鲍曼不动杆菌外膜蛋白A慢病毒载体的构建及其对RAW264.7细胞NLRP3炎症小体的激活 被引量：7

1

作者 安志远 丁文一 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第2期146-150,共5页

目的建立OmpA过表达慢病毒载体并观察其对RAW264.7细胞NLRP3炎症小体的激活。方法以鲍曼不动杆菌ATCC 19606为模板,设计引物扩增OmpA基因,将其克隆至慢病毒表达载体pCDH-MSCV-copGFP中。将此表达质粒和辅助质粒共转染HEK293T细胞包装病... 目的建立OmpA过表达慢病毒载体并观察其对RAW264.7细胞NLRP3炎症小体的激活。方法以鲍曼不动杆菌ATCC 19606为模板,设计引物扩增OmpA基因,将其克隆至慢病毒表达载体pCDH-MSCV-copGFP中。将此表达质粒和辅助质粒共转染HEK293T细胞包装病毒,浓缩病毒上清液并用GFP报告基因法测定病毒滴度;用包装病毒颗粒感染RAW264.7细胞48h,Real-time PCR法检测OmpA的mRNA表达水平,用Western blot法检测OmpA蛋白以及感染后NLRP3炎症小体相关蛋白。结果成功构建OmpA过表达慢病毒载体并在HEK293T细胞中包装得到病毒,经测定病毒滴毒为1.5×109 TU/mL;重组OmpA病毒感染RAW264.7细胞表达OmpA蛋白,该蛋白能引起NLRP3炎症小体激活。结论成功构建OmpA过表达慢病毒载体并证明OmpA可激活RAW264.7细胞NLRP3炎症小体。 展开更多

关键词 鲍曼不动杆菌 外膜蛋白A 慢病毒包装 RAW264.7细胞 NLRP3炎症小体

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过表达JMJD6基因的293T细胞系的构建及对水疱性口炎病毒增殖效率的评价 被引量：1

2

作者 黄梦瑶 杨帆 +8 位作者 杨洋 邵文华 王家丽 吕岳芹 赵晓义 陈治彤 曹伟军 张伟 郑海学 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期569-576,共8页

为提高水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)在细胞中的增殖效率,本研究利用慢病毒包装系统构建Jumonji C结构域蛋白6(Jumonji domain-containing protein 6,JMJD6)过表达的HEK-293T/JMJD6细胞系,分析VSV在HEK-293T/JMJD6细... 为提高水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)在细胞中的增殖效率,本研究利用慢病毒包装系统构建Jumonji C结构域蛋白6(Jumonji domain-containing protein 6,JMJD6)过表达的HEK-293T/JMJD6细胞系,分析VSV在HEK-293T/JMJD6细胞系与HEK-293T细胞中的复制差异。首先以JMJD6基因为目标,构建重组质粒pLV-puro-3×Flag-JMJD6,并与辅助质粒pMD2.G和psPAX2共转染至HEK-293T细胞进行慢病毒包装。将包装好的慢病毒感染HEK-293T细胞并通过嘌呤霉素筛选获得过表达JMJD6基因的阳性细胞。利用Western-blot、间接免疫荧光试验、流式细胞术和蚀斑试验检测VSV在HEK-293T/JMJD6细胞系中的复制能力。结果显示,在HEK-293T/JMJD6细胞系中,VSV的复制能力显著增强。实时荧光定量检测VSV感染的HEK-293T/JMJD6细胞系和野生型HEK-293T细胞中干扰素下游基因的表达,结果显示HEK-293T/JMJD6细胞系抑制VSV诱导的Ⅰ型干扰素下游基因的产生。总之,本研究构建的HEK-293T/JMJD6细胞系能显著促进VSV的增殖并抑制Ⅰ型干扰素信号通路,为VSV疫苗候选细胞株的筛选奠定了基础。 展开更多

关键词 JMJD6 水疱性口炎病毒 慢病毒包装 过表达细胞系 干扰素

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稳定表达牛分枝杆菌PPE13的THP-1细胞株的建立

3

作者 刘卓彤 毕斯琪 +3 位作者 孟祥苗 胡燕萍 宋厚辉 杨杨 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第5期179-184,共6页

