神经营养因子3基因转染对庆大霉素性耳聋保护作用的实验研究 被引量：17

1

作者 邓志宏 王锦玲 +3 位作者 邱建华 刘顺利 王成济 杨安钢 《临床耳鼻咽喉科杂志》 CSCD 北大核心 2004年第4期231-233,T002,共4页

目的 :探讨阳离子脂质体介导的神经营养因子 3(NT3)基因转染对豚鼠庆大霉素性耳聋的保护作用。方法 :将携带外源性基因NT3的重组真核表达载体 pIRES2 EGFP NT3与阳离子脂质体复合物注入豚鼠耳蜗 ,术后给予庆大霉素肌肉注射 (12 0mg/kg)... 目的 :探讨阳离子脂质体介导的神经营养因子 3(NT3)基因转染对豚鼠庆大霉素性耳聋的保护作用。方法 :将携带外源性基因NT3的重组真核表达载体 pIRES2 EGFP NT3与阳离子脂质体复合物注入豚鼠耳蜗 ,术后给予庆大霉素肌肉注射 (12 0mg/kg) 14d ,分别于停药后 1d、2周进行听性脑干反应 (ABR)及畸变产物耳声发射 (DPOAE)测听并观察转染基因在耳蜗的表达和分布及耳蜗毛细胞受损情况。结果 :NT3组DP gram幅值降低较对照组明显减轻 ,ABR阈值升高亦无对照组显著 (P <0 .0 5 )。耳蜗基底膜FITC phalloidin染色见NT3组耳蜗毛细胞的缺失较对照组明显减轻。结论 :阳离子脂质体介导的NT3基因转染对豚鼠庆大霉素性耳聋具有一定程度的保护作用。 展开更多

关键词 神经营养因子3 基因转染 耳蜗 庆大霉素

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NT3基因转染对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响 被引量：6

2

作者 邓志宏 邱建华 +2 位作者 王锦玲 刘顺利 黄维国 《中华神经外科疾病研究杂志》 CAS 2004年第3期249-251,共3页

目的　通过神经营养素 3(NT3)基因转染的方法 ,了解NT3对耳蜗螺旋神经节细胞(SGC)生长的影响。方法　建立体外培养小鼠耳蜗螺旋神经节细胞的方法 ,并进行神经丝蛋白 (NF)免疫组化染色鉴定及受体酪氨酸激酶C(TrKC)免疫组化染色。利用阳... 目的　通过神经营养素 3(NT3)基因转染的方法 ,了解NT3对耳蜗螺旋神经节细胞(SGC)生长的影响。方法　建立体外培养小鼠耳蜗螺旋神经节细胞的方法 ,并进行神经丝蛋白 (NF)免疫组化染色鉴定及受体酪氨酸激酶C(TrKC)免疫组化染色。利用阳离子脂质体作为载体 ,将重组质粒 pIRES2 EGFP(增强型绿色荧光蛋白 ) NT 3瞬时转染耳蜗螺旋神经节细胞 ,观察转染后耳蜗螺旋神经节细胞的形态、数量等改变。结果　成功培养了小鼠耳蜗螺旋神经节细胞。NT3基因转染 4 8h后 ,荧光显微镜下见聚合分布的、胞体及轴突发出绿色荧光的螺旋神经节细胞 ,与未转染细胞相比 ,螺旋神经节细胞形态未见明显变化。继续培养 2周后 ,各实验组细胞的数量均减少 ,但NT3转染组细胞减少的数量低于空载体组及空白对照组。 展开更多

关键词 神经营养素-3 耳蜗 螺旋神经节细胞 基因转染

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IFITM1对结肠癌SW480细胞增殖和黏附的影响 被引量：4

3

作者 何敬东 张振书 +7 位作者 肖冰 周高速 张以洋 耿焱 张亚历 智发朝 赖祝胜 李旭 《第四军医大学学报》 北大核心 2005年第21期1932-1934,共3页

目的:研究干扰素诱导的跨膜蛋白1(IFITM1)对结肠癌细胞SW480增殖和异质黏附的影响.方法:构建pEGFP-C3/IFITM1重组质粒,重组质粒转染结肠癌细胞株SW480,G418筛选获得亚克隆细胞株,用激光共聚焦扫描检查绿色荧光蛋白.生长曲线法检测细胞... 目的:研究干扰素诱导的跨膜蛋白1(IFITM1)对结肠癌细胞SW480增殖和异质黏附的影响.方法:构建pEGFP-C3/IFITM1重组质粒,重组质粒转染结肠癌细胞株SW480,G418筛选获得亚克隆细胞株,用激光共聚焦扫描检查绿色荧光蛋白.生长曲线法检测细胞的增殖,细胞黏附实验检测细胞的黏附性.结果:pEGFP-C3/IFITM1重组质粒的测序序列与IFITM序列完全一致,重组质粒转染SW480细胞后,通过G418持续压力筛选获得亚克隆细胞株IFITM1/SW480.激光共聚焦显微镜检查结果显示表达的绿色荧光蛋白位于IF-ITM1/SW480的细胞膜上,提示转染后IFITM1正确表达.细胞生长曲线显示转染后的IFITM1/SW480细胞增殖活性比对照组增殖活性明显降低.IFITM1/SW480细胞黏附数30,60min分别为(3.93±0.08)×103和(6.10±0.21)×103,而对照组pEGFP-C3/SW480细胞黏附数30,60min分别为(4.61±0.25)×103,(7.17±0.22)×103,IFITM1/SW480细胞黏附数比对照组细胞黏附数显著降低(P<0.05).结论:IFITM1可抑制SW480细胞体外增殖和异质型黏附. 展开更多

