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MAGE-A4重组蛋白的原核表达与纯化
1
作者 雕丽琼 薛莹 +3 位作者 石梅 柴广金 穆允凤 王丽梅 《解放军预防医学杂志》 CAS 2013年第2期109-112,共4页
目的构建MAGE-A4的原核表达质粒并表达纯化相应蛋白,为恶性肿瘤的早期诊断和基因治疗疫苗的研制奠定基础。方法根据目的基因序列合成目的基因并与原核表达载体连接,以构建原核表达质粒pET30a(+)/MAGE-A4,将酶切鉴定及测序正确的重组质... 目的构建MAGE-A4的原核表达质粒并表达纯化相应蛋白,为恶性肿瘤的早期诊断和基因治疗疫苗的研制奠定基础。方法根据目的基因序列合成目的基因并与原核表达载体连接,以构建原核表达质粒pET30a(+)/MAGE-A4,将酶切鉴定及测序正确的重组质粒转入E.coli BL21,经IPTG诱导表达并行可溶性分析,Western Blot鉴定重组蛋白特异性后,通过亲和层析法纯化重组蛋白。结果成功构建pET30a(+)/MAGE-A4原核表达质粒,诱导表达得到重组蛋白MAGE-A4,主要以可溶性形式表达,纯化后获得纯度较高的蛋白。结论成功构建pET30a(+)/MAGE-A4原核表达质粒并表达纯化出具有生物学活性的重组蛋白MAGE-A4。 展开更多
关键词 肿瘤睾丸抗原 mage-A4 原核表达 纯化
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黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)多克隆抗体的制备和应用 被引量：5
2
作者 贺菽嘉 顾永耀 +5 位作者 肖绍文 张庆梅 陈芳 罗彬 付骏 谢小薰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期104-108,共5页
目的制备兔抗人黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)多克隆抗体,鉴定其免疫学特性,并进行初步应用。方法对构建的p MAL-C2/MAGE-D4重组质粒进行原核表达及纯化,获得MBP/MAGE-D4融合蛋白,并以此蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。抗体经蛋白A凝胶... 目的制备兔抗人黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)多克隆抗体,鉴定其免疫学特性,并进行初步应用。方法对构建的p MAL-C2/MAGE-D4重组质粒进行原核表达及纯化,获得MBP/MAGE-D4融合蛋白,并以此蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。抗体经蛋白A凝胶柱亲和层析法纯化后,通过SDS-PAGE检测其纯度;间接ELISA、Western blot法检测抗体的效价及特异性;免疫组织化学染色法检测肺癌组织中MAGE-D4的表达及定位。结果获得纯度较高的抗MAGE-D4多克隆抗体,ELISA检测抗体的效价为1∶256 000,Western blot法分析显示MAGE-D4多克隆抗体可特异性识别MAGE-D4重组蛋白,免疫组织化学结果表明,该抗体能识别肺癌组织中的内源性MAGE-D4蛋白,表达的阳性率为69.6%(17/23)。结论制备的MAGE-D4多克隆抗体具有较高的特异性和灵敏度。 展开更多
关键词 黑素瘤相关抗原D4(mage-D4) 多克隆抗体 肿瘤相关抗原
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黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)的生物信息学分析及真核表达载体的构建 被引量：1
3
作者 李霞琼 邓芸婷 +5 位作者 顾永耀 高精洧 罗育 林文珍 谢小薰 贺菽嘉 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第10期884-889,共6页
