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中国人γ－干扰素cDNA在大肠杆菌中的高效表达 被引量：7
1
作者 瞿成奎 魏汉东 +2 位作者 鱼咏涛 贺福初 吴祖泽 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1995年第5期433-436,共4页
应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从中国人淋巴细胞ｍＲＮＡ反转录产物中克隆了ＩＦＮ－γｃＤＮＡ，序列分析证实了分子进化规律对ＩＦＮ－γｃＤＮＡ序列存在多态性的推论．在此基础上应用ＤＮＡ重组技术，将去信号肽中国人ＩＦＮ－γｃＤＮＡ克... 应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从中国人淋巴细胞ｍＲＮＡ反转录产物中克隆了ＩＦＮ－γｃＤＮＡ，序列分析证实了分子进化规律对ＩＦＮ－γｃＤＮＡ序列存在多态性的推论．在此基础上应用ＤＮＡ重组技术，将去信号肽中国人ＩＦＮ－γｃＤＮＡ克隆到原核表达质粒ｐＢＶ２２０Ｐ＿ＲＰ＿Ｌ启动子下游，转化大肠杆菌ＤＨ５α，通过温度诱导表达，成功地在大肠杆菌中稳定、高效地表达了中国人ＩＦＮ－γｃＤＮＡ，其表达水平占全菌可溶性总蛋白的４４．４％，初步复性后生物学活性测定结果表明γ－ＩＦＮ表达量为０．４５×１０￣７～２．３４×１０￣７单位／Ｌ． 展开更多
关键词 中国人 γ-干扰素 高效表达 CDNA 大肠杆菌
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携带hIFN-γ的内皮祖细胞增强肿瘤化疗后维持治疗的效果 被引量：2
2
作者 王鈜 刘广贤 +7 位作者 卓海龙 白文林 吴煜 周霖 楼敏 曾珍 常秀娟 徐建明 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期521-524,共4页
目的:观察携带hIFN-γ基因的内皮祖细胞(endothelial progenetor cells carrying hIFN-γ,EPC-hIFN-γ)在肿瘤化疗后维持治疗的效果。方法:LoVo大肠癌细胞加入喜树碱-11(camptothecin-11,CPT-11),再分别加入hIFN-γ或(和)西妥苷单抗(cet... 目的:观察携带hIFN-γ基因的内皮祖细胞(endothelial progenetor cells carrying hIFN-γ,EPC-hIFN-γ)在肿瘤化疗后维持治疗的效果。方法:LoVo大肠癌细胞加入喜树碱-11(camptothecin-11,CPT-11),再分别加入hIFN-γ或(和)西妥苷单抗(cetuximab,C225),MTT法观察其对LoVo细胞的抑制作用。荷Lovo大肠癌细胞移植瘤裸鼠在给药CPT-11后,再给予EPCs-hIFN-γ或(和)C225,观察对肿瘤的抑制作用和对裸鼠生存期的影响。结果:在体外,肿瘤细胞中加入CPT-11后再加入hIFN-γ或(和)C225可进一步抑制肿瘤细胞的生长。荷瘤裸鼠在给予CPT-11 50 mg/kg后,分别给予EPCs-hIFN-γ、C225或者EPCs-hIFN-γ+C225,均可以进一步抑制肿瘤的生长[肿瘤平均体积(2 024.28±1 048.40)mm3vs(764.94±720.14)mm3、(233.85±186.97)mm3、(186.95±133.43)mm3、(163.9±173.39)mm3,P<0.05),均可进一步延长荷瘤裸鼠的生存期(中位生存期34.2 dvs39.4 d、44.5 d、48.5 d、51.3 d,P<0.05或P<0.01);其中以CPT-11+EPCs-hIFN-γ+C225的治疗效果最好。结论:EPCs-hIFN-γ用于化疗后维持治疗可以抑制肿瘤细胞生长,延长荷瘤小鼠的生存。 展开更多
关键词 大肠肿瘤 hifn-γ 内皮祖细胞 免疫治疗
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人IFN-γ在大肠杆菌中高效表达和色谱复性研究 被引量：2
3