关键词 膜白质类 细胞增殖 细胞黏附 基因转染

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人β防御素-2基因在SPC细胞中的转染表达 被引量：1

4

作者 雷撼 钱桂生 +2 位作者 梁永杰 黄桂君 吴国明 《同济大学学报（医学版）》 CAS 2006年第1期27-30,共4页

目的合成人β防御素-2(hum anβ-defensin-2,hBD-2)基因并构建其真核表达载体,转染SPC细胞,检测其表达,明确hBD-2重组载体的表达活性,为hBD-2基因转染和表达的研究奠定基础。方法根据Genebank中的hBD-2结构基因序列设计合成三条引物,用... 目的合成人β防御素-2(hum anβ-defensin-2,hBD-2)基因并构建其真核表达载体,转染SPC细胞,检测其表达,明确hBD-2重组载体的表达活性,为hBD-2基因转染和表达的研究奠定基础。方法根据Genebank中的hBD-2结构基因序列设计合成三条引物,用PCR延伸扩增的方法合成hBD-2基因,克隆入真核表达载体pLXSN;通过脂质体转染法将pLXSN-hBD-2导入SPC细胞,采用W estern-b lot法检测hBD-2的表达。结果经凝胶电泳及测序分析,证实合成的基因与原序列一致,并成功克隆到真核表达载体pLXSN上,所构建的真核表达重组载体pLX-SN-hBD-2转染SPC细胞后呈现有效表达。结论成功构建了PCR合成的hBD-2基因真核表达重组载体pLXSN-hBD-2,通过基因转染的方法导入SPC细胞并获得表达hBD-2,为进一步的动物转基因抗感染实验研究提供了依据。 展开更多

关键词 人Β防御素-2 基因合成 真核表达载体 基因转染

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鼠源性血管抑素基因转染对人肝癌细胞体内致瘤力的影响及新血管抑制作用 被引量：1

5

作者 吴静 张德新 +1 位作者 杨静华 樊代明 《中华消化杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第10期583-586,共4页

目的　研究血管抑素血管他丁 (angiostatin)基因转染人肝癌细胞系HCC772 1,对肿瘤细胞体外生长、周期分布、形态以及体内致瘤力的影响 ,探讨血管抑素的作用机制。方法　应用定向克隆技术构建鼠源性血管抑素血cDNA基因真核表达载体 pcDNA... 目的　研究血管抑素血管他丁 (angiostatin)基因转染人肝癌细胞系HCC772 1,对肿瘤细胞体外生长、周期分布、形态以及体内致瘤力的影响 ,探讨血管抑素的作用机制。方法　应用定向克隆技术构建鼠源性血管抑素血cDNA基因真核表达载体 pcDNA3 .1( + ) angio ,酶切鉴定和测序。采用脂质体基因转染技术将真核表达载体导入人肝癌细胞系HCC772 1,新霉素G4 18筛选抗性克隆 ,设置转染空载体细胞为阴性对照和未转染细胞为空白对照。通过RNA点杂交和流式细胞荧光免疫检测血管抑素的表达 ,测定细胞生长曲线 ,计算细胞倍增时间 ,流式细胞仪检测细胞周期分布。建立动物模型 ,观察转染前后肿瘤细胞致瘤力的改变。免疫组化检测肿瘤组织微血管密度 (MVD)和血管抑素体内表达。结果　成功构建带有碱基序列正确的血管抑素基因片段的重组真核表达载体 pcDNA3 .1( + ) angio。分别转染脂质体 /pcDNA3 .1( + ) angio和脂质体 /pcDNA3 .1( + )的实验组 ,HCC772 1肝癌细胞和阴性对照组经G4 18筛选 ,3 0d后均得到稳定的抗性细胞克隆 ,空白对照组在筛选 1周后全部死亡。实验组HCC772 1细胞在体内和体外均表达目的蛋白 ,而对照组细胞中无表达。与对照组相比 ,虽然实验组细胞在体外的生长速度和细胞周期分布未发生明显改变 ,但在体? 展开更多

关键词 血管生成 血管抑素 基因转染 肝癌细胞 肿瘤抑制

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携带人VEGF_(165)和ANG-1双基因的腺病毒载体的构建及目的基因的表达 被引量：2

