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内含肽介导三段vWF基因真核细胞转移的翻译后连接及其功能性多聚体形成
被引量：
2
1
作者
朱甫祥
杨树德
+3 位作者
刘泽隆
缪静
屈慧鸽
迟晓艳
《生物化学与生物物理进展》
SCIE
CAS
CSCD
北大核心
2011年第1期67-74,共8页
vWF(von Willebrand factor)是一种超大分子质量的血浆多聚体糖蛋白,在血栓形成和生理凝血过程中发挥重要作用,其质和/或量的缺陷导致血管性血友病(VWD),由于VWD为单基因病,且vWF为分泌性蛋白,基于基因转移的基因治疗无需特异的靶器官,...
vWF(von Willebrand factor)是一种超大分子质量的血浆多聚体糖蛋白,在血栓形成和生理凝血过程中发挥重要作用,其质和/或量的缺陷导致血管性血友病(VWD),由于VWD为单基因病,且vWF为分泌性蛋白,基于基因转移的基因治疗无需特异的靶器官,因此VWD特别适合于基因治疗,但vWF基因过大(8.4 kb),难以为多数病毒载体特别是优点较多的腺相关病毒(AAV)载体承载.运用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能,研究了三重载体真核细胞共转断裂3段的vWF基因,以期通过转基因翻译后的蛋白质剪接作用形成完整的功能性vWF蛋白.将vWF的cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys1099、Ser2004的密码子前断裂为3段,分别与2种不同的内含肽即Ssp DnaE内含肽和Ssp DnaB内含肽编码序列融合,构建到真核表达载体pcDNA3.1(+),得到3个分别融合内含肽的vWF片段基因真核表达载体,共转染培养的293细胞,通过瞬时表达,电泳观察培养上清中的vWF多聚体形态,分析vWF蛋白量和凝血Ⅷ因子(FⅧ)结合力;通过共转FⅧ基因,分析了培养上清中的FⅧ蛋白量及生物活性.结果显示,通过内含肽的蛋白质反式剪接作用,共转内含肽融合的三片段vWF基因细胞上清,表现与正常人血浆和转vWF基因阳性对照细胞相似的vWF多聚体模式和FⅧ结合力,而且可明显提高转FⅧ基因后表达的FⅧ蛋白的分泌量和活性,提示剪接vWF蛋白的FⅧ载体功能的恢复.结果表明,内含肽可作为一种有效的技术手段进行三重载体共转断裂的vWF基因,为进一步基于内含肽的三重AAV转断裂vWF基因应用于VWD基因治疗研究、克服AAV的容量限制提供了依据.
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关键词
内含肽
蛋白质反式剪接
von
WILLEBRAND因子
转基因
多聚体化
FVIII载体
下载PDF
职称材料
应用凝血因子Ⅷ基因内XbaⅠ/FⅧ_(E22)RFLP对甲型血友病携带者的诊断
2
作者
潘峻亮
顾建明
+3 位作者
李红
程大卫
吴庆宇
阮长耿
《苏州医学院学报》
1990年第4期276-277,306,共3页
用FⅧ基因内第22外显子FⅧ_(E22)为探针,分析苏州地区正常人XbaI/FⅧ_(E22)RFLP,显示出9.6/4.8Kb 的多态性,频率为0.36/0.64.PIC 值为0.46。并以此为基础对1例甲型血友病携带者进行检测。
关键词
凝血因子
血友血病甲
携带者
下载PDF
职称材料
MFG-E8作为外泌体载体蛋白的作用与功能
被引量：
1
3
作者
黎智康
刘晨雪璇
+2 位作者
谭楚敏
熊盛
谢秋玲
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第4期288-294,共7页
构建MFG-E8全长和截短体的重组质粒,分析各截短体蛋白能否将目的蛋白带到外泌体上并确定其位置,以探讨MFG-E8各结构域功能及其作为外泌体上载体蛋白的效率。利用PCR扩增出带有信号肽的MFG-E8及其截短体基因,与EGFP基因连接,构建7种重组...
