蓝舌病病毒和流行性出血病病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：18

1

作者 杨振兴 朱建波 +6 位作者 李占鸿 李卓然 何于雯 谢佳芮 李华春 廖德芳 杨恒 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1104-1111,共8页

为建立检测蓝舌病病毒(BTV)和流行性出血病病毒(EHDV)的快速诊断方法,笔者根据BTV的第10基因节段(Seg-10)和EHDV的第5基因节段(Seg-5)序列,分别设计BTV与EHDV的特异性引物和TaqMan探针,经过反应条件优化,建立了同时检测两种病毒的双重... 为建立检测蓝舌病病毒(BTV)和流行性出血病病毒(EHDV)的快速诊断方法,笔者根据BTV的第10基因节段(Seg-10)和EHDV的第5基因节段(Seg-5)序列,分别设计BTV与EHDV的特异性引物和TaqMan探针,经过反应条件优化,建立了同时检测两种病毒的双重荧光定量RT-PCR方法,并进行了特异性、灵敏度、重复性和临床样品检测验证。用该方法对BTV Seg-10和EHDV Seg-5节段的体外转录ssRNA为模板绘制标准曲线,相关系数(R^2)均大于0.995,线性关系较好;该方法可检测不同血清型的BTV和EHDV,与阿卡斑病病毒(AKAV)、中山病病毒(CHUV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、口蹄疫病毒(FMDV)和牛流行热病毒(BEFV)无交叉反应,表明该方法特异性强;对2种标准品的检出极限均为10 copies/uL,比常规RT-PCR敏感性高10倍;组内和组间重复试验的变异系数均小于2%;用所建立的双重荧光定量RT-PCR方法及常规RT-PCR方法,对100份血液样品和50份病毒液分别进行检测,符合率均大于90%。以上结果表明所建立的双重荧光定量RT-PCR方法具有快速、准确、敏感和稳定等优点,为BTV和EHDV感染的早期快速诊断、高通量检测及流行病学调查提供了有效的技术方法。 展开更多

关键词 蓝舌病病毒 流行性出血病病毒 双重荧光定量rt-pcr

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小反刍兽疫病毒及山羊痘病毒N-ITR基因二联实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：14

2

作者 赵文华 杨仕标 +1 位作者 高华峰 王金萍 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第3期65-71,共7页

为实现山羊2种疫病病原体——小反刍兽疫病毒(PPRV)和山羊痘病毒(GTPV)的同步快速检测,基于PPRV的N基因及GTPV的ITR基因,分别设计合成2套特异性引物及探针;探针分别用5′FAM-TAMRA3′及5′JOE-Eclipse3′标记物进行标记以实现同步检测... 为实现山羊2种疫病病原体——小反刍兽疫病毒(PPRV)和山羊痘病毒(GTPV)的同步快速检测,基于PPRV的N基因及GTPV的ITR基因,分别设计合成2套特异性引物及探针;探针分别用5′FAM-TAMRA3′及5′JOE-Eclipse3′标记物进行标记以实现同步检测。试验结果显示,所建立的N-ITR二联探针实时荧光定量RT-PCR方法可同步检测PPRV和GTPV,产生特异性荧光信号,而对禽痘病毒(FPV)、犬瘟热病毒(CDV)等相关病毒无荧光信号检出。以PPRV-N和GTPVITR的pMD18-T载体质粒为标准品,构建了二联标准曲线,N-ITR探针对PPRV和GTPV的检测敏感度可分别达102和103拷贝/μL。本研究初步建立了可同步快速特异性检测PPRV和GTPV的二联实时荧光定量RT-PCR方法。 展开更多

关键词 小反刍兽疫病毒 山羊痘病毒 二联实时荧光定量rt—pcr 探针

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鸭坦布苏病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR方法的建立 被引量：13

3

作者 张艳芳 谢芝勋 +6 位作者 谢丽基 刘加波 范晴 庞耀珊 罗思思 邓显文 谢志勤 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第3期77-82,共6页