6

作者 张金康 孟国林 +8 位作者 刘建 胡蕴玉 袁志 段春光 毕龙 白峰 黄鑫 禚文昆 李国臣 《中国矫形外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期312-315,共4页

[目的]构建并鉴定携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管生成素-1(ANG-1)双基因共表达重组腺病毒载体pAd-VIA。[方法]采用基因克隆技术克隆目的基因VEGF165、ANG-1基因,将得到的基因通过引入内部核糖体进入位点序列(IRES),亚克... [目的]构建并鉴定携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管生成素-1(ANG-1)双基因共表达重组腺病毒载体pAd-VIA。[方法]采用基因克隆技术克隆目的基因VEGF165、ANG-1基因,将得到的基因通过引入内部核糖体进入位点序列(IRES),亚克隆至含有报告基因EGFP的穿梭载体pTrack-CMV中,构建携带双基因的腺病毒穿梭载体pTrack-CMV-VIA。进而使用AdEasyTM腺病毒系统重组并包装腺病毒。通过绿色荧光蛋白(GFP)表达、酶联免疫吸附分析(ELISA)方法检测制备的腺病毒pAd-VIA感染的大鼠骨髓基质干细胞中外源基因VEGF165及Ang-1的表达。[结果]该重组腺病毒质粒经测序、酶切鉴定,证明基因序列正确。转染QBI-293A细胞后,可观察到GFP明显表达。重组合腺病毒载体pAd-VIA获得成功包装,扩增后病毒滴度为2×1010PFU/ml,大鼠骨髓基质干细胞转染48 h后,绿色荧光蛋白表达阳性,ELISA结果显示转染组在感染48 h后,培养细胞上清中的VEGF165浓度为(42.5±2.082)ng/105细胞,ANG-1浓度为(16.67±2.08)ng/105细胞,未转染组几乎未检测到外源基因的表达,有统计学差异(P<0.05)。[结论]成功构建携带人VEGF165、ANG-1双基因共表达重组腺病毒载体,为组织工程人工骨血管化的研究奠定基础。 展开更多

关键词 血管内皮细胞生长因子165 血管生成素-1 腺病毒载体 基因转染

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重组腺病毒载体Ad-LMP-1的构建及其转染MSC后成骨活性 被引量：2

7

作者 程志安 刘冬斌 +3 位作者 吴燕峰 黄霖 沈慧勇 刘尚礼 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期199-206,共8页

【目的】快速构建大鼠LIM矿化蛋白-1基因重组腺病毒载体,转染MSC,探讨LMP-1基因对MSC成骨分化和成骨活性的影响。【方法】从大鼠成骨细胞内提取总RNA,并设计LMP-1特异性引物进行RT-PCR,获取LMP-1基因后利用Invitrogen公司的TOPO定向克... 【目的】快速构建大鼠LIM矿化蛋白-1基因重组腺病毒载体,转染MSC,探讨LMP-1基因对MSC成骨分化和成骨活性的影响。【方法】从大鼠成骨细胞内提取总RNA,并设计LMP-1特异性引物进行RT-PCR,获取LMP-1基因后利用Invitrogen公司的TOPO定向克隆技术创建入门克隆pENTR/D-LMP-1。转化TOP10细菌后,挑取阳性克隆摇菌提取质粒,入门克隆再与表达载体pAD/CMV/V5-DEST进行同源重组反应得到病毒载体pAD/CMV/V5-LMP-1,转化细菌后挑选阳性克隆摇菌提取重组病毒质粒,用PacI内切酶线性化后用转染293A细胞后得到重组腺病毒载体。以腺病毒为载体,将大鼠LMP-1基因体外转染于3代大鼠MSC细胞内,检测LMP-1基因在MSC细胞的表达,分别观察转染后实验组与对照组I型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素表达变化以及骨钙结节的形成情况,评价LMP-1基因的成骨能力。【结果】成功获取大鼠LMP-1基因,入门质粒与病毒表达质粒经过酶切鉴定以及测序验证。LMP-1基因能在MSC中高效表达,转然后MSC的I型胶原,碱性磷酸酶、骨钙素的表达明显增强,骨钙结节形成增多。【结论】利用Gateway技术构建LMP-1重组腺病毒载体相对简单,可快捷获得的pAd-LMP-1。pAd-LMP-1转染MSC后,LMP-1基因能促进MSC向成骨细胞分化,增强其成骨作用。 展开更多

关键词 LIM-1矿化蛋白 间充质干细胞 成骨活性 基因转染

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血管生成素1和报告基因EGFP双基因共表达腺病毒的构建 被引量：2

