯度>90%,Western blot显示该抗体能识别TgMIC6重组蛋白和不同虫株内的天然MIC6蛋白。结论优化后的TgMIC6功能区在原核表达系统内高效表达,制备的TgMIC6多克隆抗体效价高,特异性强,可识别重组菌和不同虫株表达的TgMIC6。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白6 多克隆抗体
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弓形虫TgMIC16多克隆抗体制备 纯化及其在亚细胞定位中的应用 被引量:1
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作者 魏冬冬 王龙江 +6 位作者 李瑾 崔勇 尹昆 黄炳成 魏庆宽 雷战 孙慧 《中国血吸虫病防治杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期440-442,共3页
目的制备并纯化弓形虫微线蛋白16(TgMIC16)兔源多克隆抗体,并利用制备的多克隆抗体对该蛋白进行亚细胞定位。方法利用原核表达、纯化的TgMIC16重组蛋白与等体积弗氏佐剂混合,背部皮下、多点注射免疫新西兰大白兔,于第3次加强免疫后的第1... 目的制备并纯化弓形虫微线蛋白16(TgMIC16)兔源多克隆抗体,并利用制备的多克隆抗体对该蛋白进行亚细胞定位。方法利用原核表达、纯化的TgMIC16重组蛋白与等体积弗氏佐剂混合,背部皮下、多点注射免疫新西兰大白兔,于第3次加强免疫后的第14天收集兔血清,Protein A亲和纯化柱纯化,用ELISA和蛋白质印迹(Western blotting)分别检测抗体效价和抗体特异性。用弓形虫RH株速殖子感染人包皮成纤维(HFF)细胞,以制备的多克隆抗体为一抗,采用间接免疫荧光(IFA)检测TgMIC16在感染细胞中的定位。结果间接ELISA结果显示,制备的TgMIC16多克隆抗体滴度为1∶512 000;Western blotting结果显示,TgMIC16抗体特异性良好;IFA结果显示,TgMIC16定位在弓形虫微线体。结论本研究制备并纯化了抗弓形虫TgMIC16兔源多克隆抗体,并成功应用于TgMIC16在弓形虫微线体的免疫荧光定位。 展开更多
关键词 弓形虫 微线蛋白16 多克隆抗体 免疫荧光定位
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刚地弓形虫微线体蛋白6和醛缩酶在虫体内的定位 被引量:1
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作者 尹志奎 郑斌 +4 位作者 姚志军 刘世国 任红斌 许兵红 张海珠 《新乡医学院学报》 CAS 2013年第2期86-89,共4页
目的观察刚地弓形虫微线体蛋白6(MIC6)和醛缩酶在虫体内的定位。方法聚合酶链反应扩增微线体蛋白2羧基端(MIC2C)基因片段,构建MIC2C/pGEX-4T-1/BL21表达系统,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达谷胱苷肽巯基转移酶-MIC2C(GST-MIC2C)蛋白... 目的观察刚地弓形虫微线体蛋白6(MIC6)和醛缩酶在虫体内的定位。方法聚合酶链反应扩增微线体蛋白2羧基端(MIC2C)基因片段,构建MIC2C/pGEX-4T-1/BL21表达系统,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达谷胱苷肽巯基转移酶-MIC2C(GST-MIC2C)蛋白,用该蛋白免疫新西兰兔,制备GST-MIC2C多克隆抗体。刚地弓形虫速殖子涂片,分别用一抗、荧光二抗温育,荧光显微镜下观察。结果成功获得GST-MIC2C多克隆抗体。荧光显微镜下显示MIC6(红色荧光)和醛缩酶(绿色荧光)2种蛋白皆定位于弓形虫的顶端。结论刚地弓形虫MIC6与醛缩酶在虫体内存在共定位关系,为2种蛋白相互作用关系的确立提供了细胞定位学证据。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白6 醛缩酶 定位
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