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供体核种类对水牛核移植效果的影响 被引量:16
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作者 杨素芳 石德顺 +4 位作者 韩杰 韦英明 韦精卫 陆凤花 牛向丽 《广西农业生物科学》 CAS CSCD 2004年第3期233-237,共5页
采用电融合法和直接注射法进行核移植,以比较不同来源和不同类型水牛供体细胞的核移植效果。当用电融合法进行核移植时,成体耳部成纤维细胞的融合率(46.0%)、卵裂率(53.9%)和囊胚发育率(10.9%),均显著低于胎儿成纤维细胞(64.5%,70.1%和2... 采用电融合法和直接注射法进行核移植,以比较不同来源和不同类型水牛供体细胞的核移植效果。当用电融合法进行核移植时,成体耳部成纤维细胞的融合率(46.0%)、卵裂率(53.9%)和囊胚发育率(10.9%),均显著低于胎儿成纤维细胞(64.5%,70.1%和21.6%)、胎儿皮肤细胞(71.5%,70.8%和22.1%)以及卵巢颗粒细胞(88.2%,79.1%和25.5%);后三种细胞间的卵裂率和囊胚发育率无显著差异,但卵巢颗粒细胞的融合率显著高于胎儿成纤维细胞和胎儿皮肤细胞(P<0.05)。当用直接注射法进行核移植时,胎儿皮肤细胞注核后的存活率(78.2%)、卵裂率(41.6%)均显著低于成体耳部成纤维细胞(88.6%和57.4%)和胎儿成纤维细胞(85.8%和65.0%)。胎儿成纤维细胞注核后的卵裂率和囊胚发育率(23.3%)均显著高于胎儿皮肤细胞(10.1%)和成体耳部成纤维细胞(12.0%)。结果表明:(1)采用直接注核法进行核移植时,胎儿成纤维细胞作为核供体较为合适,而采用电融合法进行核移植时,用颗粒细胞作核供体更为适宜;(2)胎儿成纤维细胞的核移植效果好于成体成纤维细胞。 展开更多
关键词 水牛 卵母细胞 核移植 卵巢颗粒细胞 成体耳部成纤维细胞 胎儿成纤维细胞 胎儿皮肤细胞
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利用启动子缺陷型打靶载体敲除五指山小型猪GGTA1基因 被引量:16
2
作者 郑道山 冯冲 +4 位作者 朱彦宾 龙川 冯书堂 潘登科 马文丽 《生物技术通讯》 CAS 2011年第4期458-462,共5页
目的:获得α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)基因敲除的五指山小型猪胎儿,为异种器官移植研究提供基础平台。方法:以新霉素磷酸转移酶基因(neo)为筛选标记基因构建启动子缺陷型打靶载体,打靶载体线性化后用电转染法将其导入胎儿成纤维细胞中... 目的:获得α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)基因敲除的五指山小型猪胎儿,为异种器官移植研究提供基础平台。方法:以新霉素磷酸转移酶基因(neo)为筛选标记基因构建启动子缺陷型打靶载体,打靶载体线性化后用电转染法将其导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞经G418筛选后,用PCR法检测药物抗性的细胞克隆,对阳性细胞进行核移植构建重构胚胎及胚胎移植。结果:转染后,经筛选共得到176个具有G418抗性的细胞克隆,经PCR检测,其中2个细胞克隆发生了同源重组;以其中1个GGTA1+/-细胞克隆为供体细胞进行核移植,将重构胚移植到2头自然发情的受体母猪中,1头受体妊娠;第37 d将代孕母猪处死,获得2个胎儿,经PCR和Southern印迹鉴定,均为GGTA1单等位基因敲除胎儿。结论:构建了五指山小型猪GGTA1基因部分外显子4区域敲除的启动子缺陷型打靶载体,获得了GGTA1单等位基因敲除的胎儿,为培育GGTA1基因敲除的五指山小型猪奠定了基础。 展开更多
关键词 五指山小型猪 基因敲除 GGTA1基因 胎儿成纤维细胞
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猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞培养方法的研究 被引量:8
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作者 信吉阁 成文敏 +5 位作者 潘伟荣 卿玉波 查星琴 富国文 魏红江 曾养志 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第5期1-4,180,共5页