本试验旨在建立同时检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)和鸭瘟病毒(DPV)的二重荧光定量RT-PCR方法。针对GenBank中DTMUVE基因和DPVUL6基因的保守序列,设计合成了2对引物和2条TaqMan探针。通过优化反应体系、条件及评价其特异性、敏感性,建立了检测... 本试验旨在建立同时检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)和鸭瘟病毒(DPV)的二重荧光定量RT-PCR方法。针对GenBank中DTMUVE基因和DPVUL6基因的保守序列,设计合成了2对引物和2条TaqMan探针。通过优化反应体系、条件及评价其特异性、敏感性,建立了检测DTMUV和DPV的二重荧光定量RT-PCR方法。该方法对DTMUV和DPV的检测灵敏度均达100个模板拷贝数,同时该方法对鸭源新城疫病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、H9亚型禽流感病毒和减蛋综合征病毒的检测结果均为阴性。本研究建立的DTMUV和DPV二重荧光定量RT-PCR具有敏感、快速、特异、定量、重复性好等优点,可用于DTMUV和DPV感染的快速鉴别诊断。 展开更多

关键词 鸭坦布苏病毒 鸭瘟病毒 二重荧光定量rt-pcr

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一种鉴别非洲猪瘟病毒和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立 被引量：11

4

作者 王建华 赵祥平 +7 位作者 董志珍 王玉玲 赵丹 肖妍 张俊哲 陈小金 王乃福 陈本龙 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期19-25,共7页

为建立一种快速、敏感和特异的鉴别检测非洲猪瘟病毒（ASFV）和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）的方法,以ASFV CP530R基因和HP-PRRSV NSP2基因为靶序列分别设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种二重... 为建立一种快速、敏感和特异的鉴别检测非洲猪瘟病毒（ASFV）和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）的方法,以ASFV CP530R基因和HP-PRRSV NSP2基因为靶序列分别设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种二重荧光RT-PCR检测方法,对该方法的特异性、定量线性范围、敏感性和重复性进行了评价及初步应用。结果显示,该方法对ASFV和HP-PRRSV呈现特异性扩增,不与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒和猪流感病毒发生交叉反应。该方法对含有ASFV CP530R靶序列的质粒标准对照（pCR2.1-ASFV-CP530R）定量检测的线性范围为6.1×101~6.1×108 copies/μL,对含有HP-PRRSV NSP2基因靶序列的RNA标准对照（HPPRRSV-NSP2-RNA）的定量线性范围为4.1×101~4.1×108 copies/μL,最低检出限分别为61copies/μL和41copies/μL。对3个浓度的pCR2.1-ASFV-CP530R和PRRSV-NSP2-RNA进行组内和组间重复性试验,Ct值的变异系数均小于1.60%,表明该方法具有良好的重现性。用该方法对276份实际样品进行ASFV和HP-PRRSV同时检测,全部样本的ASFV检测结果为阴性,有8份样本的HP-PRRSV检测结果为阳性,其余样本HP-PRRSV检测结果为阴性。上述结果表明,本研究建立的方法可为实际样本中ASFV和HP-PRRSV的同时鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 二重荧光rt-pcr

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蓝舌病病毒和鹿流行性出血热病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：7

5

作者 刘佳佳 王慧煜 +1 位作者 艾军 韩雪清 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第9期1124-1128,共5页

为建立可同时检测蓝舌病病毒(BTV)和鹿流行性出血热病毒(EHDV)的快速诊断方法,本研究根据BTV和EHDV保守基因序列设计特异性引物和探针,建立了双重荧光定量RT-PCR,对该方法进行反应条件、特异性及敏感性的验证,并用该方法对部分已知临床... 为建立可同时检测蓝舌病病毒(BTV)和鹿流行性出血热病毒(EHDV)的快速诊断方法,本研究根据BTV和EHDV保守基因序列设计特异性引物和探针,建立了双重荧光定量RT-PCR,对该方法进行反应条件、特异性及敏感性的验证,并用该方法对部分已知临床样品进行检测。结果显示,该方法与口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、小反刍兽疫病毒等牛、羊常见疾病病原无交叉反应;对两种重组质粒标准品的检出极限均为1×10~2copies/L;批内和批间重复试验的变异系数均小于2.55%。临床试验表明,该方法能够快速准确地检测出临床组织样品中BTV和EHDV的核酸。结果表明,本研究建立的检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以为BTV和EHDV的快速鉴别检测及流行病学调查提供有效的技术手段。 展开更多

