水稻白化转绿基因对农艺性状和外观米质的影响 被引量：20

1

作者 张毅 吕俊 +6 位作者 李云峰 杨昆 沈福成 张巧玲 彭其莲 周亚林 何光华 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期284-289,共6页

在籼粳交后代中发现一个表现白化转绿(green-revertible albino)的变异材料,通过连续多代选留杂合株,最终育成一对白化转绿近等基因系Gra和gra。用120个InDel标记进行的多态性分析表明Gra和gra的近等性良好。通过比较近等基因系间叶绿... 在籼粳交后代中发现一个表现白化转绿(green-revertible albino)的变异材料,通过连续多代选留杂合株,最终育成一对白化转绿近等基因系Gra和gra。用120个InDel标记进行的多态性分析表明Gra和gra的近等性良好。通过比较近等基因系间叶绿素含量、农艺性状、外观米质发现,白化转绿基因gra(t)直接降低4叶1心期叶绿素含量近半,使苗期叶色失绿,间接影响移栽期白根数、出叶速度、分蘖能力,最终使有效穗降低,单株产量降低过半;近等基因系间,叶片长宽差异有的显著有的不显著,株高、穗实粒数、结实率、千粒重未受明显影响;白化转绿基因对米粒长、宽和垩白率无显著影响。 展开更多

关键词 水稻 白化转绿基因 近等基因系 农艺性状 外观米质 多态性分析

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金黄色葡萄球菌调节基因mgrA高表达对苯唑西林耐药性的影响 被引量：12

2

作者 连建奇 崔龙洙 平松启一 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第7期603-609,共7页

目的观察金黄色葡萄球菌调节基因mgr高表达对苯唑西林耐药性的影响。方法用PCR方法从金黄色葡萄球菌N315的染色体中扩增包括mgrA基因的片段(717 bp),克隆到温敏穿梭载体pYT3的BamHⅠ位点,将所构建的载体pYT641电转化导入受体,同时利用... 目的观察金黄色葡萄球菌调节基因mgr高表达对苯唑西林耐药性的影响。方法用PCR方法从金黄色葡萄球菌N315的染色体中扩增包括mgrA基因的片段(717 bp),克隆到温敏穿梭载体pYT3的BamHⅠ位点,将所构建的载体pYT641电转化导入受体,同时利用同源重组技术敲除mgrA基因,观察高表达株N315(pYT641)和基因敲除株N315Δ641对苯唑西林耐药性的变化程度;利用高压液相技术分析mgrA基因高表达和基因敲除对细菌细胞壁交联度的影响,RNA印迹杂交进一步分析mgrA基因对细菌耐药相关基因和细菌毒力调节基因、细菌毒力基因的影响。结果高表达株N315(pYT641)mgrA的表达量明显增加,最低抑菌浓度(MIC)测定表明高表达株N315(pTY641)对苯唑西林的敏感性比受体菌N315降低了16倍,MIC从8 mg／L增加到128mg/L,而基因敲除株N315△641的敏感性比受体菌N315增加了2倍;细菌细胞壁成分分析表明基因敲除株的细菌细胞壁交联度明显降低,提示mgrA基因可能影响细菌细胞壁的合成;RNA印迹分析表明mgrA基因不仅可使sigB和agrA基因高表达,而且影响细菌毒力基因spa和细胞壁合成相关基因pbp4、fmtB的表达。结论mgrA可能是除agrA、sarA、sigB外一个新的影响细菌耐药水平的调节基因。 展开更多