为了研究猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞的分离培养体系,根据取样组织的不同,筛选出最佳的培养方法,试验以猪胎儿和耳皮肤为试验材料,用4种不同的培养分离方法,即胰酶热消化法、胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法和组织块培养法... 为了研究猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞的分离培养体系,根据取样组织的不同,筛选出最佳的培养方法,试验以猪胎儿和耳皮肤为试验材料,用4种不同的培养分离方法,即胰酶热消化法、胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法和组织块培养法,分离培养猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞,对比培养效果,筛选出最佳的培养方法。结果表明:胰酶室温消化法分离的猪胎儿成纤维细胞存活率显著高于胰酶热消化法和胰酶冷热结合消化法(P<0.05),细胞贴壁效果好,且操作简单;猪耳皮肤成纤维细胞原代培养中,胰酶热消化法和胰酶室温消化法分离的细胞数量少,组织块培养法所需的组织量少,且较胰酶冷热结合消化法操作简单。试验中培养的细胞呈典型的成纤维细胞形态,生长曲线呈"S"型,经冻存复苏后生长状态良好,说明胰酶室温消化法是猪胎儿成纤维细胞较好的培养方法,胰酶热消化法和胰酶室温消化法是猪耳皮肤成纤维细胞原代培养的理想培养方法。 展开更多
关键词 胎儿成纤维细胞 耳皮肤成纤维细胞 培养方法
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不同来源的供体细胞对水牛体细胞核移植效果的影响 被引量:6
4
作者 陆凤花 石德顺 +6 位作者 谢英 韦英明 潘红平 韦精卫 卞桂华 成俊萍 王晓丽 《广西农业生物科学》 CAS CSCD 2005年第2期89-93,共5页
采用电融合方法,探讨不同来源的供体细胞对水牛核移植效果的影响。体外成熟培养22~24h的水牛卵母细胞,在含有5μg/mL细胞松弛素B的操作液中进行去核,然后将经0.1μg/mLAphidicolin(APD)+0.5%FBS培养2~9d的水牛不同来源的供体细胞,注... 采用电融合方法,探讨不同来源的供体细胞对水牛核移植效果的影响。体外成熟培养22~24h的水牛卵母细胞,在含有5μg/mL细胞松弛素B的操作液中进行去核,然后将经0.1μg/mLAphidicolin(APD)+0.5%FBS培养2~9d的水牛不同来源的供体细胞,注射到去核的卵母细胞卵周隙中,电融合形成重构胚。重构胚经5μmol/L离子霉素激活处理5min,并在2mmol/L的6-DMAP中培养3h后,在含有颗粒细胞单层细胞的微滴中培养7~9d,观察其卵裂和胚胎发育情况。结果发现,来自水牛胎儿耳部或腹部组织块的成纤维细胞用作供体细胞,其重组胚的融合率及体外发育能力差异不显著(P>0.05),且细胞培养方法(组织块法或酶消化法)对其核移植效果没有影响;来自编号011010的胎儿耳皮成纤维细胞重组胚的囊胚发育率显著高于来自编号030323和030410细胞(31.45%vs10.96%和14.49%,P<0.05),但它们的融合率、卵裂率无显著差异(P>0.05)。以上结果表明:经不同培养方法培养的细胞或来自身体不同部位的组织的成纤维细胞均可作为核移植研究的供体细胞,但是水牛体细胞核移植效果受供体的个体差异的影响。 展开更多
关键词 水牛 胎儿成纤维细胞 核移植 胚胎
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体细胞克隆太湖猪出生 被引量:5
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作者 宋光启 文江 +12 位作者 李占军 王凌燕 殷玉鹏 关继羽 唐博 谢光洪 孙博兴 郭昌明 韩春田 邓旭明 欧阳红生 赖良学 李子义 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期928-932,共5页
以中国太湖猪胎儿成纤维细胞为核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体,以杜洛克猪为代孕母猪,进行了太湖猪体细胞克隆技术的研究,成功地获得了首例体细胞克隆太湖猪仔猪。经微卫星DNA多态性鉴定,确定克隆猪来自供核细胞,与代孕母猪无亲缘... 以中国太湖猪胎儿成纤维细胞为核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体,以杜洛克猪为代孕母猪,进行了太湖猪体细胞克隆技术的研究,成功地获得了首例体细胞克隆太湖猪仔猪。经微卫星DNA多态性鉴定,确定克隆猪来自供核细胞,与代孕母猪无亲缘关系。本研究将为体细胞克隆技术在我国太湖猪育种、建立人类疾病模型等研究方面提供可行的技术方法。 展开更多
