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采用易错PCR对粘质沙雷氏菌几丁质酶C进行定向进化 被引量：7
1
作者 刘治江 贺淹才 +2 位作者 李红然 刘嘉 施腾鑫 《华侨大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2010年第1期58-64,共7页
以重组E.coliBL21(DE3)pLysS/pET22b-Chi C为亲本,采用易错聚合酶链反应(PCR)技术,对粘质沙雷氏菌几丁质酶C基因(Chi C)进行定向进化研究.经过两轮易错PCR后,建立突变体文库,进行平板初筛、包涵体复性及酶活检测复筛,获得一酶活较高的... 以重组E.coliBL21(DE3)pLysS/pET22b-Chi C为亲本,采用易错聚合酶链反应(PCR)技术,对粘质沙雷氏菌几丁质酶C基因(Chi C)进行定向进化研究.经过两轮易错PCR后,建立突变体文库,进行平板初筛、包涵体复性及酶活检测复筛,获得一酶活较高的突变酶(Mut-Chi C),其催化活性为亲本重组酶的1.9倍,比活力为出发菌酶活的3.3倍.对突变酶的酶学性质进行初步研究,其最适pH值为5.0,最适温度为60℃,而出发菌该酶的最适温度为40℃.进化酶基因经DNA测序并通过软件与亲本型酶基因进行分析比对,表明突变酶Mut-Chi C基因发生点突变,使4处氨基酸被取代,且均为有义突变. 展开更多
关键词 粘质沙雷氏菌 几丁质酶C 分子定向进化 易错聚合酶链反应 包涵体
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应用易错PCR定向进化甘油脱氢酶 被引量：1
2
作者 李梓君 方柏山 +1 位作者 杨仲丽 刘嘉 《华侨大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2010年第6期661-666,共6页
经过连续易错聚合酶链式反应(Error-Prone PCR)向克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)甘油脱氢酶基因中引入突变,并构建突变文库.依据突变体催化番红O显色的特性,采用琼脂平板法和96微孔板法相结合的高通量筛选方法,成功获得突变体gldA-... 经过连续易错聚合酶链式反应(Error-Prone PCR)向克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)甘油脱氢酶基因中引入突变,并构建突变文库.依据突变体催化番红O显色的特性,采用琼脂平板法和96微孔板法相结合的高通量筛选方法,成功获得突变体gldA-74,其酶活力是亲本重组酶的2.73倍.通过软件对突变体gldA-74酶基因和亲本重组酶基因进行分析对比,发现突变体gldA-74酶基因发生了一处点突变(A964T),该突变使一处氨基酸被取代.将亲本重组酶和进化酶的高效表达产物经Ni柱纯化后,酶学性质的测定结果表明,甘油的Km值由0.58 mmol.L-1升高至0.63 mmol.L-1,而NAD的Km值由0.74 mmol.L-1升高至0.77mmol.L-1,并且酶的最适pH值由原来的11.5升高至12.5,而最适温度由65℃降至55℃. 展开更多
关键词 甘油脱氢酶 克雷伯杆菌 定向进化 易错聚合酶链式反应
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定向进化植物乳杆菌和痤疮丙酸杆菌高产共轭亚油酸 被引量：2
3
作者 时旭 刘瑛 +5 位作者 史海粟 武俊瑞 乌日娜 牛雪晴 洛雪 岳喜庆 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2021年第12期99-106,共8页
为获得高产共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)的菌株,对亚油酸异构酶系植物乳杆菌的肌球蛋白交叉反应抗原(myosin-cross-reactive antigen,MCRA)基因mcra和痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶基因lai-p进行克隆,克隆成功后连接到骨架质... 为获得高产共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)的菌株,对亚油酸异构酶系植物乳杆菌的肌球蛋白交叉反应抗原(myosin-cross-reactive antigen,MCRA)基因mcra和痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶基因lai-p进行克隆,克隆成功后连接到骨架质粒pCold-SUMO上构建两种含mcra基因和lai-p基因的大肠杆菌重组菌株,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷低温诱导阳性重组菌蛋白表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证得到目的蛋白表达条带,说明两种基因表达成功。采用易错聚合酶链式反应定向进化mcra基因和lai-p基因,构建重组菌突变体库,利用流式细胞术分选获得吸光度提高和CLA产量提高的重组菌株,其中p Cold-ycmcra-gfp重组菌243株,吸光度最高的为155号菌1.050 6±0.000 4,提高了5.02倍;p Cold-yclai-p-gfp重组菌156株,产量最高的为39号菌(11.62±0.003 6)μg/m L,提高了2.99倍。本研究为后期深入了解突变菌株CLA产量提高的原因,并获得两种亚油酸异构酶的产酶机制奠定了一定基础。 展开更多
关键词 亚油酸异构酶基因 易错聚合酶链式反应 重组质粒 流式细胞术
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易错PCR技术提高嗜热酸性Ⅲ型普鲁兰水解酶TK-PUL催化活性的研究 被引量：1
4