作者 王骊丽 耿信笃 韩骅 《西北大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期540-544,共5页
从健康人外周血分离单核细胞,经LPS刺激后提取总RNA,用RT-PCR扩增hIFN-γ的cDNA。将扩增产物克隆后进行序列分析证明,克隆的hIFN-γcDNA除存在2个序列多态性位点外,与天然的干扰素氨基酸序列完全一致。利用温控表达系统在大肠杆菌中实现... 从健康人外周血分离单核细胞,经LPS刺激后提取总RNA,用RT-PCR扩增hIFN-γ的cDNA。将扩增产物克隆后进行序列分析证明,克隆的hIFN-γcDNA除存在2个序列多态性位点外,与天然的干扰素氨基酸序列完全一致。利用温控表达系统在大肠杆菌中实现了hIFN-γ的高效表达,表达的目的蛋白可占菌体总蛋白的55%。用5L和50L发酵罐放量生产的产物,经高效疏水色谱HPHIC直接复性和纯化得到了重组hIFN-γ纯品,其比活性与天然蛋白相近。 展开更多
关键词 人干扰素-γ 反转录聚合酶链反应 重组蛋白表达 复性与纯化 高效疏水色谱
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携带hIFN-γ的增殖型腺病毒治疗胃癌的体外实验研究
4
作者 陈琳 姜梨华 +3 位作者 李林芳 吴红平 钱炎珍 薛旭潮 《生物技术》 CAS CSCD 2008年第5期26-28,共3页
目的:研究增殖型腺病毒CNHK300-hIFN-γ在胃癌细胞中的增殖、杀伤能力与表达hIFN-γ蛋白的能力。方法:病毒增殖实验比较CNHK300-hIFN-γ与CNHK300在胃癌细胞SGC-7901与成纤维细胞BJ中的增殖能力;ELISA法比较CNHK300-hIFN-γ和复制缺陷... 目的:研究增殖型腺病毒CNHK300-hIFN-γ在胃癌细胞中的增殖、杀伤能力与表达hIFN-γ蛋白的能力。方法:病毒增殖实验比较CNHK300-hIFN-γ与CNHK300在胃癌细胞SGC-7901与成纤维细胞BJ中的增殖能力;ELISA法比较CNHK300-hIFN-γ和复制缺陷型腺病毒Ad-hIFN-γ在细胞中hIFN-γ蛋白的表达量;细胞活力MTT检测法与CPE实验观察CNHK300-hIFN-γ对胃癌细胞与正常细胞的杀伤效应。结果:增殖实验结果表明CNHK300-hIFN-γ能选择性地在端粒酶阳性的胃癌细胞中大量增殖;ELISA实验结果表明CNHK300-hIFN-γ在胃癌细胞中hIFN-γ的表达量可至117.26±15.92ng/ml;MTT与CPE实验表明CNHK300-hIFN-γ对胃癌细胞有显著的杀伤性,对正常细胞无明显杀伤。结论:增殖型腺病毒CNHK300-hIFN-γ感染胃癌细胞后增殖活跃并能大量表达目的基因hIFN-γ,对胃癌细胞有明显杀伤作用但对正常细胞无明显杀伤,为胃癌的病毒基因治疗进一步提供了理论依据。 展开更多
关键词 增殖型腺病毒 胃癌 基因治疗 hifn-γ
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hIL-2/IFN-γ嵌合基因原核表达质粒的构建与表达
5
作者 邵亚明 田泽维 +2 位作者 罗发兴 陈光明 杨富强 《华南理工大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2005年第1期84-87,共4页
为构建hIL 2 /IFN γ 嵌合基因原核表达质粒 ,筛选其高效表达工程菌 ,设计特异性引物 ,PCR扩增目的基因并克隆至pPROEXHTb质粒NcoⅠ /HindⅢ位点 ,经双酶切及序列测定筛选阳性克隆 ,IPTG诱导工程菌后以SDS PAGE电泳鉴定目的蛋白的表达情... 为构建hIL 2 /IFN γ 嵌合基因原核表达质粒 ,筛选其高效表达工程菌 ,设计特异性引物 ,PCR扩增目的基因并克隆至pPROEXHTb质粒NcoⅠ /HindⅢ位点 ,经双酶切及序列测定筛选阳性克隆 ,IPTG诱导工程菌后以SDS PAGE电泳鉴定目的蛋白的表达情况 ,并测定其抗原性和生物学活性 ,结果成功构建了工程菌Top10F’[hIL 2 /IFN γ],经优化表达条件后 ,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的 30 % ,分子质量约为 34ku .ELISA和Western blot实验结果表明 ,目的蛋白能特异性结合抗IFN γ 抗体 ,呈阳性反应 ,生物学活性测定显示其IL 2和IFN γ 比活性分别为 1 7× 10 7U/mg与 3 2× 10 6 U/mg . 展开更多