关键词 金黄色葡萄球菌 mgra基因 高表达 苯唑西林耐药性

原文传递

弓形虫SAG1、GRA2单基因疫苗及SAG1-GRA2复合基因疫苗的免疫效果观察 被引量：4

3

作者 李首庆 古钦民 +1 位作者 杨广民 马寅芙 《中国实验诊断学》 2008年第10期1219-1222,共4页

目的检测SAG1和GRA2基因编码的单基因及复合基因疫苗诱导小鼠的免疫应答,评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果。方法大量制备pcDNA3.1-SAG1、pcDNA3.1-GRA2、pcDNA3.1-SAG1-GRA2真核表达重组质粒,肌内注射BALB/c小鼠,分别于2周、4周后... 目的检测SAG1和GRA2基因编码的单基因及复合基因疫苗诱导小鼠的免疫应答,评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果。方法大量制备pcDNA3.1-SAG1、pcDNA3.1-GRA2、pcDNA3.1-SAG1-GRA2真核表达重组质粒,肌内注射BALB/c小鼠,分别于2周、4周后加强免疫一次。另设立pcDNA3.1及PBS对照组。于3次免疫后4周作免疫指标测定(包括ELISA法测定小鼠血清IgG抗体及细胞因子IFN-γ、IL-4,MTT法测定小鼠淋巴细胞增殖能力及NK细胞杀伤活性),并观察弓形虫速殖子攻击感染后小鼠的生存时间。结果SAG1-GRA2组小鼠血清IgG抗体、IFN-γ、淋巴细胞增殖能力及NK细胞杀伤活性均高于SAG1及GRA2组(P<0.05);各组均未检测到IL-4;复合基因组小鼠生存时间较单基因疫苗组延长(P<0.01)。结论弓形虫SAG1-GRA2复合基因疫苗较SAG1、GRA2单基因疫苗具有更好的免疫保护性。 展开更多

关键词 弓形虫 SAG1 gra2 复合基因 疫苗

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弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因的克隆与表达 被引量：4

4

作者 林绮萍 吴少庭 +6 位作者 翁亚彪 张仁利 高世同 黄达娜 袁仕善 雷明军 潘晖榕 《中国人兽共患病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期500-503,共4页

目的 克隆和表达弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因。方法 根据GRA4基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因片段,插入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌JM109,经PCR、双酶切、测序验证后,将G... 目的 克隆和表达弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因。方法 根据GRA4基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因片段,插入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌JM109,经PCR、双酶切、测序验证后,将GRA4基因片段定向亚克隆到载体pGEX-4T-2中构建原核表达重组质粒pGEX-4T-2.GRA4,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE及Westem blot分析。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组GRA4蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pGEX-4T-2-GRA4重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 弓形虫 gra4 PCR 基因克隆 原核表达

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弓形虫GRA1基因在毕赤酵母菌中的表达、纯化与鉴定 被引量：3

5

作者 谢荣华 舒衡平 +4 位作者 范久波 蒋立平 谭逵 张琼 吴翔 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2008年第12期909-913,共5页

目的研究弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)在毕赤酵母菌中的表达,获得高效表达的具有生物学活性的目的蛋白。方法将已构建重组的pPIC9K-GRA1质粒转化入酵母菌GS115,筛选His+Muts表型转化子,摇瓶培养,1%甲醇诱导表达。表达产物经高效液相色谱... 目的研究弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)在毕赤酵母菌中的表达,获得高效表达的具有生物学活性的目的蛋白。方法将已构建重组的pPIC9K-GRA1质粒转化入酵母菌GS115,筛选His+Muts表型转化子,摇瓶培养,1%甲醇诱导表达。表达产物经高效液相色谱法纯化后,测定其生物学活性。结果诱导4d的蛋白表达量达到2.5g/L。SDS-PAGE显示表达蛋白的分子质量单位为24ku,Westernblot鉴定表达产物具有抗原性。表达蛋白经高效液相色谱纯化产物后纯度达到90%以上。结论弓形虫GRA1基因在毕赤酵母中成功分泌表达目的蛋白,表达产物具有抗原性。 展开更多

关键词 弓形虫 gra1 毕赤酵母 基因表达

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弓形虫GRA1基因的克隆与原核表达 被引量：3

6

作者 孙玲 刘慧颖 +3 位作者 李淑红 宫鹏涛 张西臣 宁静 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期631-635,共5页