作者 曾静 郭建军 袁林 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2022年第18期130-136,共7页
嗜热酸性Ⅲ型普鲁兰水解酶TK-PUL在液化条件下可完全水解淀粉为淀粉糖,在“液化糖化一步法”的淀粉制糖工艺中具有巨大的应用潜力。本研究拟采用易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术提高TK-PUL的催化活性。经过两轮... 嗜热酸性Ⅲ型普鲁兰水解酶TK-PUL在液化条件下可完全水解淀粉为淀粉糖,在“液化糖化一步法”的淀粉制糖工艺中具有巨大的应用潜力。本研究拟采用易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术提高TK-PUL的催化活性。经过两轮易错PCR及高通量筛选,获得了催化活性提高的突变体L538D。与TK-PUL相比,L538D以可溶性淀粉为底物的比酶活力提高了50%,以普鲁兰多糖为底物的比酶活力提高了21%;L538D以可溶性淀粉、普鲁兰多糖为底物的k/K值分别提高了44%、27%。即L538D的α-1,4-糖苷键水解活性和α-1,6-糖苷键水解活性均明显提高,并且其α-1,4-糖苷键水解活性的提高幅度更大。同源模建得到的蛋白质分子结构显示,将TK-PUL中Leu538替换为Asp,可能通过缩短氨基酸残基侧链的长度和减弱氨基酸残基的疏水性,提高了催化活性位点Glu538所在loop结构的柔性,从而提高酶的催化活性。本研究结果表明,TK-PUL中Leu538是影响其催化活性的重要氨基酸残基。 展开更多
关键词 Ⅲ型普鲁兰多糖水解酶 定向进化 易错聚合酶链式反应(易错PCR) 高通量筛选技术 催化活性本
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人杀菌/渗透增强蛋白N端功能片段基因突变文库的构建和鉴定
5
作者 李晶琴 孔庆利 安云庆 《首都医科大学学报》 CAS 北大核心 2017年第6期903-910,共8页
目的为提高杀菌/渗透性增强蛋白N端功能片段BPI_(23)对内毒素(lipopolysaccharides,LPS)的亲和性,通过易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA改组技术,对其编码序列BPI_(600)进行突变,在大肠杆菌XL10-Gold中构建BPI_(... 目的为提高杀菌/渗透性增强蛋白N端功能片段BPI_(23)对内毒素(lipopolysaccharides,LPS)的亲和性,通过易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA改组技术,对其编码序列BPI_(600)进行突变,在大肠杆菌XL10-Gold中构建BPI_(600)基因突变体库。方法通过控制Mg2+和Mn2+的浓度进行易错PCR,获得BPI_(600)随机突变基因片段,经测序和基因比对,确定BPI_(600)的随机突变率。再对易错PCR产物进行DNA改组,将改组产物克隆至pYD1载体中,转化大肠杆菌XL10-Gold,从Amp抗性(LuriaBertani,LB)固体培养平板上任选10个单菌落,增菌后提取质粒,得到pYD1-shuffled BPI_(600)重组质粒,将质粒进行HindⅢ/XhoⅠ酶切鉴定,取5个阳性质粒进行DNA测序,通过基因和氨基酸比对鉴定突变情况。结果测序和基因比对显示,BPI_(600)经易错PCR所获突变文库的随机突变率达2.3%;改组后重组质粒的酶切结果表明,在随机选择的10个菌落所提质粒中,有6个含BPI_(600),表明构建了重组质粒pYD1-shuffled BPI_(600);在5个阳性质粒中,有4个重组质粒的BPI_(23)编码序列分别发生了6、9、11和14个碱基突变;1个不仅有10个碱基突变,还存在1个碱基的缺失。氨基酸比对表明,有2个质粒(分别有6和14个碱基突变)具有正确的读码框,能够翻译完整的蛋白质,各有4或14个氨基酸突变。3个质粒因含终止密码子而不能表达完整目的蛋白。结论成功构建pYD1-shuffled BPI_(600)重组质粒,获得库容量为2×105的突变文库,为高内毒素亲和力突变体的筛选奠定了基础。 展开更多
关键词 人杀菌 渗透增强蛋白 定向进化 易错PCR DNA改组
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定向进化提高枯草芽孢杆菌脂肪酶的活力 被引量：11
6
作者 赵博 陶进 +5 位作者 马吉胜 廉虹 王岩 常琳 高仁钧 曹淑桂 《催化学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2009年第4期291-296,共6页
通过定向进化的方法,提高了一个新的源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的脂肪酶(BSL2)的活力.经过两轮易错PCR以及高通量筛选,最终获得了比活力为野生出发酶4.5倍的突变体3-1B2.基因比对结果表明,共有两个氨基酸发生了突变.突变酶的... 通过定向进化的方法,提高了一个新的源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的脂肪酶(BSL2)的活力.经过两轮易错PCR以及高通量筛选,最终获得了比活力为野生出发酶4.5倍的突变体3-1B2.基因比对结果表明,共有两个氨基酸发生了突变.突变酶的酶学性质研究发现,与野生酶相比,它的热稳定性及pH稳定性略有增加,最适温度和最适pH值则无太大的变化.同源模建了BSL2与3-1B2的结构,并与底物进行了分子对接.结果表明,突变体3-1B2的结合能比野生型BSL2低1.29 kcal/mol,活性中心Ser77残基与底物羰基的距离也由0.319 nm减小为0.278 nm,因而加快了酶反应速度,提高了酶活力. 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌 脂肪酶 易错聚合酶链反应 定向进化 分子对接
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