关键词 太湖猪 克隆猪 核移植 猪胎儿成纤维细胞
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牛胎儿成纤维细胞的培养及性别鉴定 被引量:5
6
作者 马忠辉 赵巧香 杨焕民 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2009年第4期19-21,共3页
为了探索和建立牛胎儿成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法,试验取自怀孕40d的奶牛胎儿耳组织用组织块贴附法进行原代培养和传代培养,用倒置相差显微镜观察成纤维细胞形态;根据牛Y染色体上的性别决定区域(SRY)基因序列设... 为了探索和建立牛胎儿成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法,试验取自怀孕40d的奶牛胎儿耳组织用组织块贴附法进行原代培养和传代培养,用倒置相差显微镜观察成纤维细胞形态;根据牛Y染色体上的性别决定区域(SRY)基因序列设计合成1对PCR引物作为性别鉴定引物,同时根据牛403bp的β-珠蛋白基因序列设计1对引物作为内参照引物,建立PCR反应体系进行性别鉴定。结果表明:分离的成纤维细胞可在体外快速贴壁生长、增殖;阳性对照和第1牛胎儿成纤维细胞系PCR鉴定扩增得到255bp的片段和403bp的β-珠蛋白基因片段,第2,3牛胎儿成纤维细胞系和母牛血液PCR扩增只得到403bp的β-珠蛋白基因片段,通过电泳证明PCR产物255bp的片段为SRY基因片段,说明有255bp扩增带的细胞系为雄性;无255bp扩增带的细胞系为雌性。结果说明该方法所获得的牛胎儿成纤维细胞可在体外稳定培养,利用PCR鉴定牛胎儿性别具有简单、快速、准确的特点,可应用于基因克隆动物研究中体细胞系的早期性别鉴定。 展开更多
关键词 成纤维细胞 细胞分离培养 性别鉴定
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猪血型PCR鉴定方法的建立
7
作者 王娇祥 王艳 +6 位作者 胡珂 徐凯祥 魏太云 角德灵 赵恒 赵红业 魏红江 《实验动物与比较医学》 CAS 2023年第6期585-594,共10页
目的异种器官移植是解决人类器官供体短缺的有效途径,但其面临严重的免疫排斥反应,包括血型差异导致的超急性排斥反应。建立稳定、便捷、可靠的猪血型鉴定方法,可快速筛选合适血型的供体猪用于异种器官移植研究。方法选择版纳微型猪近... 目的异种器官移植是解决人类器官供体短缺的有效途径,但其面临严重的免疫排斥反应,包括血型差异导致的超急性排斥反应。建立稳定、便捷、可靠的猪血型鉴定方法,可快速筛选合适血型的供体猪用于异种器官移植研究。方法选择版纳微型猪近交系、滇南小耳猪、巴马香猪为研究对象,用DNA提取试剂盒提取3种品系猪的血液、口腔颊黏膜和胎儿成纤维细胞中DNA,通过PCR法对猪ABO血型同源基因EAA第7号内含子附近的目标片段进行扩增。采用血液凝集反应检测猪前腔静脉全血加入抗A、B抗体后的溶血现象,采用免疫组织化学法检测猪心、肝、脾、肺、肾组织中A抗原表达水平,采用免疫荧光法检测猪口腔黏膜中A抗原表达水平。通过对比不同方法测定猪血型的结果,验证PCR方法的稳定性和可靠性,以此建立一种基于PCR的便捷式猪血型鉴定方法。结果首先,69头版纳微型猪近交系、7头滇南小耳猪和34头巴马香猪的血液PCR结果显示AO血型20头,AA血型66头,OO血型24头。47头滇南小耳猪的胎儿成纤维细胞PCR结果显示47个胎儿均为OO血型,其中8头基因编辑克隆猪的口腔黏膜PCR结果与供体胎儿成纤维细胞的PCR结果一致,均为OO血型;8头野生型猪(2头版纳微型猪近交系、4头滇南小耳猪和2头巴马香猪)的口腔黏膜PCR结果均与血液PCR鉴定结果一致。然后,从中随机挑选11头版纳微型猪近交系、4头滇南小耳猪和2头巴马香猪进行血液凝集反应验证,结果均与血液及口腔黏膜PCR鉴定结果一致。而且,对1头版纳微型猪近交系和2头巴马香猪的心、肝、肺、肾、脾组织进行免疫组织化学分析,结果与血液PCR鉴定和血液凝集反应结果相一致。最后,采集其中2头版纳微型猪近交系和1头巴马香猪的口腔黏膜样本进行免疫荧光检测,结果与血液PCR鉴定结果一致。结论通过采集胎儿细胞和活体猪的口腔黏� 展开更多
关键词 血型 PCR技术 异种器官移植 血液 胎儿成纤维细胞 口腔黏膜
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猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离培养及传代 被引量:4
