小鼠B7-H4基因的真核表达及其对淋巴细胞增殖的影响 被引量：3

1

作者 李丽 胡为民 +1 位作者 王朝莉 杨致邦 《中国微生态学杂志》 CAS CSCD 2012年第4期292-294,297,共4页

目的构建小鼠B7-H4胞外段的真核表达载体,观察其在体外对淋巴细胞增殖的影响,为深入研究B7-H4在T细胞活化及移植排斥反应中的作用提供实验材料。方法提取小鼠肺、脾脏总RNA,RT-PCR反转录cDNA,以此为模板,扩增B7-H4胞外段基因,将其导入pG... 目的构建小鼠B7-H4胞外段的真核表达载体,观察其在体外对淋巴细胞增殖的影响,为深入研究B7-H4在T细胞活化及移植排斥反应中的作用提供实验材料。方法提取小鼠肺、脾脏总RNA,RT-PCR反转录cDNA,以此为模板,扩增B7-H4胞外段基因,将其导入pGEM-T Easy载体,构建TA-mB7-H4质粒。用XBaI和HindIII双酶切后琼脂糖凝胶电泳分析和测序鉴定。将测序证实的mB7-H4酶切后装入MYC-HIS-EGFP-N荧光表达载体中,构建B7-H4-EGFP真核表达载体,转化JM109感受态细菌,提取重组质粒,酶切后琼脂糖凝胶电泳分析和测序鉴定。同时构建control-EGFP载体。应用脂质体法将重组质粒转染CHO细胞,经G418筛选,获得稳定表达B7-H4-EGFP的CHO细胞株,用MTT分析其分别对BALB/c小鼠、C57小鼠淋巴细胞和二者混合淋巴细胞增殖的影响。结果经测序证实,所克隆的小鼠B7-H4 cDNA和构建的重组质粒基因序列正确;转染的CHO细胞能稳定地表达跨膜型重组蛋白B7-H4;表达的B7-H4对淋巴细胞增殖具有明显抑制作用。结论成功构建了B7-H4真核表达系统,能表达有生物学活性的B7-H4分子,为进一步探讨B7-H4在T细胞活化和移植排斥反应中的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 B7-H4 真核表达 淋巴细胞 增殖

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口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因在毕赤酵母中的表达 被引量：2

2

作者 丁银巧 张剑锐 +3 位作者 张云霞 曹振 孙明 田克恭 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第12期1100-1103,1134,共5页

目的利用毕赤酵母系统表达口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3AB,用于FMDV感染与疫苗免疫动物的鉴别诊断和3AB蛋白功能研究。方法采用PCR方法从pGEM-T-Easy-3ABC质粒中扩增3AB基因,将其插入pPICZαA酵母表达载体中,构建的重组表达质粒线性化... 目的利用毕赤酵母系统表达口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3AB,用于FMDV感染与疫苗免疫动物的鉴别诊断和3AB蛋白功能研究。方法采用PCR方法从pGEM-T-Easy-3ABC质粒中扩增3AB基因,将其插入pPICZαA酵母表达载体中,构建的重组表达质粒线性化后电转入毕赤酵母GS115中,在0.5%甲醇诱导下表达3AB蛋白,运用SDS-PAGE和ELISA方法鉴定表达蛋白。结果成功构建了pPICZαA-3AB重组酵母表达质粒,并转化入毕赤酵母GS115中,SDS-PAGE和ELISA鉴定结果表明,重组酵母菌株表达出约19kD的3AB蛋白,与针对FMDV的3AB蛋白单克隆抗体有特异性反应。结论在毕赤酵母中成功表达了FMDV3AB蛋白,与抗FMDV3AB蛋白单克隆抗体具有反应性。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 非结构蛋白 毕赤酵母 真核表达

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Asia 1型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因真核表达质粒的构建及鉴定 被引量：1

3

作者 霍晓伟 金宁一 +2 位作者 鲁会军 马鸣潇 牟伟峰 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2008年第5期371-373,377,共4页