关键词 蓝舌病病毒 鹿流行性出血热病毒 双重荧光定量rt-pcr

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H6N1亚型禽流感病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立 被引量：6

6

作者 罗思思 谢芝勋 +8 位作者 谢志勤 邓显文 刘加波 谢丽基 黄莉 黄娇玲 曾婷婷 张艳芳 王盛 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第2期326-332,共7页

根据GenBank中H6、N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因序列,设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。经反应条件优化,本试验建立了检测H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法。该法特异性强,只对H6亚型和N1亚型AIV进行特异... 根据GenBank中H6、N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因序列,设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。经反应条件优化,本试验建立了检测H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法。该法特异性强,只对H6亚型和N1亚型AIV进行特异性扩增,对其他H亚型AIV、N亚型AIV及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等病原体的检测均为阴性;该法敏感性好,对H6N1亚型AIV的检测限为100拷贝/μL。本试验建立的H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异的优点,为H6N1亚型AIV的防控提供技术支撑。 展开更多

关键词 禽流感病毒 H6N1亚型 二重荧光rt-pcr

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H1、H3亚型猪流感病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：4

7

作者 王博 王慧煜 +4 位作者 赵宝华 罗静 王承民 何宏轩 韩雪清 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第10期3035-3041,共7页

为建立一种快速、准确地检测H1和H3亚型猪流感病毒(swine influence virus,SIV)的方法,根据H1和H3亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计2对特异性引物和2条Taq Man探针,建立双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该... 为建立一种快速、准确地检测H1和H3亚型猪流感病毒(swine influence virus,SIV)的方法,根据H1和H3亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计2对特异性引物和2条Taq Man探针,建立双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法敏感性高,可检测到最低拷贝数为102拷贝/μL;重复性良好,重复孔Ct值的变异系数均在5%以下;特异性好,除H1和H3亚型SIV外,H4、H5、H7、H9亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒检测均为阴性;在田间样品中成功检出1株H1和1株H3亚型SIV,检出率为1.16%。该方法准确、快速、灵敏、特异,可为H1、H3亚型SIV的快速鉴别检测及流行病学调查提供有效的技术手段。 展开更多

关键词 H1和H3亚型猪流感病毒(SIV) 双重实时荧光定量rt-pcr TAQMAN探针

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高致病性PRRSV GD疫苗株与野毒株双重荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立 被引量：4

8

作者 张文利 孙丰廷 +3 位作者 王海光 刘灿 英聪 宁宜宝 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期898-902,共5页

为建立一种能够快速鉴别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GDr180疫苗株与GD野毒株的双重荧光定量RT-PCR方法,本研究在PPRSV的Nsp2基因和Orf7基因区域分别设计不同荧光标记的MGB探针及特异性引物。这两种MGB探针能够分别特异结合GD野... 为建立一种能够快速鉴别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GDr180疫苗株与GD野毒株的双重荧光定量RT-PCR方法,本研究在PPRSV的Nsp2基因和Orf7基因区域分别设计不同荧光标记的MGB探针及特异性引物。这两种MGB探针能够分别特异结合GD野毒株和GDr180疫苗株。通过对PRRSV培养液、感染猪血清和组织样品检测证明了该方法的可行性;采用双重实时荧光定量RT-PCR方法检测PRRSV GDr180疫苗株和GD强毒株时敏感性分别达到19.4拷贝/μL和34.2拷贝/μL;该方法与PRRSV其他8个病毒株和猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪细小病毒不发生交叉反应,表明该方法具有良好的特异性;因此可以用于PRRSV GDr180疫苗株与野毒株的鉴别检测。 展开更多

关键词 高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗GDr180 双重荧光rt-pcr MGB探针 鉴别检测

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H5和H7亚型高致病性禽流感病毒新型冻干微芯片双重荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用 被引量：4

9

作者 高晓艺 韩焘 +8 位作者 王乃迪 王传彬 杨林 王新杰 高姗姗 孙晓明 胡祥钰 石玉祥 刘玉良 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期911-917,共7页