8
作者 黄雅琼 王晓丽 +7 位作者 崔奎青 黄奔 卞桂华 谢体三 苏文昌 陆凤花 谭世俭 石德顺 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期255-259,共5页
对猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代进行了系统研究。结果显示,猪的卵丘细胞生长形成单层需要5~6d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10~11d和8~9d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可... 对猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代进行了系统研究。结果显示,猪的卵丘细胞生长形成单层需要5~6d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10~11d和8~9d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可以建立并获得稳定的细胞系,这些方法的应用可为猪体细胞核移植研究提供丰富的供体细胞。 展开更多
关键词 卵丘细胞 胎儿成纤维细胞 分离培养 传代培养
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水牛胎儿成纤维细胞体外培养体系的初步建立 被引量:3
9
作者 邵晓云 徐绍业 《四川动物》 CSCD 北大核心 2010年第2期288-291,共4页
为探讨适合水牛胎儿成纤维细胞(BFF)的体外培养体系,采用常规组织块法和胰蛋白酶消化法原代培养BFF均获得了较多的成纤维细胞,但后者所得细胞的活力不如前者高,且死细胞也较多;传代或冻存成纤维细胞时用4℃预冷的胰蛋白酶室温下消化所... 为探讨适合水牛胎儿成纤维细胞(BFF)的体外培养体系,采用常规组织块法和胰蛋白酶消化法原代培养BFF均获得了较多的成纤维细胞,但后者所得细胞的活力不如前者高,且死细胞也较多;传代或冻存成纤维细胞时用4℃预冷的胰蛋白酶室温下消化所得的细胞比37℃热消化的细胞更圆、更有光泽;跟踪32代的细胞冷冻复苏率均达70%~80%;染色体分析结果显示,二倍体细胞所占比例始终保持在80%~90%之间,各代细胞(5th、10th、15th)之间差异不显著(P>0.05)。结果表明,组织块法原代培养、4℃预冷胰蛋白酶室温消化传代细胞的培养体系比较适合水牛胎儿成纤维细胞的培养。 展开更多
关键词 水牛 胎儿 成纤维细胞 体外培养
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牛胎儿成纤维细胞分离与体外培养 被引量:2
10
作者 徐小明 窦忠英 +1 位作者 华进联 葛秀国 《中国畜牧杂志》 CAS 北大核心 2004年第10期18-21,共4页
本研究以 4 5d牛胎儿为材料 ,使用 0 .2 5 %胰酶 + 0 .0 4 %EDTA消化液 ,分离得到牛胎儿成纤维细胞 ,体外培养传代至第 2 8代。本实验描绘出牛胎儿成纤维细胞生长曲线 ,并发现α MEM是一种适合牛胎儿成纤维细胞生长的培养基。分离得到... 本研究以 4 5d牛胎儿为材料 ,使用 0 .2 5 %胰酶 + 0 .0 4 %EDTA消化液 ,分离得到牛胎儿成纤维细胞 ,体外培养传代至第 2 8代。本实验描绘出牛胎儿成纤维细胞生长曲线 ,并发现α MEM是一种适合牛胎儿成纤维细胞生长的培养基。分离得到的牛胎儿成纤维细胞传至第 1 8代时核型仍然正常 ,冷冻。 展开更多
关键词 畜牧 兽医科学基础学科 胎儿成纤维细胞 分离 体外培养
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西藏黄牛胎儿成纤维细胞的分离与培养 被引量:3
11
作者 任子利 赵彦玲 +2 位作者 王建洲 李瑜鑫 强巴央宗 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2011年第24期14896-14898,共3页
[目的]以西藏黄牛胎牛为材料,建立西藏黄牛胎儿成纤维细胞系,为在西藏特殊生境条件下高原物种的动物克隆及其他细胞生物学研究提供理想的生物学材料。[方法]对西藏黄牛胎儿成纤维细胞的分离和培养进行了研究。利用组织块法成功分离培养... [目的]以西藏黄牛胎牛为材料,建立西藏黄牛胎儿成纤维细胞系,为在西藏特殊生境条件下高原物种的动物克隆及其他细胞生物学研究提供理想的生物学材料。[方法]对西藏黄牛胎儿成纤维细胞的分离和培养进行了研究。利用组织块法成功分离培养西藏黄牛胎儿成纤维细胞,对细胞的传代培养、形态学和动力学进行观察与分析。[结果]所建立的西藏黄牛胎儿成纤维细胞系具有典型的成纤维细胞形态;西藏黄牛胎儿成纤维细胞要经历滞留期、对数期、平台期,分别为0-2 d、2-7 d、7-8 d,细胞群体倍增时期为60 h。[结论]成功培养了西藏黄牛胎儿成纤维细胞。 展开更多