为了深入研究牛分枝杆菌PPE13在病原-宿主相互作用中的具体机制,本研究利用慢病毒表达系统构建了PPE13稳定表达的THP-1细胞系。首先,采用分子克隆技术,以牛分枝杆菌基因组DNA为模板扩增出ppe13目的片段,构建含有ppe13片段的重组慢病毒... 为了深入研究牛分枝杆菌PPE13在病原-宿主相互作用中的具体机制,本研究利用慢病毒表达系统构建了PPE13稳定表达的THP-1细胞系。首先,采用分子克隆技术,以牛分枝杆菌基因组DNA为模板扩增出ppe13目的片段,构建含有ppe13片段的重组慢病毒表达质粒,将该质粒和慢病毒包装质粒转染至239T细胞中,72 h后收集病毒。然后,将获得的病毒感染THP-1细胞中,经1μg/mL嘌呤霉素筛选获得稳定表达PPE13的细胞株THP-1/PPE13。最后,使用ELISA方法检测稳定表达细胞系中TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的情况,以验证细胞系中PPE13的生物学活性。结果显示,相较于对照细胞THP-1/Con,THP-1/PPE13中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平均显著升高。该细胞系的建立为深入研究PPE13调控细胞信号通路的功能提供了实验基础。 展开更多

关键词 牛分枝杆菌 PPE13 慢病毒包装 稳定表达

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针对前列腺癌的PSMA-CAR慢病毒表达载体的构建及病毒包装 被引量：1

4

作者 王丙萍 段金凯 高维实 《现代肿瘤医学》 CAS 北大核心 2021年第16期2774-2779,共6页

目的:构建针对前列腺特异性膜抗原(PSMA)的CAR慢病毒表达载体,并包装病毒颗粒。方法:设计并合成针对PSMA的CAR基因序列,将设计的CAR片段连入pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-puro载体中,经酶切、PCR及测序鉴定构建是否成功。应用慢病毒三... 目的:构建针对前列腺特异性膜抗原(PSMA)的CAR慢病毒表达载体,并包装病毒颗粒。方法:设计并合成针对PSMA的CAR基因序列,将设计的CAR片段连入pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-puro载体中,经酶切、PCR及测序鉴定构建是否成功。应用慢病毒三质粒包装系统将PSMA-CAR载体进行包装,通过荧光显微镜观察及流式细胞仪检测GFP鉴定包装结果及包装时的转染效率。通过超速离心方法浓缩病毒颗粒。结果:成功构建了PSMA-CAR慢病毒表达载体,成功包装了PSMA-CAR慢病毒颗粒且包装时的转染效率为70.43%,经测定获得的PSMA-CAR慢病毒滴度为5×105TU/mL。结论:PSMA-CAR慢病毒表达载体的成功构建及病毒颗粒的包装为应用CAR技术治疗前列腺癌奠定了基础。 展开更多

关键词 前列腺特异性膜抗原 慢病毒表达载体 嵌合抗原受体 慢病毒包装

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SP110基因过表达慢病毒载体的构建与包装

5

作者 贾鹏霞 刘丙雨 +4 位作者 李新月 张万江 程江 吴江东 马雅静 《转化医学杂志》 2020年第2期75-78,共4页

目的构建核体蛋白SP110基因过表达慢病毒载体,并进行慢病毒包装,为研究SP110在结核病中的作用机制奠定基础。方法利用PCR技术获得SP110基因序列并将其插入到慢病毒穿梭质粒LV5中,获得重组慢病毒质粒V-SP110,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,... 目的构建核体蛋白SP110基因过表达慢病毒载体,并进行慢病毒包装,为研究SP110在结核病中的作用机制奠定基础。方法利用PCR技术获得SP110基因序列并将其插入到慢病毒穿梭质粒LV5中,获得重组慢病毒质粒V-SP110,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,用RNAi-Mate将重组质粒和慢病毒包装质粒系统(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)包装成重组慢病毒颗粒,共转染293T细胞,包装产生慢病毒。通过荧光显微镜或FACS计数荧光细胞,结合稀释倍数计算病毒滴度。结果酶切鉴定结果显示产生约1650 bp的片段,片段大小与SP110基因cDNA大小一致。DNA测序比对测序结果与预期SP110基因序列完全一致,说明SP110基因正确插入载体中,成功构建了SP110基因过表达载体。经293T细胞包装后,成功获得病毒滴度为1.0×10^8 TU/mL的重组慢病毒LV5-SP110。结论SP110基因过表达慢病毒载体构建与包装成功完成,为进一步探讨SP110基因在结核病发生发展中的作用提供工具。 展开更多

