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金黄色葡萄球菌EsxA基因的克隆及表达 被引量：5
1
作者 黄艳梅 周帅 +5 位作者 陈吟霜 谢永强 龙燕 邓秋莲 杨镒宇 周珍文 《热带医学杂志》 CAS 2015年第6期728-730,740,共4页
目的在原核质粒中克隆金黄色葡萄球菌(S.aureus)Esx A基因,并进行表达及纯化,为其功能研究奠定基础。方法根据Gene Bank中S.aureus Esx A序列,设计特异性引物PCR扩增Esx A基因,PCR产物纯化后经Eco RΙ和XhoΙ双酶切,连接至p ET-28a(+)载... 目的在原核质粒中克隆金黄色葡萄球菌(S.aureus)Esx A基因,并进行表达及纯化,为其功能研究奠定基础。方法根据Gene Bank中S.aureus Esx A序列,设计特异性引物PCR扩增Esx A基因,PCR产物纯化后经Eco RΙ和XhoΙ双酶切,连接至p ET-28a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,His柱纯化重组Esx A蛋白,SDS-PAGE和Western blot验证重组蛋白的表达。结果成功克隆Esx A基因,基因全长294 bp,起始于ATG,终止于TAA,预测的分子量为11 036.2,等电点为4.61,经双酶切在294 bp处可见目的条带,基因测序显示Esx A在正确阅读框内,提示重组蛋白构建成功。SDS-PAGE显示重组蛋白在分子量大约14.5×103 Mr处左右见到可溶性的蛋白表达,Western blot分析识别14.5×103 Mr重组蛋白。结论在大肠杆菌中成功克隆表达Esx A蛋白,为其功能研究奠定基础。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌 esxa基因 克隆 原核表达
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结核分枝杆菌mpt59和esxA融合基因编码蛋白的原核表达及免疫原性观察 被引量：3
2
作者 石洁 朱岩昆 +5 位作者 郑丹薇 马晓光 王少华 李辉 邢进 吴彩霞 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2015年第6期761-765,共5页
目的:获取结核分枝杆菌mpt59和esx A基因编码的原核表达融合蛋白,并将该蛋白初步用于结核患者的快速诊断。方法:PCR扩增含有柔性链接肽段的esx A核苷酸序列,并将其连接至原核表达载体p ET28a上,再将mpt59连接至p ET28a-esx A上。该融合... 目的:获取结核分枝杆菌mpt59和esx A基因编码的原核表达融合蛋白,并将该蛋白初步用于结核患者的快速诊断。方法:PCR扩增含有柔性链接肽段的esx A核苷酸序列,并将其连接至原核表达载体p ET28a上,再将mpt59连接至p ET28a-esx A上。该融合蛋白在大肠杆菌BL21中原核表达后,用镍珠子进行亲和纯化。采用垂直电泳和免疫印迹分析重组蛋白,并用于结核患者的诊断。结果:成功构建了原核表达载体p ET28a-esx A-mpt59,转化大肠杆菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物。用该纯化蛋白进行ELISA检测,结果表明其诊断结核的灵敏度为97.8%,特异度为100%。结论:构建了含mpt59和esx A融合抗原基因的原核表达载体,并诱导表达了融合蛋白,为进一步研究结核分枝杆菌疫苗或诊断试剂奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 mpt59基因 esxa基因 血清学诊断 原核表达
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罗非鱼无乳链球菌EsxA基因克隆与原核表达 被引量：3
3
作者 马艳平 梁志凌 +3 位作者 马江耀 刘振兴 郝乐 柯浩 《动物医学进展》 北大核心 2016年第4期35-39,共5页
Ⅶ型分泌系统(T7SS)是近年来发现的分泌系统,分泌两种胞外蛋白,EsxA基因编码的ESAT6蛋白和EsxB基因编码的CFP-10蛋白。分泌蛋白具有良好的免疫原性,促进细菌从巨噬细胞吞噬体逃逸、影响巨噬细胞凋亡及裂解细胞等生物学功能,与致病性密... Ⅶ型分泌系统(T7SS)是近年来发现的分泌系统,分泌两种胞外蛋白,EsxA基因编码的ESAT6蛋白和EsxB基因编码的CFP-10蛋白。分泌蛋白具有良好的免疫原性,促进细菌从巨噬细胞吞噬体逃逸、影响巨噬细胞凋亡及裂解细胞等生物学功能,与致病性密切相关。以罗非鱼源无乳链球菌为模板,克隆到294bp的EsxA基因,将目的序列克隆到pMD18-T载体,经测序,目的序列与无乳链球菌EsxA基因同源率在99%以上。EsxA基因克隆到pET32a载体中,重组载体在28℃、0.5mmol/L IPTG诱导条件下表达量最大,可溶性表达。将纯化的ESAT6蛋白免疫Balb/c鼠,成功制备ESAT6蛋白鼠多克隆抗体,经Western blot,ESAT6蛋白具有良好的反应原性。研究结果为进一步进行无乳链球菌ESAT6蛋白的免疫学功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 Ⅶ型分泌系统 无乳链球菌 esxa基因 克隆与表达
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儿童结核病结核分枝杆菌临床分离株中esxA、fbpB、Rv2660c基因多态性研究 被引量：2
4
作者 马廷廷 黄延风 +1 位作者 杨震华 苏薇 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第17期1768-1773,共6页
目的对抗原编码基因esxA、fbpB、Rv2660c进行测序,了解esxA、fbpB、Rv2660c的基因多态性。方法选取135株结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株,运用PCR方法扩增目的基因esx A、fbp B、Rv2660c并进行测序,与结核标准... 目的对抗原编码基因esxA、fbpB、Rv2660c进行测序,了解esxA、fbpB、Rv2660c的基因多态性。方法选取135株结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株,运用PCR方法扩增目的基因esx A、fbp B、Rv2660c并进行测序,与结核标准株H37Rv基因序列以及从免疫表位数据库(immune epitope database,IEDB)中查询到的表位序列进行对比,分析esx A、fbp B、Rv2660c基因序列中的变异特征。结果在135株菌株中,esx A、Rv2660c序列暂未发现基因变异。fbpB共66株(48.89%)发现了基因变异,5个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点共造成8个(14.81%)T细胞抗原表位以及9个(24.32%)B细胞抗原表位序列的多态性。fbpB基因的d N值为0.000 120,d S为0.002 126,其中T细胞表位区与非T细胞表位区的d N值分别为0.000 067和0.000 408,d S分别为0.002 382和0.000 470,B细胞表位区dN和dS值分别为0.000 063和0.002 380,非B细胞表位区dN和dS均为0。结论 esxA、Rv2660c基因序列较保守,fbp B存在基因多态性,预测会对蛋白Ag85B的免疫功能造成影响,从而影响H56的免疫有效性。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 esxa fbpB Rv2660c 基因多态性
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