关键词 西藏黄牛 胎儿成纤维细胞 体外培养 分离
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胎儿成纤维细胞的培养分离方法对猪体细胞核移植胚胎发育潜力的影响 被引量:1
12
作者 黄雅琼 石德顺 +5 位作者 陈旭健 李家洲 曾诗媛 谢秋季 赵仕花 阮桂文 《家畜生态学报》 北大核心 2013年第6期30-35,共6页
研究采用不同传代的培养方法和不同方法处理及不同培养分离法探讨胎儿成纤维细胞的处理方法对猪体细胞胚胎发育潜力的影响。结果表明:(1)100%长满汇合胎儿成纤维细胞的核移植融合率高于70%~80%的胎儿成纤维细胞(P<0.05),分裂率高于... 研究采用不同传代的培养方法和不同方法处理及不同培养分离法探讨胎儿成纤维细胞的处理方法对猪体细胞胚胎发育潜力的影响。结果表明:(1)100%长满汇合胎儿成纤维细胞的核移植融合率高于70%~80%的胎儿成纤维细胞(P<0.05),分裂率高于血清饥饿培养的胎儿成纤维细胞(P<0.05),但囊胚率差异不显著(P>0.05);(2)猪胎儿成纤维细胞冷冻-解冻后的核移植分裂率和囊胚发育率均显著低于新鲜和4℃冷藏的细胞(P<0.05),但融合率无显著差异(P>0.05),表明猪胎儿成纤维细胞解冻后不宜直接进行核移植;(3)采用组织块法和酶消化法分离得到的胎儿成纤维细胞所构建的重构胚胎在融合率、分裂率和囊胚率方面没有显著差异(P>0.05)。表明100%长满汇合培养是较好的猪胎儿成纤维细胞培养处理方法;猪胎儿成纤维细胞解冻后不宜直接进行核移植;组织块法和酶消化法均可用于分离培养猪体细胞核移植的胎儿成纤维细胞。 展开更多
关键词 体细胞核移植 胎儿成纤维细胞 胚胎 发育潜力
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Isolation and Culture of Fetal Fibroblasts of Tibetan Yellow Cattle
13
作者 CHAMBA Yang-zom 《Animal Husbandry and Feed Science》 CAS 2011年第5期3-5,8,共4页
[ Objective] To isolate fetal fibroblasts from Tibetan yellow cattle and thus to provide the ideal biological material for cloning and cellular biology of animals inhabiting in the Tibet Plateau. [ Method] The fibrobl... [ Objective] To isolate fetal fibroblasts from Tibetan yellow cattle and thus to provide the ideal biological material for cloning and cellular biology of animals inhabiting in the Tibet Plateau. [ Method] The fibroblast cells were isolated from tissues of Tibetan yellow fetus by explant culture method. The subculture, morphology and dynamics were observed. [ Result] The fetal fibroblasts of Tibetan yellow cattle had typical morphology of fibroblast calls. The isolated cells had three growth stages including retention period (0 -2 d), logarithmic phase (2 -7 d) and platform phase (7 -8 d). Its doubling time was 60 h. [ Conclusion] Fetal fibroblasts of Tibetan yellow cattle have been successfully cultured. 展开更多