为建立鉴别检测H5和H7亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)双重荧光定量RT-PCR检测方法,本研究根据已登录的H5和H7亚型HPAIV HA基因裂解位点序列差异分别设计引物和探针,对反应体系各条件优化后首次建立了同时鉴别检测H5与H7亚型HPAIV的新型... 为建立鉴别检测H5和H7亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)双重荧光定量RT-PCR检测方法,本研究根据已登录的H5和H7亚型HPAIV HA基因裂解位点序列差异分别设计引物和探针,对反应体系各条件优化后首次建立了同时鉴别检测H5与H7亚型HPAIV的新型冻干微芯片双重荧光定量RT-PCR方法。特异性试验结果显示,该方法除对H5和H7亚型HPAIV检测结果为阳性外,对其它几种常见的禽病病原检测结果均为阴性,该方法特异性强;敏感性试验结果显示,该方法检测下限为病毒浓度1×101TCID50/mL,而常规荧光定量RT-PCR检测下限为1×102TCID50/mL,敏感性高;标准曲线分析后结果显示,本研究所建立方法的扩增效率比常规荧光定量RT-PCR高,二者相关系数均为0.997;批内和批间重复性试验结果显示,Ct值的变异系数均小于2%以下,重复性高。临床样品检测结果显示,该方法所需样本微量仅为1μL^2μL;操作简便、快速,检测过程<40 min,可用于现场检测;而且利用该方法与常规荧光定量PCR方法以及测序对临床样品进行检测,三者结果完全吻合。本研究所建立的新型冻干微芯片双重荧光定量RT-PCR检测方法为H5和H7亚型HPAIV监测和临床检测提供了可行的技术手段。 展开更多

关键词 H5亚型禽流感 H7亚型禽流感 HA裂解位点 双重荧光定量rt-pcr 微芯片

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尼帕病毒与猪流感病毒双重荧光定量RT-PCR方法的建立 被引量：4

10

作者 王建华 赵祥平 +7 位作者 董志珍 肖妍 王玉玲 张俊哲 陈小金 王乃福 陈本龙 赵丹 《动物医学进展》 北大核心 2016年第1期11-16,共6页

根据尼帕病毒(NiV)M基因和猪流感病毒(SIV)M基因序列设计引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种鉴别NiV和SIV的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法,对该方法的定量线性范围、敏感性、重复性和特异性进行了评价及初步应用。结果... 根据尼帕病毒(NiV)M基因和猪流感病毒(SIV)M基因序列设计引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种鉴别NiV和SIV的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法,对该方法的定量线性范围、敏感性、重复性和特异性进行了评价及初步应用。结果显示,用该方法检测NiV M基因的RNA标准对照(NiV-M-RNA)和SIV M基因的RNA标准对照(SIV-M-RNA),定量线性范围分别为4.6×101copies/μL^4.6×108 copies/μL和5.8×101copies/μL^5.8×108 copies/μL,检出限分别为46个拷贝和58个拷贝。该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于1.6%,显示其良好的可重复性。该方法仅对NiV-M-RNA和SIV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒(CSFV)、猪流行腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)和伪狂犬病病毒(PRV)发生交叉反应。用该方法对236份猪的鼻拭子样品进行NiV和SIV的同时检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,有1份样本的SIV检测结果为阳性。本研究建立的方法可为猪临床样本中NiV和SIV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。 展开更多

关键词 尼帕病毒 猪流感病毒 TAQMAN-MGB探针 双重荧光定量rt-pcr

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BTV和PPRV双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：1

11

作者 勾倩倩 杜吉革 +5 位作者 李启红 李倩琳 赵洋 钱莺娟 印春生 郑龙三 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期285-291,共7页

为建立一种能够同时检测蓝舌病病毒(BTV)和小反刍兽疫病毒(PPRV)的快速检测方法,本研究选取蓝舌病病毒的NS3基因和小反刍兽疫病毒的N基因作为靶基因,参照GenBank上公布的两种基因序列,通过序列比对后选取一段保守性较高的区域,利用Beaco... 为建立一种能够同时检测蓝舌病病毒(BTV)和小反刍兽疫病毒(PPRV)的快速检测方法,本研究选取蓝舌病病毒的NS3基因和小反刍兽疫病毒的N基因作为靶基因,参照GenBank上公布的两种基因序列,通过序列比对后选取一段保守性较高的区域,利用Beacon designer 8设计引物和探针并优化反应体系及反应条件,建立了双重荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法检测BTV和PPRV阳性质粒标准品的最低检出量分别为1.7 copies/μL和1.2 copeis/μL;与山羊痘病毒、羊口疮病毒、口蹄疫病毒、羊腐败性梭菌、布氏杆菌及弓形虫无交叉反应,具有良好的特异性;其组间重复性和组内重复性的变异系数均小于2%,表明该方法具有较好的重复性。结果表明,建立的双重荧光定量RT-PCR检测方法适用于BTV和PPRV的快速检测。 展开更多