目的:克隆并构建PET-28a-GRA1重组表达载体,转化入大肠杆菌E.coli BL21,诱导表达并鉴定,为进一步研究GRA1的生物学特性和免疫保护作用奠定实验基础。方法:根据GenBank中编码GRA1的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术扩增GRA1基... 目的:克隆并构建PET-28a-GRA1重组表达载体,转化入大肠杆菌E.coli BL21,诱导表达并鉴定,为进一步研究GRA1的生物学特性和免疫保护作用奠定实验基础。方法:根据GenBank中编码GRA1的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术扩增GRA1基因,插入原核表达载体PET-28a中,构建重组表达质粒PET-28a-GRA1,转化E.coli BL21,IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果:克隆的GRA1基因与GenBank收录的基因序列同源性为100%。对重组质粒进行酶切和PCR鉴定,获得573bp大小的目的基因片段,与预期结果相符,成功地构建了重组质粒PET-28a-GRA1。SDS-PAGE电泳分析表明重组蛋白条带的相对分子质量约为24 000,Western blotting显示重组蛋白能被鼠抗弓形虫血清识别。结论:成功获取GRA1基因,构建了PET-28a-GRA1重组质粒并获得了高效表达。 展开更多

关键词 gra1基因 原核表达载体 弓形虫 克隆 gral SDS-PAGE BLOTTING 重组表达载体

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杨扇舟蛾颗粒体病毒gra基因的分析 被引量：3

7

作者 张小霞 梁振普 +1 位作者 彭辉银 张忠信 《中国病毒学》 CSCD 2005年第6期660-663,共4页

本研究利用已知的颗粒体蛋白基因(granulin,gra)设计引物,通过PCR扩增得到ClanGV的gra基因。对 PCR结果序列分析表明,ClanGV的gra基因开放阅读框(ORF)全长747bp,共编码248个aa,预计编码的蛋白质 大小为29．3kDe。在启始密码子ATG上游-2... 本研究利用已知的颗粒体蛋白基因(granulin,gra)设计引物,通过PCR扩增得到ClanGV的gra基因。对 PCR结果序列分析表明,ClanGV的gra基因开放阅读框(ORF)全长747bp,共编码248个aa,预计编码的蛋白质 大小为29．3kDe。在启始密码子ATG上游-24bp处,有一个杆状病毒晚期启动子序列,ATAAG。有两个TATA 框,分别位于ATG上游的-26bp和-65bp位置。基于gra的同源分析和进化树分析表明,ClanGV和茶小卷叶蛾颗 粒体病毒(Adoxophyes orana granulovirus,AoGV)、苹果蠹蛾颗粒体病毒(Cydia pomonella granulovirus,CpGV)、 云杉卷叶蛾颗粒体病毒(Choristoneura fumiferana granulovirus,CfGV)、马铃薯块茎蛾颗粒体病毒(Phthorimaea operculella granulovirus,PoGV)的亲缘关系较近。利用提取的颗粒体蛋白免疫家兔,制备了抗体进行免疫杂交分 析,结果显示ClanGV除了与分月扇舟蛾颗粒体病毒(Clostera anastomosis L．granulovirus,CaLGV)的颗粒体蛋 白有较强的杂交信号外,与棉铃虫核多角体病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,HaNPV)多角体蛋 白也有明显的杂交带出现,与甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus,SeNPV)只有非常 微弱的杂交信号。 展开更多

关键词 ClanGV gra 基因

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弓形虫非同源性不同地理株的GRA1基因体外扩增片段的鉴定及比较研究 被引量：11

8

作者 贾雪梅 郭虹 +1 位作者 陈观今 郑焕钦 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 1999年第3期7-10,共4页