目的分析黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)蛋白的理化性质、结构和功能,构建MAGE-D4真核表达载体。方法通过生物信息学软件分析MAGE-D4蛋白的理化性质、结构和功能。以MAGE-D4/pMAL-C2原核重组质粒为模板,经PCR扩增、酶切后与pEGFP-C1真核表... 目的分析黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)蛋白的理化性质、结构和功能,构建MAGE-D4真核表达载体。方法通过生物信息学软件分析MAGE-D4蛋白的理化性质、结构和功能。以MAGE-D4/pMAL-C2原核重组质粒为模板,经PCR扩增、酶切后与pEGFP-C1真核表达质粒连接,转化大肠杆菌。连接产物经抗生素筛选、酶切、测序鉴定后,通过脂质体转染A549肺癌细胞。结果MAGE-D4蛋白为不稳定亲水性蛋白,无跨膜结构和信号肽,二级结构以α螺旋为主,具有多个功能性修饰位点,主要定位在细胞核。SLLLVILGV可能为MAGE-D4来源的HLA-A*0201限制性T细胞表位。与MAGE-D4存在潜在相互作用的前3位蛋白依次是染色体成分4非结构维持蛋白同源物A(NSMCE4A)、T细胞识别的黑素瘤抗原1(MLANA/MART-1)、黑素瘤B抗原5(BAGE5)。测序结果证实重组质粒含有MAGE-D4的全长编码序列(CDS),能成功转染A549肺癌细胞。结论MAGE-D4蛋白为不稳定核蛋白,可通过与多种黑素瘤相关蛋白相互作用而发挥功能,其来源的短肽可能具有较强的免疫原性,并构建了MAGE-D4真核表达载体。 展开更多
关键词 黑素瘤相关抗原D4(mage-D4) 生物信息学分析 PEGFP-C1
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人黑素瘤相关抗原D4原核表达条件的优化 被引量：1
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作者 邓芸婷 顾永耀 +6 位作者 蔡丹昭 罗育 高精洧 李霞琼 黄冠文 谢小薰 贺菽嘉 《广西医科大学学报》 CAS 2019年第7期1050-1055,共6页
目的:探索黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)基因工程菌原核诱导表达的最佳条件,以提高目的蛋白产量。方法:设置不同宿主菌(DH5α、TB1、Rosetta)、诱导时机(重组菌分别培养0.5~3h后进行诱导)、诱导剂IPTG浓度(0.1~0.9mmol/L)和诱导时间(1~8h)... 目的:探索黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)基因工程菌原核诱导表达的最佳条件,以提高目的蛋白产量。方法:设置不同宿主菌(DH5α、TB1、Rosetta)、诱导时机(重组菌分别培养0.5~3h后进行诱导)、诱导剂IPTG浓度(0.1~0.9mmol/L)和诱导时间(1~8h)等条件,诱导MAGE-D4重组质粒表达,通过SDS-PAGE电泳和ImageJ软件扫描电泳图谱的方法,对目的蛋白的表达量和可溶性进行分析。通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法对35例肝癌患者血清MAGE-D4抗体进行检测,分析MAGE-D4融合蛋白的免疫活性。结果:将重组质粒转化至Rosetta(DE3)大肠杆菌,菌液OD600达到0.8时加入IPTG至终浓度0.9mmol/L,37℃诱导培养7h,可有效提高目的蛋白的表达量。可溶性MAGE-D4融合蛋白表达量约占菌体总蛋白的25.5%。肝癌患者血清中MAGE-D4抗体的阳性率为28.57%(10/35),其MAGE-D4抗体平均效价明显高于正常人(P<0.05)。结论:本研究优化了MAGE-D4融合蛋白的原核表达条件,获得了可溶性、具有免疫活性的重组蛋白。 展开更多
关键词 黑素瘤相关抗原D4 原核表达 优化
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肿瘤相关抗原MAGE-D4在肝细胞癌中的表达及其意义 被引量：4
5
作者 罗鑫 沈宁 +7 位作者 刘畅 张沅 林丽娜 李枫 李冰滢 肖绍文 陈芳 张庆梅 《中国临床新医学》 2021年第6期594-599,共6页