关键词 Tibet yellow cattle fetal fibroblasts In vitro culture ISOLATION
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Production of homeobox A10 gene transgenic pigs by somatic cell nuclear transfer
14
作者 XIAO Qian ZHAO Chang-zhi +7 位作者 LIN Rui-yi LI Guang-lei LI Chang-chun WANG Hai-yan XU Jing XIE Sheng-song YU Mei ZHAO Shu-hong 《Journal of Integrative Agriculture》 SCIE CAS CSCD 2019年第5期1072-1079,共8页
Homeobox A10(Hoxa10) gene is one of the most important candidate genes associated with the reproductive performance of humans and mice. Overexpression of Hoxa10 in mouse endometrium can increase litter size. Moreover,... Homeobox A10(Hoxa10) gene is one of the most important candidate genes associated with the reproductive performance of humans and mice. Overexpression of Hoxa10 in mouse endometrium can increase litter size. Moreover, Hoxa10 plays a key role in regulating the embryo implantation of sows. This study aimed to generate transgenic pigs using Hoxa10 via somatic cell nuclear transfer(SCNT). We established seven Hoxa10-transgenic cell lines, and two of the cell lines were selected as nuclear donors for the transfer. A total of 1 270 cloned embryos were generated and transferred to five surrogate mothers(Landrace×Yorkshire). Eight cloned male piglets were produced including one with cryptorchidism. Six transgenic piglets grew up healthy and produced 56 offspring. Finally, we obtained six transgenic male pigs and 26 transgenic positive offspring that can be used to further study the regulatory mechanism of Hoxa10 on the reproductive performance of pigs. 展开更多
关键词 HOXA10 GENE transgenic pig SOMATIC cell nuclear transfer fetal fibroblasts OOCYTE
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猪圆环病毒2型orf2基因在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达与生物活性鉴定 被引量:1
15
作者 高珊 申培磊 +4 位作者 侯书宝 徐洪龙 卢清侠 张勇 张改平 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第9期1653-1658,共6页