目的构建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A-3C基因真核表达质粒。方法采集疫区牛的水疱液及水疱皮,经RT-PCR法扩增出Asia 1型FMDV的前体蛋白基因P1-2A片段和蛋白酶基因3C片段,分别克隆至pMD18-T载体上,通过酶切、连接,获得质粒pMD18-T-P1-... 目的构建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A-3C基因真核表达质粒。方法采集疫区牛的水疱液及水疱皮,经RT-PCR法扩增出Asia 1型FMDV的前体蛋白基因P1-2A片段和蛋白酶基因3C片段,分别克隆至pMD18-T载体上,通过酶切、连接,获得质粒pMD18-T-P1-2A-3C。经酶切获得P1-2A-3C片段,插入真核表达载体pVAXⅠpCMV启动子下游,构建pVAXⅠ-P1-2A-3C真核表达载体,用脂质体法转染HeLa细胞,进行IFA检测。结果Asia 1型FMDV真核表达载体pVAX1PⅠ-2A-3C,经酶切鉴定证明构建正确,转染HeLa细胞后,可见明显的黄绿色荧光,表明P1-2A-3C基因得到了表达。结论pVAXⅠ-P1-2A-3C可作为Asia1型FMD核酸疫苗的候选疫苗。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 P1-2A-3C基因 真核表达 核酸疫苗

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坏死梭杆菌白细胞毒素部分融合基因的真核表达及生物学特性研究 被引量：1

4

作者 冯二凯 刘晓颖 +4 位作者 佟盼盼 任飞 尹茉莉 于凯 陈立志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期554-557,共4页

为了解坏死梭杆菌白细胞毒素的致病机制,本研究将实验室前期构建的坏死梭杆菌白细胞毒素基因部分融合基因的真核表达质粒(p PIC9K-bsbse-gas-sh)转化毕赤酵母KM71H细胞,1%甲醇诱导其表达目的蛋白;SDS-PAGE结果显示,甲醇诱导3 d后,重组BS... 为了解坏死梭杆菌白细胞毒素的致病机制,本研究将实验室前期构建的坏死梭杆菌白细胞毒素基因部分融合基因的真核表达质粒(p PIC9K-bsbse-gas-sh)转化毕赤酵母KM71H细胞,1%甲醇诱导其表达目的蛋白;SDS-PAGE结果显示,甲醇诱导3 d后,重组BSBSE-GAS-SH蛋白以分泌形式表达于培养物上清液中,分子量约为117.9 ku;western blot表明重组蛋白能够与抗BSBSE抗血清发生反应,具有良好的反应原性;细胞毒性试验表明重组蛋白对小鼠肝细胞和巨噬细胞均具有细胞毒性作用,并且具有剂量依赖性,其中重组蛋白对小鼠巨噬细胞的细胞毒性作用更强。本研究为揭示坏死梭杆菌白细胞毒素致病机制提供了相关的实验数据。 展开更多

关键词 坏死梭杆 菌白细胞毒素 融合基因 真核表达

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激活素受体相互作用蛋白ARIPzip真核表达载体的构建及表达

5

作者 裴颖 刘飙 +5 位作者 鲍永利 于春雷 孙颖 李玉新 乌垠 苏冠方 《中国实验诊断学》 北大核心 2009年第3期293-295,共3页

目的构建激活素受体相互作用蛋白(activin receptor interacting protein zip,ARIPzip)真核表达载体,以便进一步探讨其生物学作用。方法从小鼠成纤维细胞3T3中提取RNA,并利用ARIPzip特异性引物通过RT-PCR方法扩增了ARIPzip cDNA,并克隆... 目的构建激活素受体相互作用蛋白(activin receptor interacting protein zip,ARIPzip)真核表达载体,以便进一步探讨其生物学作用。方法从小鼠成纤维细胞3T3中提取RNA,并利用ARIPzip特异性引物通过RT-PCR方法扩增了ARIPzip cDNA,并克隆入pcDNA-Flag载体中,构建重组载体pcDNA-F-ARIPzip。将重组载体转染入HEK293细胞中,并通过免疫印迹方法检测ARIPzip的表达。结果酶切及测序结果显示,重组质粒构建成功;免疫印迹结果显示,瞬时转染重组质粒的HEK293细胞中可有效表达ARIPzip。结论本研究成功构建了激活素受体相互作用蛋白ARIPzip真核表达载体,并能够在真核细胞中进行表达,为进一步研究ARIPzip的生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 激活素受体相互作用蛋白 ARIPzip 真核表达 HEK293细胞