关键词 白细胞介素-2 干扰素-1 嵌合基因 表达 大肠杆菌
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人γ-干扰素研究进展 被引量：1
6
作者 夏行权 《安徽电子信息职业技术学院学报》 2005年第5期73-74,共2页
本文不仅综述了人γ-干扰素(hIFN-γ)分子结构的多态性,而且简介了表达载体的构建、表达和表达产物的纯化等技术方法,并对现存的问题和前景作了简要分析。
关键词 人γ-干扰素(hifn-γ) cDNA序列多态性 突变体 包涵体 融合蛋白 γ-干扰素 IFN-γ 分子结构 表达载体 技术方法 表达产物 多态性
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重组人γ-干扰素表达菌株的构建 被引量：3
7
作者 许崇利 胡静涛 许崇波 《中国兽药杂志》 2011年第1期16-19,共4页
从健康人外周血分离单核细胞,并提取总RNA,利用RT-PCR扩增出hIFN-γ基因。构建了重组表达菌株BL21(DE3)(pET32a(+)-hIFN-γ)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pET32a(+)-hIFN-γ含有hIFN-γ基因,且基因序列和阅读框架正确。经W... 从健康人外周血分离单核细胞,并提取总RNA,利用RT-PCR扩增出hIFN-γ基因。构建了重组表达菌株BL21(DE3)(pET32a(+)-hIFN-γ)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pET32a(+)-hIFN-γ含有hIFN-γ基因,且基因序列和阅读框架正确。经W estern blot鉴定证实为hIFN-γ,并实现了在大肠杆菌中的高效表达。表达产物占菌体总蛋白的52%。同时对其抗病毒活性进行了测定,从而为hIFN-γ的生物活性和生产工艺研究提供了可靠的试验数据。 展开更多
关键词 大肠杆菌 hifn-γ基因 反转录聚合酶链反应 基因表达 纯化
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IFN-γ基因修饰的骨髓基质细胞体外抗白血病作用的实验研究
8
作者 李晓青 黄文林 +3 位作者 徐海鹏 陈晓勤 耿其容 吕跃 《广东药学院学报》 CAS 2005年第3期307-311,共5页
目的研究重组人IFNγ腺病毒(Ad/hIFNγ)在CML病人骨髓基质细胞(BMSCs)中的转染效率、IFNγ表达,并进一步观察转染Ad/hIFNγ的骨髓基质细胞体外抗白血病细胞株K562增殖和诱导K562细胞凋亡的作用。方法以Ad/hIFNγ重组腺病毒按感染复数(M... 目的研究重组人IFNγ腺病毒(Ad/hIFNγ)在CML病人骨髓基质细胞(BMSCs)中的转染效率、IFNγ表达,并进一步观察转染Ad/hIFNγ的骨髓基质细胞体外抗白血病细胞株K562增殖和诱导K562细胞凋亡的作用。方法以Ad/hIFNγ重组腺病毒按感染复数(MOI)为50转染CML病人骨髓基质细胞,RTPCR、ELISA及Westernblot分别检测转染Ad/hIFNγ的人骨髓基质细胞(BMSCs)中IFNγmRNA和IFNγ的表达;转染Ad/hIFNγ的骨髓基质细胞与K562细胞共培养,通过绘制K562细胞生长曲线分析其对K562细胞增殖的影响;并进一步通过流式细胞学分析其对K562细胞周期的影响和诱导凋亡的作用。结果RTPCR、Westernblot及ELISA方法都分别检测到转染Ad/hIFNγ的人骨髓基质细胞(BMSCs)中IFNγmRNA和IFNγ的表达;与对照组相比,转染Ad/hIFNγ的人骨髓基质细胞的实验组具有明显的抑制K562细胞增殖的作用(P=0.000),在细胞周期G1期的K562细胞比例明显增加,而S期K562细胞比例显著下降(P<0.01),并显著诱导K562细胞的凋亡(P<0.01)。结论Ad/hIFNγ转染人骨髓基质细胞后可获得IFNγ有效的表达,并在体外能有效地发挥抗白血病细胞作用。 展开更多