关键词 蓝舌病病毒 小反刍兽疫病毒 双重荧光定量rt-pcr

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通用型和O型口蹄疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：2

12

作者 王淑娟 王东方 +7 位作者 刘影 杨海波 赵胜杰 曹伟伟 王翠 赵雪丽 马震原 闫若潜 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2020年第9期20-25,共6页

为建立通用型和O型口蹄疫病毒(FMDV)二重荧光定量RT-PCR检测方法,本试验根据GenBank已登录的不同亚型FMDV通用序列和O型FMDV序列设计了2对特异性引物和2条TaqMan MGB探针,经过反应条件和体系优化,建立了通用型(T型)和O型FMDV的二重荧光... 为建立通用型和O型口蹄疫病毒(FMDV)二重荧光定量RT-PCR检测方法,本试验根据GenBank已登录的不同亚型FMDV通用序列和O型FMDV序列设计了2对特异性引物和2条TaqMan MGB探针,经过反应条件和体系优化,建立了通用型(T型)和O型FMDV的二重荧光定量RT-PCR(FQ-PCR)检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;对15份临床疑似样品进行了应用检测。结果表明,成功建立通用型和O型FMDV二重FQ-PCR检测方法,该方法可特异性地扩增经灭活的O型、A型与AsiaⅠ型口蹄疫病毒标准株细胞培养物混合物,但对BHK-21细胞和PEDV、TGEV、SVV等病原对照不出现特异性扩增曲线,特异性好;检测模板最低极限为1.0×101拷贝/μL,敏感性高,重复性好;自15份临床疑似FMDV感染样品中检出9份FMDV-T阳性,7份FMDV-O阳性,检测结果与测序结果完全一致,且与国家口蹄疫参考实验室复核结果一致。本试验成功建立了通用型和O型FMDV二重FQ-PCR检测方法,为FMDV的快速检测及O型FMDV的分型诊断提供了特异、敏感、快速的方法。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 二重荧光定量rt-pcr 建立 应用

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鉴别H5亚型两种分支禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR方法的建立及应用 被引量：2

13

作者 彭程 刘朔 +7 位作者 张琳 李金平 于晓慧 侯广宇 王静静 李阳 蒋文明 刘华雷 《中国动物检疫》 CAS 2021年第1期100-105,共6页

为准确区分H5亚型禽流感病毒2.3.2.1分支和2.3.4.4分支的毒株,通过对GenBank和GISAID数据库中发表的以及本实验室保存的H5亚型禽流感病毒HA基因序列进行比对,设计1对特异性引物和2条探针,建立了区分H5亚型禽流感病毒不同分支毒株的实时... 为准确区分H5亚型禽流感病毒2.3.2.1分支和2.3.4.4分支的毒株,通过对GenBank和GISAID数据库中发表的以及本实验室保存的H5亚型禽流感病毒HA基因序列进行比对,设计1对特异性引物和2条探针,建立了区分H5亚型禽流感病毒不同分支毒株的实时荧光RT-PCR方法,并对该方法的反应体系和反应参数进行了优化,同时开展了特异性和敏感性试验,以及临床应用检测。结果显示:该方法具有良好的特异性,与其他亚型禽流感病毒及常见禽病病毒无交叉反应;对H5亚型禽流感病毒2.3.2.1分支和2.3.4.4分支毒株的检测灵敏度分别为495.0 copies/μL和22.3 copies/μL;100份临床家禽拭子禽流感病毒检测结果与常规RT-PCR和病毒分离检测结果一致,符合率为100%。结果表明,该方法特异、敏感、准确、耗时少,同时还可区分不同分支,可应用于H5亚型禽流感病毒的准确、快速检测。 展开更多