为获得稳定表达猪圆环病毒2型(PCV-2)orf2基因的奶山羊胎儿成纤维细胞,将PCV-2 orf2基因与筛选基因neo表达框串联插入到pBC1质粒,得到重组的真核表达载体pBC1-orf2-neo。然后采用脂质体介导法将重组质粒转染至奶山羊胎儿成纤维细胞(gFF... 为获得稳定表达猪圆环病毒2型(PCV-2)orf2基因的奶山羊胎儿成纤维细胞,将PCV-2 orf2基因与筛选基因neo表达框串联插入到pBC1质粒,得到重组的真核表达载体pBC1-orf2-neo。然后采用脂质体介导法将重组质粒转染至奶山羊胎儿成纤维细胞(gFFs),经G418筛选获得具有稳定抗性的阳性gFFs细胞株。RT-PCR分析显示,在获得的阳性gFFs细胞株中能够扩增出689bp的orf2基因和1 953bp的neo表达框,与预期结果相符。Western blot分析显示,获得了约37 000的表达产物,且能够与兔抗PCV-2Cap蛋白抗体发生反应。结果表明,orf2基因成功整合到山羊胎儿成纤维细胞染色体上并能够正确表达,表达产物具有良好的反应原性,这为构建分泌Cap蛋白的奶山羊乳腺生物反应器奠定了理论和物质基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒 乳腺表达载体 转染 奶山羊 胎儿成纤维细胞
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重组人瑞替普酶基因在山羊胎儿成纤维细胞β-酪蛋白基因座的定点整合
16
作者 王宏 沈子龙 +5 位作者 奚涛 李治国 刘红如 赵周英 吴国祥 成国祥 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期73-77,共5页
目的 :利用体细胞基因打靶技术来获得定点整合有重组人瑞替普酶 (rPA)的山羊胎儿成纤维细胞株。方法 :构建了针对山羊 β- 酪蛋白基因座的定点打靶载体 ,其上游同源臂为 β 酪蛋白启动子端同时包含其信号肽编码区长约 6 .1kb的基因组片... 目的 :利用体细胞基因打靶技术来获得定点整合有重组人瑞替普酶 (rPA)的山羊胎儿成纤维细胞株。方法 :构建了针对山羊 β- 酪蛋白基因座的定点打靶载体 ,其上游同源臂为 β 酪蛋白启动子端同时包含其信号肽编码区长约 6 .1kb的基因组片段 ,下游同源臂为 3.3kb从 β- 酪蛋白外显子 6至外显子 9的基因组片段。rPA小基因起始密码子位于 β- 酪蛋白信号肽编码区下游。将载体瞬时转染C12 7小鼠乳腺癌细胞 ,并通过激素进行诱导 ,酶联免疫吸附分析 (ELISA)检测细胞培养上清中的rPA表达量来验证载体表达功能。将载体通过电穿孔的方法转染同基因型的山羊胎儿成纤维细胞。利用G4 18和GANC进行药物筛选 ,并通过PCR和southern杂交的方法进行基因组DNA检测。结果 :获得了一株定点整合的细胞克隆 ,绝对基因打靶效率为 2× 10 7。结论 :本实验结果为后续利用核移植技术制备乳腺生物反应器提供了坚实的实验基础。 展开更多
关键词 体细胞 基因打靶 胎儿成纤维细胞 乳腺生物反应器 重组人瑞替普酶
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慢病毒直接诱导形成猪iPS细胞无需限定因子
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作者 曹鸿国 陈涛 +8 位作者 殷慧群 孙雪萍 蒲勇 杨盼 张运海 刘亚 李运生 陶勇 章孝荣 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2013年第1期57-63,共7页
为了证实慢病毒对细胞具有遗传修饰和重编程作用,在本实验中使用慢病毒感染猪胎儿成纤维细胞.结果显示:慢病毒介导的EGFP在猪胎儿成纤维细胞中稳定和高效表达,使用添加LIF和bFGF的细胞培养液,部分猪的胎儿成纤维细胞逐渐改变原有的纤维... 为了证实慢病毒对细胞具有遗传修饰和重编程作用,在本实验中使用慢病毒感染猪胎儿成纤维细胞.结果显示:慢病毒介导的EGFP在猪胎儿成纤维细胞中稳定和高效表达,使用添加LIF和bFGF的细胞培养液,部分猪的胎儿成纤维细胞逐渐改变原有的纤维状形态,形成圆形的细胞,细胞逐步增殖形成细胞集落,细胞集落边界清晰,在饲养层上细胞集落生长迅速,具有稳定的生长性能和正常核型,细胞碱性磷酸酶染色为阳性,表达干细胞特有的标记Oct4、Nanog和SSEA1,在体外能够形成拟胚体,在体内分化形成包含三个生殖层的畸胎瘤.作为核移植的供体细胞,克隆胚的卵裂率为53.33%、桑椹胚率为9.03%、囊胚率为2.07%、孵化囊胚的总细胞数为26.5,在桑椹胚率和囊胚率方面显著低于猪普通胎儿成纤维细胞核移植克隆胚的发育能力(P<0.05).结果证实慢病毒能够直接使猪的胎儿成纤维细胞转变成iPS细胞,因此慢病毒将成为一种理想的材料和工具用于细胞的遗传修饰和细胞重构等方面的研究. 展开更多
关键词 慢病毒 猪iPS细胞 胎儿成纤维细胞