8

作者 孟国林 段春光 +4 位作者 刘建 吕昌伟 杨旻 袁志 胡蕴玉 《第四军医大学学报》 北大核心 2008年第11期1002-1004,共3页

目的:构建并制备血管生成素-1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体.方法:采用基因克隆技术克隆目的基因ANG-1,并将得到的基因亚克隆至含有报告基因EGFP的穿梭载体pAdTrack-CMV;使用Padeasy-1腺病毒系统将含有目的基因的穿梭载体与腺病毒... 目的:构建并制备血管生成素-1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体.方法:采用基因克隆技术克隆目的基因ANG-1,并将得到的基因亚克隆至含有报告基因EGFP的穿梭载体pAdTrack-CMV;使用Padeasy-1腺病毒系统将含有目的基因的穿梭载体与腺病毒骨架质粒在细菌BJ5183中同源重组,产生重组腺病毒载体;线性化重组的腺病毒转染入QBI-293A细胞中对重组的腺病毒进行包装并扩增.结果:ANG-1基因与腺病毒穿梭载体连接成功,经Xho I/EcoR V双酶切后琼脂糖电泳可见在1.5kb处出现特异性条带,证明pAdTrack-CMV-ANG-1重组质粒构建成功;重组的穿梭载体与pAdeasy-1质粒重组后,产物经PacI酶切后琼脂糖电泳可见一大一小两个片段.大小约为30kb和4.5kb,与预期结果相符,证明重组腺病毒pAd-ANG-1-EGFP构建成功;线性化重组的腺病毒转染入QBI-293A细胞后包装成功.扩增后病毒滴度为2×1014v.g./L,EGFP活性检测腺病毒感染细胞阳性率在30%以上.结论:成功制备了pAd-ANG-1-EGFP腺病毒.为骨组织工程血管化的研究打下基础. 展开更多

关键词 血管生成素 腺病毒 基因转染 增强型绿色荧光蛋白

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重组肝细胞生长因子质粒的构建及对内皮祖细胞增殖的影响 被引量：2

9

作者 白江涛 姚晓静 +1 位作者 朱鹭 孙建辉 《中华全科医学》 2010年第11期1345-1346,共2页

目的构建一种携带人肝细胞生长因子(HGF)基因的表达质粒(pUDKH),探讨重组质粒对体外培养的成人外周血中内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)增殖的影响。方法用PCR方法从人胎盘cDNA文库扩增HGF基因,并将其克隆至病毒表达载体pL... 目的构建一种携带人肝细胞生长因子(HGF)基因的表达质粒(pUDKH),探讨重组质粒对体外培养的成人外周血中内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)增殖的影响。方法用PCR方法从人胎盘cDNA文库扩增HGF基因,并将其克隆至病毒表达载体pLenti6/V5-Dest,获得表达质粒pLenti-HGF。制备病毒,感染原代培养的内皮祖细胞,免疫组化分析其感染效率及上清中HGF的表达水平。MTT法检测感染病毒后对细胞增殖的影响。结果 pLenti-HGF病毒可有效感染体外培养的内皮祖细胞,表达HGF,并能促进内皮祖细胞的增殖。结论内皮祖细胞经病毒感染后可以表达hHGF,外源性hHGF基因能够刺激内皮祖细胞增殖。 展开更多

关键词 肝细胞生长因子 内皮祖细胞 基因转染

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人颊癌Bca CD_(885)细胞Fas表达水平与移植瘤形成和增殖的关系 被引量：1

10

作者 侯劲松 黄洪章 +2 位作者 王建广 潘朝斌 唐海阔 《临床口腔医学杂志》 2004年第5期270-272,共3页

目的 :研究Fas表达水平与人颊癌BcaCD885细胞移植瘤形成、增殖及凋亡的关系 ,探讨其相关机制。方法 :用脂质体将真核表达重组质粒pBK -Fas导入人颊癌BcaCD885细胞。转染 72h后 ,收集转染及未转染细胞 ,每组细胞分别接种 10只裸鼠。观察... 目的 :研究Fas表达水平与人颊癌BcaCD885细胞移植瘤形成、增殖及凋亡的关系 ,探讨其相关机制。方法 :用脂质体将真核表达重组质粒pBK -Fas导入人颊癌BcaCD885细胞。转染 72h后 ,收集转染及未转染细胞 ,每组细胞分别接种 10只裸鼠。观察移植瘤形成及增殖状况 ,绘制肿瘤生长曲线。实验结束采集肿瘤标本 ,称重 ,计算肿瘤生长抑制率。同时以RT -PCR检测两组移植瘤细胞FasmRNA表达 ,流式细胞仪检测移植瘤细胞凋亡、增殖和Fas蛋白表达。结果 :Fas转染组移植瘤形成时间平均延长 3 .4d ,各观察点移植瘤体积均小于未转染组 ,二者差异有显著性 (P <0 .0 1)。RT -PCR和流式细胞术检测显示 ,Fas转染上调FasmRNA表达 ,提高Fas蛋白阳性表达率、阳性表达强度和细胞凋亡指数 ,但不影响肿瘤细胞增殖指数。结论 :Fas基因转染抑制移植瘤形成和增殖与提高Fas表达、增加肿瘤细胞凋亡有关。 展开更多

关键词 口腔鳞状细胞癌 FAS基因 基因转染 细胞凋亡 增殖

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VEGF_(121)在哺乳动物细胞中的稳定表达 被引量：1