目的对弓形虫人源性RH株、人源性ZS_2株、猪源性CN株3个不同地理株的GRA1基因片段鉴定并比较异同。方法采用PCR技术和限制性内切酶技术，分别对弓形虫3株的GRA1基因片段进行体外扩增。扩增的目的基因片段分别用3种内切酶HindⅢ、HPaⅡ、... 目的对弓形虫人源性RH株、人源性ZS_2株、猪源性CN株3个不同地理株的GRA1基因片段鉴定并比较异同。方法采用PCR技术和限制性内切酶技术，分别对弓形虫3株的GRA1基因片段进行体外扩增。扩增的目的基因片段分别用3种内切酶HindⅢ、HPaⅡ、TaqⅠ进行单酶切鉴定、比较。结果从弓形虫3个分离株RH株、ZS_2株、CN标基因组DNA中扩增出785bp的GRA1基因片段。3个株的GRA1基因分别用3种内切酶酶切后，酶切片段与理论值相符。结论实验所用不同来源弓形虫分离株的GRA1基因扩增片段基本相同，且3种限制性内切酶酶切图诺基本一致，表明这3个分离株的GRA1基因高度保守。 展开更多

关键词 弓形虫 聚合酶链反应 gra1基因 克隆 重组

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弓形虫GRA1基因的体外扩增、克隆及鉴定 被引量：7

9

作者 贾雪梅 陈观今 +1 位作者 郭虹 郑焕钦 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2002年第3期17-19,9,共4页

目的　体外扩增弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA1基因 ,并构建真核表达质粒。方法　从接种了弓形虫RH株的小鼠腹水中收集、纯化速殖子 ,提取基因组DNA ;据已知的GRA1基因列 ,设计合成一对引物 ,并引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。应用PCR技术 ,... 目的　体外扩增弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA1基因 ,并构建真核表达质粒。方法　从接种了弓形虫RH株的小鼠腹水中收集、纯化速殖子 ,提取基因组DNA ;据已知的GRA1基因列 ,设计合成一对引物 ,并引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。应用PCR技术 ,从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA1基因片段。扩增目的基因片段经纯化、双酶切后 ,插入真核表达质粒pEGFP -N3中 ,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 ,于卡那霉素阳性LB平板上筛选阳性克隆。重组子经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切、PCR鉴定。结果　从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出 785bp的GRA1基因片段 ,构建重组质粒pEGFPN3-GRA1,酶切和PCR鉴定产物大小均与预期值相符。 结论　成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了GRA1基因 ,并构建了pEGFPN3-GRA1重组质粒。 展开更多

关键词 弓形虫 致密颗粒抗原1 聚合酶链反应 基因克隆 gra1基因

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基于GRA-GEP的爆破峰值速度预测 被引量：8

10

作者 陈秋松 张钦礼 +2 位作者 陈新 肖崇春 姜群 《中南大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2016年第7期2441-2447,共7页

针对在爆破施工中爆破振动危害严重、爆破振动峰值速度难以预测的问题,通过灰色关联度理论和My Eclipse开发工具,建立基于灰色关联度分析(GRA)和基因表达式编程算法(GEP)的GRA-GEP爆破峰值速度预测模型。以湖北铜录山现场露天台阶爆破... 针对在爆破施工中爆破振动危害严重、爆破振动峰值速度难以预测的问题,通过灰色关联度理论和My Eclipse开发工具,建立基于灰色关联度分析(GRA)和基因表达式编程算法(GEP)的GRA-GEP爆破峰值速度预测模型。以湖北铜录山现场露天台阶爆破实测数据进行模拟预测,通过灰色关联度分析,认为最大段药量、总装药量、水平距离、高程差、前排抵抗线长度、测点与最小抵抗线方向夹角等与爆破峰值速度存在相关性,进而为了实现爆破峰值速度进行预测,根据GEP计算思路,采用My Eclipse软件进行Java语言编程模拟运算。研究结果表明:GRA-GEP模型预测结果最大相对误差为14.4%,平均相对误差为7.8%,远低于萨道夫斯基经验公式(平均相对误差30.6%)与BP神经网络预测模型(平均相对误差13.3%)。 展开更多

关键词 爆破振动 爆破峰值速度 灰度关联度分析(gra-GEP) 基因表达式编程算法 预测

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弓形虫GRA4基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究 被引量：8

11

作者 林绮萍 吴少庭 +8 位作者 翁亚彪 高世同 张仁利 黄达娜 袁仕善 雷明军 温见翔 潘晖榕 秦莉 《中国寄生虫病防治杂志》 CSCD 2005年第3期180-183,共4页

