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CRISPR/Cas9介导的同源重组插入敲除人SH2B3基因 被引量：1
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作者 蔡元星 王宁 +1 位作者 王思乐 王华岩 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 2018年第2期252-259,共8页
SH2B3基因的突变可以显著提高人干细胞向红细胞诱导分化的效率。该研究利用CRISPR/Cas9技术介导的同源重组插入敲除策略,建立了一种高效获得特定基因编辑类型的敲除SH2B3基因的方法。通过设计两个含有不同荧光标记和不同抗性基因的同源... SH2B3基因的突变可以显著提高人干细胞向红细胞诱导分化的效率。该研究利用CRISPR/Cas9技术介导的同源重组插入敲除策略,建立了一种高效获得特定基因编辑类型的敲除SH2B3基因的方法。通过设计两个含有不同荧光标记和不同抗性基因的同源重组筛选载体和一个靶向SH2B3基因的CRISPR/Cas9敲除载体,共转染HeLa细胞,然后用嘌呤霉素和新霉素进行筛选,两周后一部分细胞用于分子生物学检测,另一部分细胞通过有限稀释法分离单细胞克隆。结果显示,在药物抗性筛选两周的HeLa细胞中,野生型SH2B3基因转录产物几乎检测不到,可以检测到重组型转录产物的表达。敲除效率的统计结果显示,在获得的19株SH2B3基因敲除细胞中,有11株细胞为双等位基因插入敲除。另外8株细胞为单等位基因插入敲除,其中有2株细胞的等位基因没有检测到突变,而剩余的6株细胞的等位基因都检测到有突变。因此,该研究的双插入敲除率为57.9%,双敲除率达到89.5%。该研究为构建SH2B3基因敲除的人多能干细胞系奠定了基础,也为建立一种高效、低成本的诱导红细胞的技术体系提供了有效的工具。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9技术 同源重组 SH2B3基因 敲除 红细胞诱导
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Sitravatinib联合Niraparib对黏膜黑色素瘤细胞系增殖、凋亡和自噬的影响及其机制
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作者 胡子衿 孔燕 +2 位作者 吴晓雯 郭倩 郭军 《基础医学与临床》 2024年第3期295-302,共8页
目的研究抗血管生成药物Sitravatinib联合多聚(腺苷二磷酸[ADP]-核糖)聚合酶抑制剂(PARPi)Niraparib对黏膜黑色素瘤细胞的作用及其可能的机制。方法CCK8法检测Sitravatinib和Niraparib在黏膜黑色素瘤(MM)细胞系的半数抑制浓度(IC 50);Co... 目的研究抗血管生成药物Sitravatinib联合多聚(腺苷二磷酸[ADP]-核糖)聚合酶抑制剂(PARPi)Niraparib对黏膜黑色素瘤细胞的作用及其可能的机制。方法CCK8法检测Sitravatinib和Niraparib在黏膜黑色素瘤(MM)细胞系的半数抑制浓度(IC 50);CompuSyn模型计算不同浓度联合条件下的联合指数(CI)。细胞集落形成实验测定细胞增殖;流式细胞测量术测定细胞凋亡;Western blot检测蛋白质表达;RT-qPCR检测mRNA表达。结果在人阴道黏膜来源黑色素瘤细胞系(HMVⅡ)和人外阴黏膜黑色素瘤腹股沟淋巴结转移病灶来源细胞系(GAK)中Sitravatinib(2μmol/L)联合Niraparib(20μmol/L)条件下CI值分别为0.19和0.15;与对照组及单药组相比,联合组细胞增殖能力显著下降(P<0.05或P<0.01或P<0.001);细胞凋亡率显著升高(P<0.01或P<0.001),凋亡标志物蛋白质和mRNA表达均显著升高(P<0.001);细胞自噬标志物蛋白质和mRNA表达显著升高(P<0.01或P<0.001);DNA损伤相关蛋白质表达显著升高。而与对照组相比,Sitravatinib单药组和联合组重组酶辐射敏感蛋白51(RAD51)表达显著下降。随着Sitravatinib剂量逐渐升高至2μmol/L,RAD51蛋白和mRNA表达显著下降(P<0.05或P<0.01),BRCA1与BRCA2的mRNA表达显著下降(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。结论Sitravatinib联合Niraparib可抑制黏膜黑色素瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡并促进细胞自噬,其机制可能与Sitravatinib抑制同源重组修复(HRR)水平相关。 展开更多
关键词 黏膜型黑色素瘤 抗血管生成药物 多聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶抑制剂 同源重组修复
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