关键词 H5亚型禽流感病毒 分支 双重实时荧光rt-pcr 敏感性 特异性

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H9N2禽流感病毒一步法双重荧光RT—PCR检测方法的建立 被引量：1

14

作者 崔淑娟 毕丽芳 +5 位作者 由佳 李明举 于浩 彭晓旻 杨鹏 王全意 《国际病毒学杂志》 2016年第2期89-91,94,共4页

目的建立一种可同时检测禽流感病毒H9N2的HA和NA基因一步法双重荧光RT-PCR方法。方法针对H9N2禽流感病毒的HA和NA基因保守区，设计相应的特异性引物以及探针，优化检测体系及反应条件，建立一步法双重荧光定量RT-PCR方法。对该方法的灵... 目的建立一种可同时检测禽流感病毒H9N2的HA和NA基因一步法双重荧光RT-PCR方法。方法针对H9N2禽流感病毒的HA和NA基因保守区，设计相应的特异性引物以及探针，优化检测体系及反应条件，建立一步法双重荧光定量RT-PCR方法。对该方法的灵敏度、特异性、稳定性进行验证与评估，并对家禽粪便标本进行应用检测，以单重实时荧光RT-PCR方法作为参照，检测结果不一致的样本采用测序进行验证。结果该方法特异性强，与H1、H3、H5、H7亚型禽流感病毒、鸡新城疫及鸡传染性支炎病毒均无交叉反应，对HA和NA基因的最低检出限分别可达50拷贝/μL和25拷贝饥L，组间与组内的变异系数在0．20—0．79％之间。对82份粪便标本进行检测，H9N2禽流感病毒的阳性率为8．14％（7／82），与单重实时荧光RT—PCR法检测结果一致。结论该方法特异性强、灵敏度高、稳定性好，可应用于临床禽流感样本的检测。 展开更多

关键词 禽流感病毒 H9N2 双重荧光rt-pcr 特异性、灵敏度 稳定性

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基于荧光熔解曲线模式RT-PCR快速检测H_5N_1亚型禽流感病毒 被引量：1

15

作者 岳华 李明义 +3 位作者 马莉 汤承 张兆敏 张斌 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期116-121,共6页

针对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因保守序列设计2对引物,建立了SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR(RRT-PCR)方法,实现了同一反应管内同时检测AIV的H5和N1亚型基因。熔解曲线分析显示,H5和N1扩增片段的熔解温度分别为(79.5±0.3)℃... 针对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因保守序列设计2对引物,建立了SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR(RRT-PCR)方法,实现了同一反应管内同时检测AIV的H5和N1亚型基因。熔解曲线分析显示,H5和N1扩增片段的熔解温度分别为(79.5±0.3)℃和(83.3±0.3)℃,无引物二聚体形成,扩增产物片段大小分别为150 bp和474bp,与预期大小相符,测序结果证实为H5和N1亚型基因的靶序列。该方法能从H5N1样本中检出阳性扩增信号,熔解曲线可见H5和N1双特异峰;而H5N2样本有阳性扩增,熔解曲线仅见H5单特异峰。AIV的其他HA亚型和其他病毒的RNA、DNA无扩增信号。本法最低可检测21.0拷贝.μL-1和19.5拷贝.μL-1H5和N1重组质粒,敏感度分别是RT-PCR的100、1 000倍。本研究建立的基于荧光熔解曲线模式RT-PCR可用于HN亚型AIV的检测。 展开更多

关键词 禽流感病毒 H5N1亚型 双重荧光rt—pcr 熔解曲线

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新型H7N9流感病毒双重荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用

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作者 刘淑敏 王淑娟 +7 位作者 班付国 赵明扬 王东方 赵雪丽 谢彩华 马震原 刘梅芬 闫若潜 《中国病毒病杂志》 CAS 2019年第1期45-50,共6页