11

作者 唐浩 胡冬煦 +5 位作者 陈勇 夏昆 文娟 卿志荣 赵天力 杨进福 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 2004年第10期82-85,共4页

目的探讨pcDNA3.1-VEGF121质粒对哺乳动物细胞的表达和转染。方法将pcDNA3.1-VEGF121质粒用电转的方法导入CHO细胞中,G418筛选细胞克隆;通过RT-PCR,ELISA,Western-blot在转录水平和蛋白质水平上检测VEGF121在转基因CHO细胞中的表达;通... 目的探讨pcDNA3.1-VEGF121质粒对哺乳动物细胞的表达和转染。方法将pcDNA3.1-VEGF121质粒用电转的方法导入CHO细胞中,G418筛选细胞克隆;通过RT-PCR,ELISA,Western-blot在转录水平和蛋白质水平上检测VEGF121在转基因CHO细胞中的表达;通过内皮细胞增殖实验和血管通透性实验检测所表达的VEGF121的生物学活性。结果获得有G418抗性的CHO细胞克隆;RT-PCR扩增出一条大小约450bp的特异性泳带,测序结果与VEGF121mRNA一致;ELISA显示细胞培养上清的VEGF浓度约为8～22ng/ml;Western-Blot检测到大小为17KD的特异性蛋白质条带;内皮细胞增殖实验显示细胞培养上清具有促内皮细胞增殖作用;血管通透性实验显示细胞培养上清明显增加毛细血管通透性。结论pcDNA3.1-VEGF121质粒真核表达系统能在哺乳动物细胞中表达具有良好生物学活性的VEGF121蛋白。 展开更多

关键词 VEGF CHO细胞 转基因 基因表达

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粉尘螨变应原第2组分真核表达载体的构建及其在小鼠骨髓间充质干细胞中的表达 被引量：1

12

作者 卞勇华 俞黎黎 +2 位作者 黄思怡 史卫红 崔玉宝 《广西医学》 CAS 2017年第3期372-375,共4页

目的构建含粉尘螨变应原第2组分(Der f 2)基因真核表达载体,并观察其在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达。方法提取粉尘螨总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法扩增Der f 2基因,测序鉴定后将Der f 2基因克隆入pcDNA3.0质粒中,... 目的构建含粉尘螨变应原第2组分(Der f 2)基因真核表达载体,并观察其在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达。方法提取粉尘螨总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法扩增Der f 2基因,测序鉴定后将Der f 2基因克隆入pcDNA3.0质粒中,构建真核表达载体pcDNA3.0-Der f 2。将小鼠BMSCs分3组进行实验,包括pcDNA3.0-Der f2转染组、pcDNA3.0空质粒转染组及未转染组,分别利用RT-PCR、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Der f 2基因及蛋白在3组BMSCs中的表达。结果扩增的Der f 2基因序列与Gen Bank的参考序列完全一致,Der f 2基因正确克隆至真核表达载体pcDNA3.0中。转染BMSCs 48 h后,RT-PCR、Western blot检测结果显示,未转染组和pcDNA3.0空质粒转染组未检测到Der f 2基因表达,pcDNA3.0-Der f 2转染组检测到特异性条带,且大小与预期相符。结论 pcDNA3.0-Der f 2真核表达载体构建成功,Der f 2的mRNA和蛋白能在小鼠BMSCs中正确表达。 展开更多

关键词 粉尘螨 变应原 第二组分 骨髓间充质干细胞 真核表达载体 基因转染

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血管生成素-1基因重组腺病毒转染兔外周血血管内皮祖细胞的研究 被引量：1

13

作者 朱伯会 谢宇锋 +6 位作者 杨向军 杨吉成 韩莲花 李红霞 盛伟华 孙凌 吕海涛 《苏州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2011年第4期538-542,共5页

目的探讨重组腺病毒介导的血管生成素-1(Ang-1)基因转染兔外周血血管内皮祖细胞(EPCs)的方法及效果。方法从兔外周血中体外分离、扩增EPCs,采用免疫组织化学和荧光化学法鉴定EPCs,设EPCs细胞对照组(EPCs)、EPCs+Ad空病毒载体对照组(EPCs... 目的探讨重组腺病毒介导的血管生成素-1(Ang-1)基因转染兔外周血血管内皮祖细胞(EPCs)的方法及效果。方法从兔外周血中体外分离、扩增EPCs,采用免疫组织化学和荧光化学法鉴定EPCs,设EPCs细胞对照组(EPCs)、EPCs+Ad空病毒载体对照组(EPCs+Ad)及EPCs+Ad-Ang-1组(EPCs+Ad-Ang-1)。以携带Ang-1基因的重组腺病毒转染EPCs后,用荧光显微镜下观察转染效果,RT-PCR鉴定细胞内Ang-1基因在EPCs中的转录;ELISA法检测细胞培养上清中的Ang-1蛋白表达。结果 EPCs+Ad-Ang-1组镜下观察到大部分细胞呈现绿色荧光;RT-PCR鉴定证实EPCs细胞内的Ang-1转录;ELISA检测证实EPCs+Ad-Ang-1组细胞上清液中Ang-1的浓度高于EPCs组和EPCs+Ad组(均P<0.05)。结论腺病毒介导的Ang-1基因转染外周血EPCs可行。 展开更多