关键词 SP110基因 慢病毒构建 慢病毒包装

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可诱导表达结核分枝杆菌ESAT-6的THP-1细胞系的建立 被引量：1

6

作者 唐亦然 戴鑫钧 +4 位作者 胡燕萍 毕斯琪 孟祥苗 杨杨 宋厚辉 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第11期2148-2154,共7页

利用Tet-On-3G系统构建可诱导表达ESAT-6的THP-1细胞系,研究结核分枝杆菌毒力蛋白ESAT-6在宿主细胞内的生物学功能。首先,利用聚合酶链反应(PCR)扩增ESAT-6片段和红色荧光蛋白mCherry片段,并与pLVX-TRE3G载体连接,构建pTRE3G-mCherry-ES... 利用Tet-On-3G系统构建可诱导表达ESAT-6的THP-1细胞系,研究结核分枝杆菌毒力蛋白ESAT-6在宿主细胞内的生物学功能。首先,利用聚合酶链反应(PCR)扩增ESAT-6片段和红色荧光蛋白mCherry片段,并与pLVX-TRE3G载体连接,构建pTRE3G-mCherry-ESAT-6。将其与调控质粒pLVX-Tet3G共同转染HEK293T细胞,Dox诱导后检测ESAT-6表达情况。然后,将质粒pTRE3G-mCherry-ESAT-6和pLVX-Tet3G分别与包装质粒psPAX2和pMD2.0G共转染HEK293T细胞,以获得慢病毒颗粒LV-TRE3G-ESAT-6和LVX-Tet3G。接着,将2种病毒感染THP-1细胞,通过Puromycin和G418进行筛选诱导表达ESAT-6的阳性细胞克隆,命名为THP-1/ESAT-6。利用Western blot检测THP-1细胞中ESAT-6的表达情况。结果表明,筛选获得了携带ESAT-6的THP-1诱导表达细胞系,并且ESAT-6表达量与Dox剂量和诱导时间呈正相关。最后,对细胞系中表达的ESAT-6进行生物活性检测,结果表明ESAT-6能够促进细胞的死亡和IL-1β的分泌。该细胞系的建立为深入研究ESAT-6调控细胞信号通路的功能提供了基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 ESAT-6 慢病毒包装 TET-ON 诱导表达

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烟台黑猪SLA-2基因真核表达载体的构建及表达

7

作者 胡晓 王宝宝 +4 位作者 窦少华 姜南 付常振 金行 高凤山 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第10期143-151,共9页

为构建烟台黑猪SLA-2基因(SLA-2-YT)的真核表达载体SLA-2-YT/pCDH并将其在真核细胞中表达,根据SLA-2-YT编码区基因序列设计1对引物,以SLA-2-YT/pMD18-T全基因克隆表达载体为模板进行PCR扩增获得SLA-2-YT编码区基因片段,在上下游引物的5&... 为构建烟台黑猪SLA-2基因(SLA-2-YT)的真核表达载体SLA-2-YT/pCDH并将其在真核细胞中表达,根据SLA-2-YT编码区基因序列设计1对引物,以SLA-2-YT/pMD18-T全基因克隆表达载体为模板进行PCR扩增获得SLA-2-YT编码区基因片段,在上下游引物的5'端分别添加限制性内切酶Xba I和Not I的酶切位点,将目的基因经pMD 19-T Simple Vector TA克隆后与pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro真核表达载体连接,获得的重组质粒转化至大肠杆菌Stbl 3感受态细胞,对扩大培养的单克隆菌株抽提质粒,使用双酶切和测序验证插入序列。对真核表达载体构建正确的菌株抽提无内毒素质粒,通过慢病毒包装和感染将质粒转染至sT2细胞,通过Western Blotting检测sT2细胞中SLA-2-YT基因的表达情况。结果显示,成功构建了SLA-2-YT/pCDH重组真核表达载体。重组质粒进行慢病毒包装和感染sT2细胞,经嘌呤霉素筛选后,成功获得阳性细胞克隆。Western Blotting检测显示SLA-2-YT/pCDH在sT2细胞中得到了优势表达,其融合蛋白的分子量大小为45 kD,与理论设计值相符。该实验成功构建了SLA-2-YT编码区基因的真核表达载体,并证实了SLA-2-YT编码区基因能够在sT2细胞中优势表达,为下一步开展SLA-2-YT递呈CTL表位的研究提供了材料。 展开更多