目的用pVACGRA4真核表达重组质粒免疫小鼠,观察诱导的免疫应答及对弓形虫感染的保护作用。方法大量制备pVACGRA4真核表达重组质粒,经基因枪腹部皮内注射免疫BALB/c小鼠3次,以pVAC空质粒及不经任何处理的空白组为对照。于末次免疫4周后... 目的用pVACGRA4真核表达重组质粒免疫小鼠,观察诱导的免疫应答及对弓形虫感染的保护作用。方法大量制备pVACGRA4真核表达重组质粒,经基因枪腹部皮内注射免疫BALB/c小鼠3次,以pVAC空质粒及不经任何处理的空白组为对照。于末次免疫4周后作免疫指标测定(包括MTT法测定小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性、间接免疫荧光法测定T淋巴细胞亚群数目、双夹心ELISA法测定细胞因子IFNγ及IL4含量、间接ELISA法测定IgG抗体滴度),并观察攻毒试验后小鼠存活情况。结果脾淋巴细胞增殖各组间差异无显著性(P>0.05);pVACGRA4组CD4+T细胞百分率无明显变化(P>0.05),CD8+T细胞百分率明显增加(与pVAC对照组比较P<0.05,与空白对照组比较P<0.01),CD4+/CD8+比值也较空白对照组明显降低(P<0.01);pVACGRA4免疫组IFNγA值比对照组略高,但差异无显著性(P>0.05),IL4A值各组间无明显变化(P>0.05);pVACGRA4组可诱导产生特异性IgG抗体,但滴度不高;pVACGRA4免疫组小鼠存活率显著高于两对照组,死亡小鼠的平均存活时间延长(与空白对照组比较P<0.05)。结论用pVACGRA4重组质粒DNA免疫小鼠,可诱导产生以细胞免疫为主的免疫应答及对弓形虫攻击感染的部分保护作用。 展开更多

关键词 弓形虫 gra4 DNA免疫 小鼠

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弓形虫致密颗粒蛋白14基因的克隆及序列分析 被引量：7

12

作者 陈锐钊 张念章 +4 位作者 聂子雄 周东辉 袁子国 林瑞庆 朱兴全 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期238-242,共5页

为研究弓形虫致密颗粒蛋白14(GRA14)基因的遗传变异规律,以来自不同宿主及地理来源的9株弓形虫DNA为模板,分别用PCR扩增了其GRA14基因,并将PCR产物克隆到pMD18-T载体后测序。利用生物信息学软件分析了GRA14基因的遗传变异并构建了系统... 为研究弓形虫致密颗粒蛋白14(GRA14)基因的遗传变异规律,以来自不同宿主及地理来源的9株弓形虫DNA为模板,分别用PCR扩增了其GRA14基因,并将PCR产物克隆到pMD18-T载体后测序。利用生物信息学软件分析了GRA14基因的遗传变异并构建了系统发育树,分析了GRA14蛋白的结构并结合抗原指数等参数预测了其抗原表位。结果表明,9个弓形虫虫株的GRA14基因长度均为1 227bp,序列的A+T含量在46.94%～47.43%之间,与弓形虫ME49株相应序列的核苷酸变异率在0.08%～0.73%之间;系统发育树分析显示,GRA14仅能将基因Ⅰ型虫株聚在一个分支上,但其他基因型虫株的聚类没有规律。蛋白二级结构和抗原表位预测结果表明,GRA14蛋白经过3次跨膜,主要由6个α-螺旋、3个β折叠、11个β转角和若干个无规则卷曲构成,并预测有4个B细胞抗原表位。表明GRA14蛋白可以作为抗弓形虫病疫苗候选分子研制弓形虫病亚单位疫苗及表位疫苗。 展开更多

关键词 弓形虫 gra14基因 克隆 序列分析 B细胞抗原表位

原文传递

刚地弓形虫GRA3基因的克隆与表达 被引量：5

13

作者 陈媛媛 张守发 +2 位作者 于龙政 常巧呈 薛书江 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期21-25,共5页