关键词 血管生成素-1基因 基因转染 内皮祖细胞

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反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响 被引量：1

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作者 邓志宏 黄维国 +3 位作者 邱建华 刘顺利 王锦玲 金明 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 2004年第18期73-75,78,共4页

目的观察反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响。方法克隆人VEGF基因,将VEGF-cDNA反向克隆到真核表达载体pcDNA3,构建反义VEGF表达载体pcDNA3-VEGF(-);利用阳离子脂质体载体,稳定转染人喉癌Hep-2细胞,并通过流式细胞仪检测,观... 目的观察反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响。方法克隆人VEGF基因,将VEGF-cDNA反向克隆到真核表达载体pcDNA3,构建反义VEGF表达载体pcDNA3-VEGF(-);利用阳离子脂质体载体,稳定转染人喉癌Hep-2细胞,并通过流式细胞仪检测,观察转染细胞细胞周期的改变,在透射电镜下观察转染细胞超微结构的改变;将转染细胞注入裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况。结果成功克隆了人VEGF基因,并构建了携带反义VEGF基因的真核表达载体pcDNA3-VEGF(-);将其稳定转染人喉癌Hep-2细胞,获得了稳定表达反义VEGF的细胞系,与正常Hep-2细胞相比,该细胞系细胞周期及超微结构均无明显改变;将转染细胞注入裸鼠皮下,与对照组相比,肿瘤的生长速度明显减缓。结论反义VEGF基因转染可以有效地抑制喉癌的生长。 展开更多

关键词 反义VEGF 基因转染 阳离子脂质体 喉癌

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NT-3基因转染对庆大霉素耳毒性的拮抗作用 被引量：1

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作者 邓志宏 王锦玲 +5 位作者 邱建华 刘顺利 黄晓峰 黄梅 王成济 杨安钢 《听力学及言语疾病杂志》 CAS CSCD 2006年第4期285-288,T0002,共5页

目的探讨NT-3基因转染对豚鼠庆大霉素耳中毒的保护作用。方法采用阳离子脂质体介导的方法,将携带外源性基因NT-3的重组质粒pIRES2-EGFP-NT-3与阳离子脂质体复合物10μl注入豚鼠左侧耳蜗(设为Ⅰ组),术后3d开始给予庆大霉素肌肉注射(120mg... 目的探讨NT-3基因转染对豚鼠庆大霉素耳中毒的保护作用。方法采用阳离子脂质体介导的方法,将携带外源性基因NT-3的重组质粒pIRES2-EGFP-NT-3与阳离子脂质体复合物10μl注入豚鼠左侧耳蜗(设为Ⅰ组),术后3d开始给予庆大霉素肌肉注射(120mg/kg),连续注射14d,分别于停药后1d、2w进行ABR及DPOAE测试,随即处死动物,耳蜗取材,观察耳蜗毛细胞受损情况,并在透射电镜下观察耳蜗传入神经超微结构改变。实验同时设空载体组(Ⅱ组)及正常对照组(Ⅲ组)。结果庆大霉素停药1d时,与正常对照组相比,空载体组DPOAE幅值显著下降(P<0.05),停药2w时,DPOAE幅值下降更显著,尤其在1、1.4及6kHz处幅值下降明显(P<0.05);NT-3转染组在停药1d时,仅高频DPOAE幅值下降(P<0.05),停药2w时,DPOAE幅值下降减缓(P>0.05);各实验组ABR阈值与DPOAE幅值改变相似;荧光显微镜下见庆大霉素停药1d时,NT-3转染组第一排外毛细胞出现部分缺失,庆大霉素停药2w时,第一排外毛细胞缺失加重,并出现少量第二、三排外毛细胞及个别内毛细胞的缺失;空载体组在庆大霉素停药1d时,即出现第一排外毛细胞严重缺失,少量第二、三排外毛细胞及个别内毛细胞的缺失,停药2w时外毛细胞缺失进一步加重;透射电镜下见庆大霉素停药1d时,空载体对照组Ⅰ型及Ⅱ型神经纤维轴索内微管排列出现紊乱,少量崩解,髓鞘板层结构尚可,Ⅰ、Ⅱ型神经元细胞胞体内偶可见少量髓鞘样结构,停药2w时,传入神经退行性改变明显加重,神经纤维崩解,神经元出现大量空泡化。而NT-3转染组在损伤的早期,传入性神经从末梢到神经元仅出现轻微的改变,在庆大霉素停药2w时,神经退行性改变略加重,但仍显著轻于对照组。结论阳离子脂质体介导的NT-3基因转染可减轻庆大霉素对豚鼠耳蜗外毛细胞、传入神经及螺旋神经节细胞的毒性作用。 展开更多