目的建立特异敏感的荧光定量PCR (FQ-PCR)方法,用于新型H7N9流感病毒的快速检测。方法针对GenBank中新型H7N9流感病毒(2016年以后)的血凝素基因和神经氨酸酶基因序列的保守区域分别设计两对特异性引物和两条探针,经优化反应条件,建立一... 目的建立特异敏感的荧光定量PCR (FQ-PCR)方法,用于新型H7N9流感病毒的快速检测。方法针对GenBank中新型H7N9流感病毒(2016年以后)的血凝素基因和神经氨酸酶基因序列的保守区域分别设计两对特异性引物和两条探针,经优化反应条件,建立一种基于TaqMan MGB探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和稳定性,对2017年采集的临床疑似感染样品进行检测,并与普通PCR方法进行比较分析。结果本研究成功建立的新型H7N9FQ-PCR检测方法在101～106拷贝/μl模板范围内有很好的线性关系,所得相关系数为0.999;对人工合成的H7和N9基因出现阳性扩增信号,但对鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒、H1N2、H3N2、H6N2、H9N2流感病毒等病原对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在0.02%～0.05%;对H7和N9的最低检测模板浓度均为10拷贝/μl,比普通PCR方法的灵敏度高100倍;自30份疑似样品中检出4份阳性样品,与国家禽流感参考实验室复核结果一致。结论本研究成功建立了H7N9流感病毒双重FQ-PCR检测方法,为禽相关临床样本的新型H7N9早期检测提供了特异、敏感、快速的方法。 展开更多

关键词 新型H7N9病毒 流感病毒 双重荧光定量rt-pcr 方法建立 应用

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鉴别检测裂谷热病毒NSs缺失型疫苗株与野生株模拟物的双重荧光定量RT-PCR方法的建立

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作者 杨蕾蕾 毛立 +5 位作者 李基棕 江杰元 刘茂军 张纹纹 孙敏 李文良 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期1128-1133,共6页

为了建立一种能够鉴别检测裂谷热病毒野毒株与NSs缺失型疫苗株的荧光定量RT-PCR方法,本研究通过对裂谷热病毒基因组序列进行比较分析,选择其S节段NSs基因及L节段L基因的无二级结构且保守的区段,分别设计多对引物和探针,通过试验验证并... 为了建立一种能够鉴别检测裂谷热病毒野毒株与NSs缺失型疫苗株的荧光定量RT-PCR方法,本研究通过对裂谷热病毒基因组序列进行比较分析,选择其S节段NSs基因及L节段L基因的无二级结构且保守的区段,分别设计多对引物和探针,通过试验验证并优化反应条件,筛选出最佳引物和探针的组合,建立了可以快速检测裂谷热病毒并区分NSs基因缺失疫苗株和野毒株的双重荧光定量RT-PCR方法。利用该方法检测羊临床常见病原,结果显示该方法仅对裂谷热质粒标准品样品检测为阳性,不与羊常见的其他病原出现阳性反应,特异性强;将裂谷热质粒标准品10倍倍比稀释后利用本研究建立的方法进行检测,结果显示,该方法对NSs和L基因重组质粒标准品的检测下限分别为10拷贝/μL和100拷贝/μL,敏感度高;重复性实验结果显示,该方法组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。将NSs缺失型和非缺失型质粒分别转染细胞,提取核酸,利用本方法进行检测,结果显示该方法可有效区分NSs基因缺失型和非缺失型核酸样品。本研究建立的双重荧光定量RT-PCR方法为鉴别野生病毒株和NSs缺失型疫苗株奠定了技术基础。 展开更多

关键词 裂谷热病毒 双重荧光定量rt-pcr 鉴别 NSs基因 L基因 模拟物

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一种鉴别尼帕病毒和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立

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作者 王建华 董志珍 +2 位作者 王玉玲 肖妍 赵祥平 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第2期348-355,共8页

为建立一种快速、敏感和特异地鉴别尼帕病毒（NiV）和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）的检测方法,本试验以NiV M基因和HP-PRRSVnsp2基因为靶序列,通过优化反应条件建立了一种二重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、... 为建立一种快速、敏感和特异地鉴别尼帕病毒（NiV）和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）的检测方法,本试验以NiV M基因和HP-PRRSVnsp2基因为靶序列,通过优化反应条件建立了一种二重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、定量线性范围、敏感性和重复性进行了评价及初步应用。结果显示,用该方法检测NiV M基因和HP-PRRSVnsp2基因的RNA标准对照（NiV-M-RNA和HP-PRRSV-nsp2-RNA）,线性范围分别为4.6×101-4.6×107和4.1×101-4.1×108拷贝/μL;最低检出限分别为46和4.1拷贝;该方法组内试验和组间试验的变异系数均小于2.0%,显示出良好的可重复性;该方法仅对NiV和HP-PRRSV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪流感病毒（SIV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）和猪圆环病毒2型（PCV2）发生交叉反应。用该方法对236份猪实际样品进行NiV和HP-PRRSV核酸检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,8份样本的HP-PRRSV检测结果为阳性。本研究建立的方法为猪实际样本中NiV和HP-PRRSV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。 展开更多