关键词 烟台黑猪 SLA-2基因 真核表达载体 慢病毒包装 转染

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膜锚定Gaussia萤光素酶的细胞标记及生物荧光成像

8

作者 樊炜 贾帅争 +4 位作者 王怡 阎少多 高博 彭剑淳 詹林盛 《生物技术通讯》 CAS 2011年第6期838-841,共4页

目的:制备表达膜锚定Gaussia萤光素酶(extGluc)报告基因的慢病毒,用于标记细胞。方法:将报告基因extGluc克隆至慢病毒载体pCCsin.PPT.SFFV.IRES.eGFP.Wpre(VeGFP)中,以聚乙烯亚胺(PEI)介导,将慢病毒包装所需4种质粒(pVeGFP-extGLuc、pMD... 目的:制备表达膜锚定Gaussia萤光素酶(extGluc)报告基因的慢病毒,用于标记细胞。方法:将报告基因extGluc克隆至慢病毒载体pCCsin.PPT.SFFV.IRES.eGFP.Wpre(VeGFP)中,以聚乙烯亚胺(PEI)介导,将慢病毒包装所需4种质粒(pVeGFP-extGLuc、pMDL、pRev、pVSVG),转染293FT细胞,72 h后收集病毒上清进行浓缩,感染293FT细胞,并用流式细胞仪检测病毒滴度,生物荧光成像和化学发光分析extGluc的表达;之后,用收集的慢病毒感染人单核细胞白血病细胞株U937。结果:对经PCR筛选出的阳性克隆所含质粒进行酶切鉴定,表明extGlu报告基因插入载体中;重组慢病毒包装成功且病毒滴度为5×106 TU/mL;用包装的病毒颗粒感染293FT细胞,生物荧光成像和化学发光证实extGluc的膜定位,且酶活性与细胞数目呈线性相关;病毒颗粒能够感染悬浮细胞U937。结论:包装了extGluc标记的重组慢病毒,可用于标记细胞,为体内监测细胞迁移、聚集和变化提供了一种方法。 展开更多

关键词 Gaussia萤光素酶 膜锚定 慢病毒包装 生物荧光成像

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miR-31慢病毒载体质粒构建及其对宫颈癌HeLa细胞增殖和迁移能力的影响

9

作者 王琳琳 胡晓霞 刘斐 《山东医药》 CAS 北大核心 2017年第28期1-4,共4页

目的构建微小核糖核酸31(miR-31)慢病毒载体质粒,并观察其对宫颈癌HeLa细胞增殖和迁移能力的影响。方法以包含miR-31基因的序列为目的片段,设计末端含有相应酶切位点的引物,PCR扩增目的片段,产物双酶切后插入线性化慢病毒载体中,构建miR... 目的构建微小核糖核酸31(miR-31)慢病毒载体质粒,并观察其对宫颈癌HeLa细胞增殖和迁移能力的影响。方法以包含miR-31基因的序列为目的片段,设计末端含有相应酶切位点的引物,PCR扩增目的片段,产物双酶切后插入线性化慢病毒载体中,构建miR-31慢病毒载体质粒并鉴定。将miR-31慢病毒载体质粒与包装质粒pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSV-G共转染宫颈癌HeLa细胞,并进行慢病毒包装,检测miR-31慢病毒载体质粒滴度。取对数生长期HeLa细胞,随机分为空白对照组、miR-31组、空载体组,空白对照组不做任何处理,miR-31组予miR-31慢病毒载体质粒处理,空载体组予空载体慢病毒质粒处理。采用实时荧光定量PCR法检测各组miR-31 mRNA表达;MTT法和细胞克隆实验检测各组细胞增殖能力,Transwell小室法检测各组细胞迁移能力。结果成功构建重组慢病毒表达质粒,其病毒滴度为3×107TU/m L。miR-31组miR-31 mRNA相对表达量明显高于空白对照组、空载体组(P均<0.05),而空白对照组与空载体组比较P>0.05。miR-31组细胞增殖和迁移能力均高于空白对照组、空载体组(P均<0.05),而空白对照组与空载体组比较P均>0.05。结论成功构建了miR-31慢病毒载体质粒,建立了稳定过表达miR-31的宫颈癌HeLa细胞。稳定过表达miR-31的宫颈癌HeLa细胞增殖和迁移能力明显增强。 展开更多