关键词 NT-3 基因转染 耳蜗 庆大霉素 传入神经

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阳离子聚合体介导MYOC基因真核表达载体体内转染研究

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作者 魏雁涛 卓业鸿 葛坚 《眼科》 CAS 2009年第6期385-387,共3页

目的探讨大鼠前房内注射阳离子聚合体/MY OC基因复合物转染小梁组织的有效性和安全性。设计实验研究。研究对象SD大鼠。方法用微量进样器将表达myocilin(MYOC)基因的重组质粒PCDNA3-MYOC与阳离子聚合体(PEI)的混合溶液20μl注射于SD大... 目的探讨大鼠前房内注射阳离子聚合体/MY OC基因复合物转染小梁组织的有效性和安全性。设计实验研究。研究对象SD大鼠。方法用微量进样器将表达myocilin(MYOC)基因的重组质粒PCDNA3-MYOC与阳离子聚合体(PEI)的混合溶液20μl注射于SD大鼠前房内,于注射后不同时间点(1、3、7、14 d)摘除眼球,进行病理切片HE染色、荧光免疫组织化学染色以及透射电镜观察。主要指标病理切片、荧光免疫组织化学染色以及透射电镜观察小梁组织的变化。结果病理切片HE染色未见小梁组织明显炎症细胞浸润以及结构改变;荧光免疫组织化学染色显示注射后1 d可见到眼组织荧光着色;于转染后3 d小梁网荧光强度明显增强,至14 d荧光渐消失;透射电镜证实小梁细胞内可见PEI/DNA颗粒,溶酶体增多。结论前房内注射阳离子复合体介导的DNA质粒可将外源性基因安全有效地转染入小梁网组织。 展开更多

关键词 基因转染:阳离子聚合体 MYOC基因 小梁网

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内皮型一氧化氮合酶基因在犬内皮细胞的转染和表达

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作者 薛冠华 张纪蔚 +1 位作者 张皓 张柏根 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期278-281,共4页

目的探讨转染内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因后内皮细胞(EC)的功能变化。方法采用脂质体法转染eNOS基因于实验犬EC;RT-PCR和免疫组化法检测转染效果;分别采用比色法和酶联免疫法检测细胞培养液一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)和vWF的浓... 目的探讨转染内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因后内皮细胞(EC)的功能变化。方法采用脂质体法转染eNOS基因于实验犬EC;RT-PCR和免疫组化法检测转染效果;分别采用比色法和酶联免疫法检测细胞培养液一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)和vWF的浓度;并观察转染细胞生长增殖情况。结果RT-PCR产物电泳和测序及免疫组化法检测证实转染效果满意;转染后EC培养液NOS和NO浓度在不同时间明显升高(120h分别为33.53和32.99),与正常组对比差异显著(P<0.05)。转染后细胞生长增殖和vWF含量无显著差异。结论通过脂质体法成功地将eNOS基因转染于实验犬EC;转染后eNOS基因在mRNA和蛋白质水平均高效表达;内皮细胞eNOS活性显著增强;转染后细胞生物学功能稳定。 展开更多

关键词 基因 基因转染 内皮细胞 内皮型一氧化氮合酶基因

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人LIM矿化蛋白-1重组腺病毒的成骨作用及其分子机制

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作者 王秀利 崔福爱 +3 位作者 殷力 王义生 蒋林栋 李邓 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期452-455,共4页

目的 利用pAdEasy腺病毒载体系统构建人LIM矿化蛋白-1（LMP-1）重组腺病毒,检测其在体外培养大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）的促成骨作用并分析其分子机制.方法 应用聚合酶链反应（PCR）法扩增出人LMP-1全长基因,插入pShuttle-IRES-hrGFP-... 目的 利用pAdEasy腺病毒载体系统构建人LIM矿化蛋白-1（LMP-1）重组腺病毒,检测其在体外培养大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）的促成骨作用并分析其分子机制.方法 应用聚合酶链反应（PCR）法扩增出人LMP-1全长基因,插入pShuttle-IRES-hrGFP-1中构建成腺病毒穿梭质粒pS-LMP-1-GFP,转化DH5a大肠杆菌,挑选细菌单克隆进行酶切鉴定和DNA测序;通过pS-LMP-1-GFP与质粒pAdEasy-1在BJ5183细胞中同源重组,得到携带人LMP-1基因的重组腺病毒载体（pAdLMP-1-GFP）.经PacⅠ酶切暴露两侧长末端重复序列,脂质体介导线性化质粒转染AD293细胞进行包装得到重组腺病毒Ad-LMP-1-GFP.以腺病毒为载体,将 人LMP-1 基因体外转染于第3代大鼠BMSCs内,检测LMP-1基因在BMSCs的表达,分别观察转染后实验组与对照组碱性磷酸酶活性变化,Western blot检测骨钙素（OCN）和β-连环蛋白（β-catenin）的表达,评价LMP-1 基因的成骨能力及其分子机制.结果 成功获取人LMP-1基因,并包装成重组腺病毒.LMP-1基因能在BMSCs 中高效表达,转染后BMSCs的碱性磷酸酶活性增强,与对照组比较P=0.000,分别为0.096、0.116、0.118、0.119（0.110±0.011）和 0.045、0.057、0.056、0.054（0.053±0.005）;骨钙素的表达显著升高,与对照组比较P=0.001,分别为0.661、0.767、0.651（0.693±0.064）和0.177、0.290、0.222（0.229±0.050）;β-catenin的表达明显增强,与对照组比较P=0.002,分别为0.841、0.806、0.867（0.838±0.030）和0.185、0.236、0.266（0.229±0.040）.结论 成功利用pAdEasy系统构建人LMP-1重组腺病毒载体,包装获得重组腺病毒.Ad-LMP-1-GFP转染BMSCs后,LMP-1基因能促进BMSCs向成骨细胞分化,并且可能通过β-catenin信号分子发挥作用. 展开更多