关键词 尼帕病毒 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 TAQMAN-MGB探针 二重荧光rt-pcr方法

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血清型特异性水泡性口炎病毒同步检测和鉴别方法的建立

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作者 史喜菊 李炎鑫 +2 位作者 刘全国 徐立伟 刘艳华 《中国动物检疫》 CAS 2020年第10期104-108,共5页

为准确地鉴别诊断新泽西型水泡性口炎病毒(VSV-NJ)和印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IND),本研究建立了可以同时检测和鉴别诊断VSV-NJ和VSV-IND的双重荧光RT-PCR方法,并对方法性能进行了测试和初步应用。结果显示,建立的双重荧光RT-PCR... 为准确地鉴别诊断新泽西型水泡性口炎病毒(VSV-NJ)和印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IND),本研究建立了可以同时检测和鉴别诊断VSV-NJ和VSV-IND的双重荧光RT-PCR方法,并对方法性能进行了测试和初步应用。结果显示,建立的双重荧光RT-PCR特异性为100%,最低检测限1~10个拷贝/μL,扩增效率E值均在99%左右,R2值分别为0.999和0.998。VSV-NJ和VSV-IND单荧光RT-PCR与双重荧光RT-PCR的相关性系数分别为0.9997和0.9994,与单荧光RT-PCR相比,该引物和探针的双重体系混合对特异性和敏感性均未产生明显干扰。用已知VSV-NJ及VSV-IND阳性核酸验证,发现符合率为100%,对50份临床样品的检测均为阴性,与单荧光RT-PCR结果一致。本研究建立的双重荧光RT-PCR方法实现了VSV-NJ和VSV-IND的同步检测和鉴别,为水泡性口炎的防控提供了技术储备。 展开更多

关键词 新泽西型和印第安纳型水泡性口炎 双重荧光rt-pcr 检测和鉴别

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H1和H3亚型猪流感病毒二重TaqMan-MGB探针荧光RT-PCR检测方法的建立

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作者 王建华 陈小金 +8 位作者 张俊哲 王玉玲 肖妍 赵丹 谭旭菲 王乃福 陈本龙 董志珍 赵祥平 《中国动物检疫》 CAS 2016年第10期90-94,共5页

根据H1和H3亚型猪流感病毒（SIV）血凝素（HA）编码基因的保守序列,分别设计合成特异性引物和Taq Man-MGB探针,建立了一种检测H1和H3亚型SIV的二重荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法仅对H1和H3亚型SIV呈特异性扩增,对H9亚型SIV、猪繁殖... 根据H1和H3亚型猪流感病毒（SIV）血凝素（HA）编码基因的保守序列,分别设计合成特异性引物和Taq Man-MGB探针,建立了一种检测H1和H3亚型SIV的二重荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法仅对H1和H3亚型SIV呈特异性扩增,对H9亚型SIV、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（SFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）无交叉扩增反应;用该方法检测H1和H3亚型SIV的HA基因的RNA标准对照（SIV-H1-RNA,SIV-H3-RNA）,最适线性检测范围分别为3.7×10~1~3.7×10~8拷贝数/反应和3.4×10~0~3.4×10~8拷贝数/反应,最低检出限分别为38和34个拷贝数;该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于2.0%,显示其具有良好的可重复性。用该方法对520份进口猪的鼻拭子样本和78份国内猪鼻拭子样本进行SIV检测发现,进口猪鼻拭子样本的SIV检测结果均为阴性,12份国内猪鼻拭子样本的H1亚型SIV检测结果为阳性,5份国内猪鼻拭子样本的H3亚型SIV检测结果为阳性。本方法的建立为H1和H3亚型SIV检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。 展开更多

关键词 猪流感病毒 H1亚型 H3亚型 TaqMan探针 荧光rt-pcr

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