采用PCR方法扩增弓形虫GRA3基因,将扩增产物与pMD18-TSimple载体连接,重组质粒经PCR、双酶切鉴定后测序;构建pGEX-4T-1/GRA3表达载体,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,克隆的GRA3基因片段长687bp,含有1个66... 采用PCR方法扩增弓形虫GRA3基因,将扩增产物与pMD18-TSimple载体连接,重组质粒经PCR、双酶切鉴定后测序;构建pGEX-4T-1/GRA3表达载体,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,克隆的GRA3基因片段长687bp,含有1个669bp的开放阅读框,编码222个氨基酸,与GenBank中UK株(AF414079)的同源性为99.8%;表达的融合蛋白为50Ku,能被弓形虫阳性血清识别;表明该融合蛋白具有较好的免疫反应活性。 展开更多

关键词 弓形虫 gra3基因 克隆 表达

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弓形虫GRA6抗原基因的克隆与表达 被引量：5

14

作者 朱翔 丁天 +2 位作者 陆惠民 张惠琴 黄伟达 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2003年第2期50-54,共5页

目的　在大肠杆菌中高效表达弓形虫抗原GRA6。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)从弓形虫昆山分离株和RH株总DNA中分别扩增到编码GRA6的基因 ,经DNA序列分析后导入表达载体PGEX - 5X - 3 ,然后在大肠杆菌BL2 1 -CodonPlus(DE3) -RP中进行表... 目的　在大肠杆菌中高效表达弓形虫抗原GRA6。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)从弓形虫昆山分离株和RH株总DNA中分别扩增到编码GRA6的基因 ,经DNA序列分析后导入表达载体PGEX - 5X - 3 ,然后在大肠杆菌BL2 1 -CodonPlus(DE3) -RP中进行表达 ,以SDS -PAGE和Westenblotting进行鉴定 ,用GST亲和层析柱纯化表达产物。 结果　 1 在我们所比较的 336个碱基中 ,弓形虫昆山分离株与RH株之间碱基基本一致。 2 得到一分子量为 49kDa的融合蛋白 ,占大肠杆菌总蛋白的 2 5 55 % ,通过Westenblotting证实 ,该重组抗原能被弓形虫感染的人特异性IgM和IgG血清所识别。 结论　 1 弓形虫昆山分离株和RH株的GRA6基因片段几乎完全一致 ;2 在大肠杆菌中得到了高效表达的融合蛋白 ;3 该重组抗原能被弓形虫感染的人特异性IgM和IgG血清所别 。 展开更多

关键词 弓形虫 gra6抗原基因 克隆 表达 聚合酶链反应

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弓形虫致密颗粒蛋白基因的表达及其重组蛋白免疫反应性的评价 被引量：6

15

作者 郑斌 余南 +3 位作者 李卓雅 郑焕钦 何蔼 詹希美 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第2期119-121,114,共4页

目的将克隆入pGEX-4T-1的致密颗粒蛋白基因进行表达并对表达产物的免疫反应性进行评价。方法将重组表达质粒pGEX-4T-1/GRA7转入大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导进行SDS变性蛋白质电泳,分别以Anti-GSTAntibody、免抗弓形虫阳性血清和人抗弓形... 目的将克隆入pGEX-4T-1的致密颗粒蛋白基因进行表达并对表达产物的免疫反应性进行评价。方法将重组表达质粒pGEX-4T-1/GRA7转入大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导进行SDS变性蛋白质电泳,分别以Anti-GSTAntibody、免抗弓形虫阳性血清和人抗弓形虫阳性血清为一抗进行WesternBlot分析。用GSTrapFFHiTrapaffinitycolumns纯化重组蛋白,以此蛋白作为包被抗原,BLISA法检测抗弓形虫阴性、阳性血清。结果SDS变性蛋白质电泳显示在43KDa～66KDa蛋白条带之间有特异蛋白的表达,蛋白分子量大小与理论值相符。WesternBlot分析表明该重组蛋白为GST融合蛋白,且该蛋白能被人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清所识别。ELISA结果表明该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清特异结合,而与抗弓形虫阴性血清无反应。结论弓形虫致密颗粒蛋白基因在大肠埃希菌中得到表达;该重组蛋白具有良好的免疫反应性。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 致密颗粒蛋白7 基因表达 免疫反应性 酶联免疫吸附试验