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阴道毛滴虫粘附蛋白65-3基因真核表达载体的构建与鉴定

6

作者 朱晓燕 王雅静 +1 位作者 毕世樑 张仁刚 《四川医学》 CAS 2009年第4期460-462,共3页

目的构建并鉴定阴道毛滴虫粘附蛋白65-3基因的真核表达载体。方法Trizol试剂提取阴道毛滴虫株基因组总RNA,RT-PCR扩增粘附蛋白65-3基因,定向克隆入pMD-18T线性质粒,重组子经双酶切、PCR鉴定及测序分析。鉴定正确的重组质粒pMD-18T-ap65-... 目的构建并鉴定阴道毛滴虫粘附蛋白65-3基因的真核表达载体。方法Trizol试剂提取阴道毛滴虫株基因组总RNA,RT-PCR扩增粘附蛋白65-3基因,定向克隆入pMD-18T线性质粒,重组子经双酶切、PCR鉴定及测序分析。鉴定正确的重组质粒pMD-18T-ap65-3和pcDNA3.1(+)空质粒径BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶双酶切后,凝胶电泳纯化回收目的片段,将粘附蛋白65-3基因亚克隆入pcDNA3.1(+)载体并进行筛选和鉴定。结果成功克隆出阴道毛滴虫粘附蛋白65-3基因,序列分析发现该基因的开放阅读框长为1704bp,与GenBank上公布的粘附蛋白65-3基因序列比较,同源性高达99.6%,经PCR鉴定,限制性酶切鉴定及测序鉴定,正确构建出重组质粒pcDNA3.1-ap65-3。结论成功克隆出粘附蛋白65-3基因并构建出真核表达质粒pcDNA3.1-ap65-3,为进一步研究该基因的功能及滴虫的致病机制奠定实验基础。 展开更多

关键词 阴道毛滴虫 粘附蛋白65-3基因 真核表达载体

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牙齿发育相关基因ADAM28在人牙乳头细胞中的定位分布研究

7

作者 赵征 程增云 黄征难 《口腔医学》 CAS 2007年第10期505-509,共5页

目的探讨牙齿发育相关基因金属蛋白酶解离素28(a disintegrin and metalloproteinase28,ADAM28)在人牙乳头细胞(human dental papilla cells,HDPC)中的定位分布及作用。方法应用基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-ADAM28,通过细... 目的探讨牙齿发育相关基因金属蛋白酶解离素28(a disintegrin and metalloproteinase28,ADAM28)在人牙乳头细胞(human dental papilla cells,HDPC)中的定位分布及作用。方法应用基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-ADAM28,通过细胞培养、基因转染HDPC后,采用免疫荧光、RT-PCR及Western blot检测ADAM28在HDPC中的表达分布。结果成功构建并鉴定ADAM28真核质粒,瞬时转染HDPC72h后,HDPC的胞质和胞膜上均表达ADAM28蛋白,而两对照组均无表达。结论ADAM28在HDPC内能被正确地翻译、表达,可能作为一种胞质蛋白调控着牙源性间充质细胞的增殖和分化。 展开更多

关键词 牙齿发育 金属蛋白酶解离素28 人牙乳头细胞 定位分布 真核表达

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羊泰勒虫主要表面蛋白P32基因的克隆及真核表达载体的构建 被引量：6

8

作者 刘爱红 关贵全 +6 位作者 刘军龙 李有全 马米玲 牛庆丽 任巧云 殷宏 罗建勋 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第12期17-20,共4页

提取羊泰勒虫裂殖子总RNA,用特异性引物扩增出其主要表面蛋白P32基因,并成功地将该基因纯化后克隆到pGEM-TEasy载体上,经PCR和EcoRⅠ酶切鉴定均为阳性的重组质粒进行了测序和分析。随后将该基因从克隆载体上双酶切,与毕赤酵母分泌性表... 提取羊泰勒虫裂殖子总RNA,用特异性引物扩增出其主要表面蛋白P32基因,并成功地将该基因纯化后克隆到pGEM-TEasy载体上,经PCR和EcoRⅠ酶切鉴定均为阳性的重组质粒进行了测序和分析。随后将该基因从克隆载体上双酶切,与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-MPSP-P32,转化大肠埃希菌JM109,经测序证实,基因序列完全正确。 展开更多