关键词 Ad/hifn-γ 骨髓基质细胞 基因治疗 IFN-γ
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新型的病毒-基因治疗系统CNHK500-hγ的构建 被引量：2
9
作者 孙立臣 张柏和 +3 位作者 苏长青 李根丛 吴孟超 钱其军 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期57-59,共3页
目的研制出一种新的基因-病毒治疗系统。方法通过基因操作技术将主要晚期启动子(MLP)调控的人干扰素-γ基因插入腺病毒E1A基因受hTERT启动子调控、E1B基因受HRE启动子调控的增殖病毒载体质粒PXC70-HRE-TP的E1A上游,得到腺病毒质粒pSG50... 目的研制出一种新的基因-病毒治疗系统。方法通过基因操作技术将主要晚期启动子(MLP)调控的人干扰素-γ基因插入腺病毒E1A基因受hTERT启动子调控、E1B基因受HRE启动子调控的增殖病毒载体质粒PXC70-HRE-TP的E1A上游,得到腺病毒质粒pSG500-hγ。通过pSG500-hγ与质粒pBHGE3在293细胞中同源重组得到重组病毒CNHK500-hγ。用TCID50方法测定病毒滴度。通过增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力。利用ELISA法检测人干扰素-γ抗癌基因的表达。结果CNHK500-hγ的病毒滴度为4×109pfu/ml,增殖实验结果证实CNHK500-hγ可以选择性地在端粒酶阳性的肝癌细胞中增殖,CNHK500-hγ所携带的人干扰素-γ基因在肝癌细胞株中的表达量(442μg/L)明显高于携带该基因的非增殖型腺病毒载体(120μg/L)Ad-hγ(P<0.005)。结论CNHK500-hγ是一种具备治疗肝癌潜力的新型基因-病毒治疗系统。 展开更多
关键词 病毒-基因治疗系统 CNHK500-hγ 干扰素-γ 抗癌基因 肝癌
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人γ干扰素的高效表达 被引量：1
10
作者 许崇利 谢莹 +1 位作者 许崇波 于洪雪 《中国兽药杂志》 2010年第11期17-21,共5页
采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含hIFN-γ基因的重组质粒,SDS-PAGE检测不同条件下hIFN-γ基因的表达情况,用Western blot和亲和层析对表达产物进行鉴定和纯化,并对表达条件进行优化。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实重组质粒pET32a(+)-hI... 采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含hIFN-γ基因的重组质粒,SDS-PAGE检测不同条件下hIFN-γ基因的表达情况,用Western blot和亲和层析对表达产物进行鉴定和纯化,并对表达条件进行优化。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实重组质粒pET32a(+)-hIFN-γ含有hIFN-γ基因且阅读框架正确,以IPTG诱导hIFN-γ基因表达的优化条件是:培养基pH7.0,培养温度37℃,IPTG浓度0.8 mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时hIFN-γ蛋白表达量为52%。从而实现了hIFN-γ基因的高效表达并优化了其表达工艺。从而为hIFN-γ的生物活性和生产工艺研究提供了可靠的试验数据。 展开更多
关键词 大肠杆菌 hifn-γ基因 基因表达 优化
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