构建MFG-E8全长和截短体的重组质粒,分析各截短体蛋白能否将目的蛋白带到外泌体上并确定其位置,以探讨MFG-E8各结构域功能及其作为外泌体上载体蛋白的效率。利用PCR扩增出带有信号肽的MFG-E8及其截短体基因,与EGFP基因连接,构建7种重组质粒。之后PEI介导瞬转HEK293F细胞进行表达,利用EGFP的荧光,通过Western blot和激光共聚焦显微镜检测蛋白表达情况及其在胞内的位置。同时提取转染细胞分泌的外泌体,通过Western blot和电镜检测重组蛋白在外泌体中的情况。最后将含有重组蛋白的外泌体转染293T细胞,荧光显微镜观察外泌体将重组蛋白带入受体细胞中的情况。结果表明,成功构建MFG-E8全长及截短体重组质粒并在HEK293F细胞中表达,各重组蛋白在胞内均有表达,其中EGF-L表达量最高,C2最低,细胞上清中只能检测到EGF-L、C1、EC1的表达。转染细胞分泌的外泌体只检测到MFG-E8、EC1和C1C2三种蛋白。含有这3种蛋白的外泌体转染HEK293T细胞,3组细胞均有荧光,其中MFG-E8-EGFP的外泌体效果最好。MFG-E8能够作为蛋白载体将目的蛋白带到外泌体膜上,其C1、C2结构域对该过程至关重要,EGF-L的存在可以促进蛋白表达。
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关键词
乳脂肪球表皮生长因子
ⅷ
(MFG-E8)
截短体
外泌体
载体蛋白
结构域功能
下载PDF
职称材料
题名
内含肽介导三段vWF基因真核细胞转移的翻译后连接及其功能性多聚体形成
被引量：
2
1
作者
朱甫祥
杨树德
刘泽隆
缪静
屈慧鸽
迟晓艳
机构
鲁东大学生命科学学院
出处
《生物化学与生物物理进展》
SCIE
CAS
CSCD
北大核心
2011年第1期67-74,共8页
基金
山东省自然科学基金(ZR2010CM061)
烟台市科技发展计划(2008152)
+1 种基金
教育部留学回国人员科研启动基金(20071108)
鲁东大学学科建设经费资助项目~~
文摘
vWF(von Willebrand factor)是一种超大分子质量的血浆多聚体糖蛋白,在血栓形成和生理凝血过程中发挥重要作用,其质和/或量的缺陷导致血管性血友病(VWD),由于VWD为单基因病,且vWF为分泌性蛋白,基于基因转移的基因治疗无需特异的靶器官,因此VWD特别适合于基因治疗,但vWF基因过大(8.4 kb),难以为多数病毒载体特别是优点较多的腺相关病毒(AAV)载体承载.运用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能,研究了三重载体真核细胞共转断裂3段的vWF基因,以期通过转基因翻译后的蛋白质剪接作用形成完整的功能性vWF蛋白.将vWF的cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys1099、Ser2004的密码子前断裂为3段,分别与2种不同的内含肽即Ssp DnaE内含肽和Ssp DnaB内含肽编码序列融合,构建到真核表达载体pcDNA3.1(+),得到3个分别融合内含肽的vWF片段基因真核表达载体,共转染培养的293细胞,通过瞬时表达,电泳观察培养上清中的vWF多聚体形态,分析vWF蛋白量和凝血Ⅷ因子(FⅧ)结合力;通过共转FⅧ基因,分析了培养上清中的FⅧ蛋白量及生物活性.结果显示,通过内含肽的蛋白质反式剪接作用,共转内含肽融合的三片段vWF基因细胞上清,表现与正常人血浆和转vWF基因阳性对照细胞相似的vWF多聚体模式和FⅧ结合力,而且可明显提高转FⅧ基因后表达的FⅧ蛋白的分泌量和活性,提示剪接vWF蛋白的FⅧ载体功能的恢复.结果表明,内含肽可作为一种有效的技术手段进行三重载体共转断裂的vWF基因,为进一步基于内含肽的三重AAV转断裂vWF基因应用于VWD基因治疗研究、克服AAV的容量限制提供了依据.