关键词 羊泰勒虫 表面蛋白P32基因 真核表达载体

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草莓抗除草剂bar基因工程菌的构建及其检验 被引量：3

9

作者 朱秀蕾 叶振风 朱立武 《中国农学通报》 CSCD 2008年第2期63-66,共4页

为探索草莓抗除草剂bar基因转化高效方法,试验利用三亲杂交法,将构建的真核表达载体pBI121-bar转入根癌农杆菌菌株LBA4404,对菌落PCR、质粒PCR和质粒双酶切产物进行电泳检测,用构建的工程菌转化草莓试管苗。研究结果表明,真核表达载体pB... 为探索草莓抗除草剂bar基因转化高效方法,试验利用三亲杂交法,将构建的真核表达载体pBI121-bar转入根癌农杆菌菌株LBA4404,对菌落PCR、质粒PCR和质粒双酶切产物进行电泳检测,用构建的工程菌转化草莓试管苗。研究结果表明,真核表达载体pBI121-bar被成功转入根癌农杆菌LBA4404;草莓试管苗工程菌侵染最佳浓度菌液OD600值为0.5,脱菌Cef适宜浓度200mg/L;已筛选出草莓抗除草剂bar基因抗性芽。 展开更多

关键词 真核表达载体 根癌农杆菌 工程菌

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靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定 被引量：2

10

作者 陈岐辉 卢绩 +2 位作者 王小庆 王春喜 姚子明 《中国实验诊断学》 2008年第1期42-46,共5页

目的构建靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体质粒,为利用RNA干扰技术探索HIWI基因的作用的研究做准备。方法根据HIWI mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入pGenesil-2载体,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的... 目的构建靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体质粒,为利用RNA干扰技术探索HIWI基因的作用的研究做准备。方法根据HIWI mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入pGenesil-2载体,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体中,经测序证明与设计相同。结论成功构靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体,为进一步研究HIWI基因在干细胞和肿瘤细胞中的作用机制及后续的体内外RNAi实验研究奠定了基础。 展开更多

关键词 HIWI基因 RNA干扰 SHRNA 真核表达载体

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HBsAg真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达 被引量：1

11

作者 张艳 时成波 +1 位作者 郭丽 范洪学 《中国实验诊断学》 2007年第10期1287-1289,共3页

目的构建HBsAg真核表达载体,转染CHO细胞并检测其表达。方法通过PCR法扩增出乙肝表面抗原的S基因和dhfr基因,分别克隆到T载体上,然后分别将S基因和dhfr基因克隆到pCI载体上,将pCI载体的CMV启动子替换为hEF-1α启动子。对新构建的pEF1-α... 目的构建HBsAg真核表达载体,转染CHO细胞并检测其表达。方法通过PCR法扩增出乙肝表面抗原的S基因和dhfr基因,分别克隆到T载体上,然后分别将S基因和dhfr基因克隆到pCI载体上,将pCI载体的CMV启动子替换为hEF-1α启动子。对新构建的pEF1-αS-dhfr真核表达载体进行酶切和测序鉴定。用脂质体法转染CHO(dhfr-)细胞,并用ELISA法检测HBsAg表达。结果hEF-1α启动子、S基因和dhfr基因经测序与Genbank报道一致。真核表达载体pEF1-αS-dhfr经酶切鉴定与预期一致。转染重组质粒后的CHO细胞成功表达了HBsAg。结论已成功构建了真核表达载体pEF1-αS-dhfr,为研究高效表达HBsAg奠定了良好的实验基础。 展开更多

关键词 真核表达载体 CHO细胞 人延伸因子启动子 乙肝表面抗原 二氢叶酸还原酶基因

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AnnexinⅡ基因克隆及真核表达载体的构建

12

作者 刘亚伟 戴兵 +1 位作者 蔡厚安 梅长林 《生物学杂志》 CAS CSCD 2006年第3期12-14,共3页

目的克隆人AnnexinⅡ全长cDNA序列,并构建其真核表达载体。方法根据Genbank中AnnexinⅡ基因的碱基序列,利用RT-PCR的方法从人肾脏组织中扩增编码AnnexinⅡ基因,将目的片段与pBS-T载体连接,利用亚克隆的方法将AnnexinⅡ的cDNA片段克隆到p... 目的克隆人AnnexinⅡ全长cDNA序列,并构建其真核表达载体。方法根据Genbank中AnnexinⅡ基因的碱基序列,利用RT-PCR的方法从人肾脏组织中扩增编码AnnexinⅡ基因,将目的片段与pBS-T载体连接,利用亚克隆的方法将AnnexinⅡ的cDNA片段克隆到pcDNA3.1载体中,并进行序列测定。结果DNA测序证实该片段序列与Genbank完全一致。结论成功克隆人Annexin II全长cDNA序列,并构建出pcDNA3.1—Annexin II真核表达载体,为进一步研究其在肾脏疾病中的作用和机制奠定基础。 展开更多

关键词 克隆 AnnexinⅡ 真核表达载体

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