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实时荧光定量PCR检测弓形虫GRA6基因方法的建立和应用 被引量：4

16

作者 彭武丽 季新成 +1 位作者 史茜 于学辉 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期170-177,共8页

【目的】在建立快速且准确检测牛弓形虫病的实时荧光定量PCR方法,以进一步研究该病对奶牛的感染情况,为临床诊断与防控提供依据。【方法】以已发表的牛弓形虫GRA6基因作为检测弓形虫病的目的基因,对上述基因各设计一对引物和一条Taqman... 【目的】在建立快速且准确检测牛弓形虫病的实时荧光定量PCR方法,以进一步研究该病对奶牛的感染情况,为临床诊断与防控提供依据。【方法】以已发表的牛弓形虫GRA6基因作为检测弓形虫病的目的基因,对上述基因各设计一对引物和一条Taqman探针,该探针5'端用荧光基团JOE标记,3'端用Eclipse标记,进行单重荧光定量PCR。【结果】经反应条件的优化,建立了能够检测牛弓形虫GRA6基因的荧光定量PCR方法。该方法具有具有较好的特异性和可重复性,对GRA6基因的检测最低限为7×100copies/反应,是普通单重PCR的灵敏度的100倍。【结论】用该方法对58份临床样品进行检测,有12份样品存在弓形虫感染,阳性检出率为20.69%,可用来对弓形虫进行快速、准确的检测。 展开更多

关键词 弓形虫病 荧光定量PCR gra6基因

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刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA2全基因的原核重组表达 被引量：3

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作者 黄敏君 薛峰 +3 位作者 洪彩玲 孙岚 甘绍伯 谷俊朝 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2013年第12期1093-1095,1112,共4页

目的克隆弓形虫RH株致密颗粒蛋白2(GRA2)的全长基因,在大肠埃希菌工程菌中重组表达GST-HisGRA2融合蛋白。方法提取弓形虫总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增GRA2基因全长,与pET-41Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠埃希菌RosettaTM(DE3)... 目的克隆弓形虫RH株致密颗粒蛋白2(GRA2)的全长基因,在大肠埃希菌工程菌中重组表达GST-HisGRA2融合蛋白。方法提取弓形虫总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增GRA2基因全长,与pET-41Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠埃希菌RosettaTM(DE3)pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白,然后采用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白产物。结果 PCR鉴定弓形虫GRA2全基因重组表达质粒构建正确;诱导表达的GSTHis-GRA2融合重组蛋白分子质量单位为52ku,与预测值相符。结论本研究成功构建了弓形虫GRA2全基因重组蛋白质粒,该质粒能表达GRA2蛋白,为研究GRA2与宿主细胞的相互作用奠定了基础。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 致密颗粒蛋白gra2 反转录基因克隆 原核表达

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弓形虫GRA1基因核酸疫苗的实验研究 被引量：3

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作者 刘慧颖 孙玲 +3 位作者 李淑红 宫鹏涛 李建华 张西臣 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2012年第3期181-185,234,共6页