关键词 LIM-1矿化蛋白 间充质干细胞 成骨活性 基因转染

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PKB转染SHG44细胞辐射抗性机制的初步研究

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作者 刘芬菊 薛景 +2 位作者 孙志强 杨学琴 蒋亚齐 《中华放射医学与防护杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期441-443,共3页

目的 探讨通过抑制蛋白激酶B（PKB、AKT）活性增加辐射敏感性，从而证实PKB活性是诱导SHG44细胞辐射抗性的机制之一。方法采用电穿孔法将PKB基因[pCMV5．HA-m／p-PKBa（PKB）、pCMV5-HA-PKBα-DD（T308D／S473D）（PKBD）]转染SHG44细胞... 目的 探讨通过抑制蛋白激酶B（PKB、AKT）活性增加辐射敏感性，从而证实PKB活性是诱导SHG44细胞辐射抗性的机制之一。方法采用电穿孔法将PKB基因[pCMV5．HA-m／p-PKBa（PKB）、pCMV5-HA-PKBα-DD（T308D／S473D）（PKBD）]转染SHG44细胞；MTT法检测对照、PKB转染组及照射后各组细胞增殖率，激光共聚焦显微镜扫描技术观察对照、对照＋照射、PKB转染＋照射、PKBD转染＋照射组细胞凋亡及微细结构的变化；分析PKB转染的SHG44细胞增殖以及诱导凋亡的相关因素。结果含有外源性PKB的质粒成功转染了SHG44细胞并表达PKBmRNA，而对照组未见表达；转染后的SHG44细胞增殖率与对照组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）；60Coγ），线照射能诱导SHG44细胞凋亡，以细胞核形态变化为特征；PKB＋照射组SHG44细胞形态完整，偶见凋亡细胞；而PKBD＋照射与对照＋照射组相比凋亡更显著。结论PKB转染SHG44细胞能抵抗辐射诱导的细胞凋亡，证实PKB活性与SHG44细胞辐射抗性存在一定的相关性。 展开更多

关键词 辐射抗性:PKB/AKT基因 基因转染 SHG44细胞

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稳定表达人MAGE-1基因小鼠黑色素瘤细胞系的建立

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作者 李侠 隋延仿 +5 位作者 胡沛臻 司少艳 张秀敏 黄杨 马斌 葛伟 《现代肿瘤医学》 CAS 2006年第9期1051-1053,共3页

目的:构建真核表达载体,并在小鼠黑色素瘤B16细胞中稳定表达。方法:用PCR方法扩增质粒pUC19-MAGE-1中目的基因MAGE-1,连接到真核表达载体pCDNA3.1中,构建真核表达pCDNA3.1-MAGE-1,脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞。G418筛选阳性克隆(B1... 目的:构建真核表达载体,并在小鼠黑色素瘤B16细胞中稳定表达。方法:用PCR方法扩增质粒pUC19-MAGE-1中目的基因MAGE-1,连接到真核表达载体pCDNA3.1中,构建真核表达pCDNA3.1-MAGE-1,脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞。G418筛选阳性克隆(B16-MAGE-1),用RT-PCR和Western blot检测阳性克隆中mRNA和蛋白质的表达;分别以2×105个B16细胞和B16-MAGE-1接种于C57BL/6小鼠右侧背部皮下,观察B16-MAGE-1细胞的致瘤能力。结果:用PT-PCR与Western bolt分别在B16-MAGE-1细胞中检测到人MAGE-1基因的mNRA和蛋白质的表达,两组共20只小鼠均皮下成瘤,且肿瘤大小没有明显差异。结论:成功构建了真核表达载体pCDNA3.1-MAGE-1,获得了稳定表达人MAGE-1基因的小鼠黑色素瘤B16细胞系,并保持很好的致瘤能力,为研究MAGE家族在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了基础。 展开更多

关键词 黑色素瘤抗原 基因转染 肿瘤免疫治疗

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