关键词
内含肽
蛋白质反式剪接
von
WILLEBRAND因子
转基因
多聚体化
FVIII载体
Keywords
intein
protein
trans-splicing
von
Willebrand
factor
gene
delivery
multimer
factor
ⅷ
carrier
分类号
Q7 [生物学—分子生物学]
下载PDF
职称材料
题名
应用凝血因子Ⅷ基因内XbaⅠ/FⅧ_(E22)RFLP对甲型血友病携带者的诊断
2
作者
潘峻亮
顾建明
李红
程大卫
吴庆宇
阮长耿
机构
苏州医学院血栓与止血研究室
出处
《苏州医学院学报》
1990年第4期276-277,306,共3页
基金
国家自然科学基金会青年科学基金
国家教委优秀青年教师基金资助课题
文摘
用FⅧ基因内第22外显子FⅧ_(E22)为探针,分析苏州地区正常人XbaI/FⅧ_(E22)RFLP,显示出9.6/4.8Kb 的多态性,频率为0.36/0.64.PIC 值为0.46。并以此为基础对1例甲型血友病携带者进行检测。
关键词
凝血因子
血友血病甲
携带者
Keywords
coagulant
factor
ⅷ
hemophilia
A
RFLPS
carrier
detection
分类号
R714.55 [医药卫生—妇产科学]
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职称材料
题名
MFG-E8作为外泌体载体蛋白的作用与功能
被引量：
1
3
作者
黎智康
刘晨雪璇
谭楚敏
熊盛
谢秋玲
机构
暨南大学生命科学技术学院
基因工程药物国家工程研究中心
出处
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第4期288-294,共7页
基金
广东省引进创新科研团队计划资助项目(2016ZT06S654)。
文摘
构建MFG-E8全长和截短体的重组质粒,分析各截短体蛋白能否将目的蛋白带到外泌体上并确定其位置,以探讨MFG-E8各结构域功能及其作为外泌体上载体蛋白的效率。利用PCR扩增出带有信号肽的MFG-E8及其截短体基因,与EGFP基因连接,构建7种重组质粒。之后PEI介导瞬转HEK293F细胞进行表达,利用EGFP的荧光,通过Western blot和激光共聚焦显微镜检测蛋白表达情况及其在胞内的位置。同时提取转染细胞分泌的外泌体,通过Western blot和电镜检测重组蛋白在外泌体中的情况。最后将含有重组蛋白的外泌体转染293T细胞,荧光显微镜观察外泌体将重组蛋白带入受体细胞中的情况。结果表明,成功构建MFG-E8全长及截短体重组质粒并在HEK293F细胞中表达,各重组蛋白在胞内均有表达,其中EGF-L表达量最高,C2最低,细胞上清中只能检测到EGF-L、C1、EC1的表达。转染细胞分泌的外泌体只检测到MFG-E8、EC1和C1C2三种蛋白。含有这3种蛋白的外泌体转染HEK293T细胞,3组细胞均有荧光,其中MFG-E8-EGFP的外泌体效果最好。MFG-E8能够作为蛋白载体将目的蛋白带到外泌体膜上,其C1、C2结构域对该过程至关重要,EGF-L的存在可以促进蛋白表达。
关键词
乳脂肪球表皮生长因子
ⅷ
(MFG-E8)
截短体
外泌体
载体蛋白
结构域功能
Keywords
milk
fat
globule-epidermal
growth
factor
ⅷ
(MFG-E8)
truncated
protein
exosome
carrier
protein
function
of
domain
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
下载PDF
职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
内含肽介导三段vWF基因真核细胞转移的翻译后连接及其功能性多聚体形成
朱甫祥
杨树德
刘泽隆
缪静
屈慧鸽
迟晓艳
《生物化学与生物物理进展》
SCIE
CAS
CSCD
北大核心
2011
2
下载PDF
职称材料
2
应用凝血因子Ⅷ基因内XbaⅠ/FⅧ_(E22)RFLP对甲型血友病携带者的诊断
潘峻亮
顾建明
李红
程大卫
吴庆宇
阮长耿
《苏州医学院学报》
1990
0
下载PDF
职称材料
3
MFG-E8作为外泌体载体蛋白的作用与功能
黎智康
刘晨雪璇
谭楚敏
熊盛
谢秋玲
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2022
1
下载PDF
职称材料
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