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小鼠胚胎成纤维细胞的转染与阳性细胞的初步筛选
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作者 姜秋 倪雪岩 +1 位作者 聂代邦 孙宏晨 《吉林大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期990-993,共4页
目的:建立表达白血病抑制因子(LIF)的胚胎成纤维细胞的方法体系,为建立转基因动物模型提供理论依据。方法:以13.5dICR小鼠胚胎为材料,采用胰酶消化方法,培养小鼠原代胚胎成纤维细胞。利用脂质体介导方法,将线性化的pcDNA3.1-LIF真核表... 目的:建立表达白血病抑制因子(LIF)的胚胎成纤维细胞的方法体系,为建立转基因动物模型提供理论依据。方法:以13.5dICR小鼠胚胎为材料,采用胰酶消化方法,培养小鼠原代胚胎成纤维细胞。利用脂质体介导方法,将线性化的pcDNA3.1-LIF真核表达载体转染至小鼠胚胎成纤维细胞中。经G418筛选阳性细胞,提取阳性细胞的基因组DNA并测序。结果:通过对小鼠原代胚胎成纤维细胞的分离、培养,获得原代胚胎成纤维细胞。经过转染,建立了表达LIF的胚胎成纤维细胞,并在倒置显微镜下观察到筛选得到的阳性细胞。对阳性细胞克隆质粒测序表明同源性达99%。结论:pcDNA3.1-LIF真核表达载体成功转染到小鼠胚胎成纤维细胞中。 展开更多
关键词 白血病抑制因子 成纤维细胞 转染 小鼠
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超声作用对绵羊胎儿成纤维细胞转染效率的影响
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作者 张志强 常卫华 +4 位作者 胡俊杰 张连梅 刁睿鑫 林涛 张勇 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期401-406,共6页
为研究超声波对经脂质体介导的绵羊胎儿成纤维(sheep fetal fibroblasts,SFF)细胞转染效率的影响,用不同频率的超声波在不同时间内辐射经脂质体介导的SFF细胞,转染48h后收集细胞,用RT-PCR检测目的基因,台盼蓝染色检测细胞活性。转染后用... 为研究超声波对经脂质体介导的绵羊胎儿成纤维(sheep fetal fibroblasts,SFF)细胞转染效率的影响,用不同频率的超声波在不同时间内辐射经脂质体介导的SFF细胞,转染48h后收集细胞,用RT-PCR检测目的基因,台盼蓝染色检测细胞活性。转染后用G418挑选转基因单克隆细胞,计算转染率。结果显示,对细胞、质粒和脂质体的混合液共同超声辐射(时间60s,超声频率为2.5MHz)后转染,转染率要明显高于未超声辐射的细胞和先转染后超声辐射的细胞,并且细胞的存活率较高。结果表明,超声辐射不仅能改变细胞质膜的通透性,还能够提高脂质体介导的基因转染效率,增强基因介导的特异性和靶向性。 展开更多
关键词 绵羊 胎儿成纤维细胞 超声辐射 转染效率
原文传递
脂质体介导外源基因体外转染牛胎儿成纤维细胞条件的优化 被引量:23
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作者 李扬 吴凯峰 +2 位作者 郭旭东 郭继彤 旭日干 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期653-655,共3页
通过脂质体(FuGENE-6)介导,将真核表达载体pEGFP-C1成功导入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,探讨影响外源基因转染效率的参数,如DNA和脂质体的用量、转染的细胞数量以及细胞暴露于DNA与脂质体复合物的时间长度。通过实验发现,绿色荧光蛋白(... 通过脂质体(FuGENE-6)介导,将真核表达载体pEGFP-C1成功导入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,探讨影响外源基因转染效率的参数,如DNA和脂质体的用量、转染的细胞数量以及细胞暴露于DNA与脂质体复合物的时间长度。通过实验发现,绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的表达随DNA、脂质体量的增加而增加,延长细胞暴露时间反而使转染效率下降,转染细胞数适当才能得到较高的转化率。 展开更多
关键词 脂质体介导 外源基因体外转染 牛胎儿成纤维细胞 优化 绿色荧光蛋白 转染条件
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