关键词 宫颈癌 微小核糖核酸31 慢病毒包装 细胞增殖 细胞迁移

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cGAS稳定表达细胞系的构建及功能鉴定

10

作者 赵呈彦 任豪杰 +2 位作者 万博 魏战勇 何文瑞 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期5317-5324,共8页

天然免疫系统会在病毒入侵机体后的第一时间对其进行识别,并合成分泌I型干扰素和炎症因子等细胞因子参与宿主抗病毒免疫反应。天然免疫应答的启动主要通过机体自身表达的模式识别受体对病毒来源的病原相关分子模式的识别来实现。cGAS是... 天然免疫系统会在病毒入侵机体后的第一时间对其进行识别,并合成分泌I型干扰素和炎症因子等细胞因子参与宿主抗病毒免疫反应。天然免疫应答的启动主要通过机体自身表达的模式识别受体对病毒来源的病原相关分子模式的识别来实现。cGAS是目前最公认的胞质DNA受体,在各种类型的细胞和组织中广泛表达。猪肾细胞PK-15是猪病毒性疾病研究过程中应用十分广泛的工具细胞,然而本研究前期的转录组学数据显示,PK-15细胞中cGAS的转录水平极低,蛋白水平几乎检测不到PK-15细胞系中cGAS的表达,这极大程度的限制了PK-15细胞在猪病毒性疾病感染与免疫机制探究中的应用。本研究旨在构建一株稳定表达cGAS的PK-15细胞系。通过慢病毒包装系统,将cGAS基因整合到靶细胞基因组,经嘌呤霉素加压筛选,获得能够稳定表达cGAS的PK-15细胞系,并以猪伪狂病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)和猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)为模式病毒,对cGAS在抗DNA病毒感染过程中的作用进行了验证。结果表明,cGAS基因成功整合到宿主细胞PK-15基因组,重组细胞系PK-15-cGAS能够稳定表达cGAS蛋白;PRV和PPV感染PK-15-cGAS细胞能诱导产生更高水平的干扰素相关基因,在PK-15-cGAS细胞中PRV和PPV的复制受到明显抑制。这些结果表明,稳定表达cGAS的PK-15细胞系构建成功,它可用于猪病毒性疾病感染与免疫机制相关探究,为后续探究该类病毒免疫逃逸机制提供了良好的试验材料。 展开更多

关键词 cGAS PK-15 稳定细胞系 慢病毒包装系统

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基于CRISPR/cas9文库筛选的慢病毒库包装方法研究 被引量：1

11

作者 刘铁柱 李阿茜 +7 位作者 李乃哲 曲园园 李川 张全福 刘洋 李德新 梁米芳 王世文 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2019年第2期207-211,共5页

目的探讨基于CRISPR/cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9)文库筛选的慢病毒库包装优化条件。方法采用RT-PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA法)和免疫荧光法,对不同质粒... 目的探讨基于CRISPR/cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9)文库筛选的慢病毒库包装优化条件。方法采用RT-PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA法)和免疫荧光法,对不同质粒配比、不同收毒时间以及不同量的Lipofectamine 3000 reagent包装出的慢病毒滴度进行检测,最后通过高通量测序技术评价慢病毒库的sgRNA(single guide RNA,单链引导RNA)覆盖度和reads数分布。结果当质粒配比psPAX2∶pMD2.0G∶Lentivirus library=2∶1∶1时,慢病毒滴度较高;当加入Lipofectamine 3000 reagent的量为10 μl时,慢病毒滴度较高。两种情况,RT-PCR和ELISA法结果一致。免疫荧光显示,收毒时间为60 h时慢病毒滴度较高。经Ion Torrent高通量测序,按照本研究的最优条件包装出的慢病毒库覆盖度达99.3%,sgRNA的reads数符合正态分布。结论本研究探索了慢病毒库包装的优化条件,为下一步CRISPR/cas9文库筛选提供保证。 展开更多

关键词 CRISPR/cas9文库筛选 慢病毒库包装 高通量测序技术

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