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA1基因的真核重组表达质粒,研究其在Hela细胞中的表达情况及其对动物弓形虫感染的免疫保护作用。方法以弓形虫总RNA为模板,利用设计合成的一对引物,通过RT-PCR方法体外扩增GRA1基因cDNA片段,构建pVAX1-GRA... 目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA1基因的真核重组表达质粒,研究其在Hela细胞中的表达情况及其对动物弓形虫感染的免疫保护作用。方法以弓形虫总RNA为模板,利用设计合成的一对引物,通过RT-PCR方法体外扩增GRA1基因cDNA片段,构建pVAX1-GRA1重组真核表达质粒,并将其转染Hela细胞,验证其在真核细胞中的表达;用pVAX1-GRA1真核表达质粒注射免疫小鼠,通过检测血清特异IgG水平及血CD4+、CD8+细胞百分率并观察弓形虫感染小鼠的存活时间,评价其免疫保护力。结果 PCR扩增出573bp的GRA1开放阅读框,成功构建重组表达质粒pVAX1-GRA1。用间接免疫荧光方法在重组质粒转染后的Hela细胞中检测到特异蛋白,Western blot证实该蛋白具有反应原性,SDS-PAGE检测该蛋白分子质量单位为24ku。用构建的核酸疫苗免疫小鼠,随着免疫次数的增加血清特异性IgG抗体滴度逐渐增加,CD4+与CD8+T淋巴细胞百分率与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。弓形虫RH速殖子攻击感染疫苗免疫组小鼠存活时间为(165±23.1)d,PBS对照组、pVAX1对照组分别为(144±16.3)d和(148±16.3)d,差异有统计学意义(P<0.05)。结论构建的真核表达质粒pVAX1-GRA1有一定的免疫保护性,为弓形虫基因疫苗的进一步研究奠定了基础。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 gra1基因 核酸疫苗

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弓形虫GRA3基因真核表达质粒的构建与鉴定 被引量：3

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作者 薛书江 张守发 栾杨 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2010年第6期132-135,共4页

以pGEX-GRA3为模板,经PCR扩增获得弓形虫GRA3基因,克隆于pMD-18T simple载体上。重组质粒经PCR鉴定、PstⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后测序分析,再将其定向插入真核表达载体pVAXⅠ,构建真核表达重组质粒pVAX-GRA3。经PCR和酶切鉴定后,将重组质... 以pGEX-GRA3为模板,经PCR扩增获得弓形虫GRA3基因,克隆于pMD-18T simple载体上。重组质粒经PCR鉴定、PstⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后测序分析,再将其定向插入真核表达载体pVAXⅠ,构建真核表达重组质粒pVAX-GRA3。经PCR和酶切鉴定后,将重组质粒pVAX-GRA3转染Hela细胞,然后进行RT-PCR检测。RT-PCR结果表明,检测到了目的基因的存在,说明pVAX-GRA3成功转入Hela细胞。 展开更多

关键词 弓形虫 gra3基因 真核表达 鉴定

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弓形虫GRA8基因真核表达重组质粒的构建、鉴定及测序 被引量：4

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作者 杨慧龄 肖建华 +3 位作者 刘彦 杨秋林 张愉快 刘传爱 《中华传染病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期324-326,共3页

目的　构建弓形虫RH株 pcDNA3 .1( + ) GRA8真核表达重组质粒 ,为进一步DNA免疫做准备。方法　用聚合酶链反应 (PCR)从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码致密颗粒蛋白(GRA8)的基因片段 ,纯化后重组入 pUC 19克隆载体 ,再经含IPTG ,XGal... 目的　构建弓形虫RH株 pcDNA3 .1( + ) GRA8真核表达重组质粒 ,为进一步DNA免疫做准备。方法　用聚合酶链反应 (PCR)从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码致密颗粒蛋白(GRA8)的基因片段 ,纯化后重组入 pUC 19克隆载体 ,再经含IPTG ,XGal氨苄培养基蓝白筛选 ,挑选白色克隆酶切 ,低溶点琼脂糖纯化 ,回收目的基因亚克隆入pcDNA3 .1( + ) ,经氨苄培养基过夜培养挑选 6个克隆提纯酶切 ,PCR鉴定和测序。结果　从RH株基因组DNA中扩增出特异的GRA 8基因片段 ,克隆成功pcDNA3 .1( + ) GRA 8重组质粒。测序表明GRA8这部分基因与GENEBANK相应基因序列完全一致。 展开更多

关键词 弓形虫 gra8基因 真核表达重组质粒 构建 鉴定 测序

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