目的探讨肿瘤相关抗原MAGE-D4在肝细胞癌(HCC)中的表达情况,并分析其临床意义。方法基于癌症基因组图谱(TCGA)数据库,获取371例HCC组织和50例正常肝组织的转录数据。应用数据挖掘工具UALCAN分析HCC组织中MAGE-D4 mRNA的表达情况,并筛选... 目的探讨肿瘤相关抗原MAGE-D4在肝细胞癌(HCC)中的表达情况,并分析其临床意义。方法基于癌症基因组图谱(TCGA)数据库,获取371例HCC组织和50例正常肝组织的转录数据。应用数据挖掘工具UALCAN分析HCC组织中MAGE-D4 mRNA的表达情况,并筛选与其表达相关的基因。应用Kaplan-Meier Plotter分析MAGE-D4 mRNA表达水平与患者生存预后的关系。另收集于广西医科大学第一附属医院2009年6月至2011年8月经手术获取的HCC标本70例,癌旁组织标本30例,采用免疫组织化学法(IHC)检测MAGE-D4蛋白的表达情况,并分析其与患者临床指标的关联性。结果基于TCGA数据库数据的分析结果显示,MAGE-D4 mRNA在HCC组织中的表达水平显著高于正常肝组织(P<0.05),且与甲胎蛋白(AFP)mRNA表达呈正相关(r=0.556,P=0.000)。生存分析结果显示,MAGE-D4 mRNA高表达与黄种人HCC患者不良生存预后具有显著关联(HR=1.860,P=0.037)。基于临床获取标本的分析结果显示,MAGE-D4蛋白主要定位于细胞质和细胞核,HCC组织的MAGE-D4高表达率显著大于癌旁组织(48.57%vs 23.33%;χ^(2)=5.530,P=0.019)。MAGE-D4高表达组HCC患者血清AFP浓度≥400μg/L的人数比例显著大于低表达组(P<0.05),但两组在性别、年龄、肿瘤级别、肿瘤分期、肿瘤直径、癌栓和乙型肝炎病毒(HBV)感染等方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论MAGE-D4在HCC组织中高表达,其可能在HCC的发生和发展过程中发挥重要作用,有望成为HCC的潜在治疗靶点和预后标志物。 展开更多
关键词 肝细胞癌 mage-D4 癌症基因组图谱数据库 临床特征 预后
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脑胶质瘤中MAGE-D4和CORO1C mRNA表达水平及其临床意义 被引量：1
6
作者 张沅 张鹏博 +7 位作者 谢欢 韦兴 李枫 刘畅 沈宁 王燕靖 农蔚霞 张庆梅 《中国临床新医学》 2022年第1期35-40,共6页
目的分析脑胶质瘤中黑色素瘤相关抗原(MAGE)-D4和肌动蛋白结合蛋白CORO1C mRNA的表达水平,探讨二者的相关性及临床意义。方法通过基因表达谱交互式分析(GEPIA)数据库收集脑胶质瘤样本数据681例[低级别脑胶质瘤(LGG)518例,胶质母细胞瘤(G... 目的分析脑胶质瘤中黑色素瘤相关抗原(MAGE)-D4和肌动蛋白结合蛋白CORO1C mRNA的表达水平,探讨二者的相关性及临床意义。方法通过基因表达谱交互式分析(GEPIA)数据库收集脑胶质瘤样本数据681例[低级别脑胶质瘤(LGG)518例,胶质母细胞瘤(GBM)163例],正常脑组织样本数据207例,比较其MAGE-D4和CORO1C mRNA的表达水平。进一步收集62例脑胶质瘤组织和11例正常脑组织临床样本,应用逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测其MAGE-D4和CORO1C mRNA表达水平并进行比较,分析MAGE-D4和CORO1C mRNA表达水平与脑胶质瘤患者临床指标的关联性。应用小干扰RNA(siRNA)技术沉默脑胶质瘤细胞株MAGE-D4的表达,检测CORO1C mRNA的表达变化情况。结果GEPIA数据库数据分析结果显示,GBM和LGG组织的MAGE-D4和CORO1C mRNA表达水平均高于正常脑组织,差异有统计学意义(P<0.05)。针对临床样本的RT-qPCR检测结果也显示,脑胶质瘤组织中MAGE-D4和CORO1C mRNA的表达水平显著高于正常脑组织(P<0.05)。MAGE-D4及CORO1C mRNA的表达水平与患者年龄、性别、世界卫生组织(WHO)分级、病理类型、卡氏评分(KPS)、肿瘤最长径,以及Ki-67、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、S-100和波形蛋白(Vimentin)的表达水平均无显著关联(P>0.05)。Pearson相关分析结果显示,临床脑胶质瘤样本组织中MAGE-D4与CORO1C mRNA表达水平呈正相关(r=0.848,P=0.000)。细胞实验结果显示,经MAGE-D4 siRNA沉默后,U87 MG和U251细胞CORO1C mRNA的表达水平显著下降(P<0.05)。结论MAGE-D4和CORO1C mRNA在脑胶质瘤组织中高表达,且二者表达水平呈正相关。MAGE-D4和CORO1C可能协同影响脑胶质瘤的发生、发展过程,其具有成为脑胶质瘤分子靶向治疗靶点的潜力。 展开更多
关键词 脑胶质瘤 黑色素瘤相关抗原-D4 CORO1C 相关性
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