基于雌激素受体调节Nrf2-ARE通路的黄芩中抗氧化成分的筛选 被引量：12

1

作者 刘媛媛 刘陶 +4 位作者 吴玉梅 张晗 赵鑫 刘志东 李楠 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期822-827,共6页

目的建立基于Nrf2-ARE通路的报告基因筛选模型,筛选黄芩中基于雌激素受体发挥抗氧化作用的活性成分。方法 ARE荧光素酶报告质粒p GL4. 37和海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK共同转染293T细胞。将黄芩中汉黄芩素、黄芩素、黄芩苷等3个主要活... 目的建立基于Nrf2-ARE通路的报告基因筛选模型,筛选黄芩中基于雌激素受体发挥抗氧化作用的活性成分。方法 ARE荧光素酶报告质粒p GL4. 37和海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK共同转染293T细胞。将黄芩中汉黄芩素、黄芩素、黄芩苷等3个主要活性成分和(或)雌激素受体(ER)特异性抑制剂加入Nrf2-ARE双荧光素酶报告基因系统,检测其是否通过ER影响Nrf2-ARE通路,发挥抗氧化作用。将筛选出的成分和(或) ER抑制剂、Nrf2-ARE通路抑制剂加入Ha Ca T细胞中,验证是否通过ER影响Nrf2-ARE通路发挥抗氧化作用。结果黄芩苷(100μmol·L^(-1))可明显激活293T细胞中的Nrf2-ARE通路,诱导表达倍数为空白组的(1. 56±0. 01)倍(P <0. 01)。预给予ER抑制剂后,诱导表达倍数下降至(1. 02±0. 23)倍,抗氧化作用消失。分别预给予ER抑制剂、Nrf2-ARE通路抑制剂后,黄芩苷干预UVB损伤的Ha Ca T细胞中的ROS值明显上升,SOD值明显下降。结论黄芩苷可以通过ER影响Nrf2-ARE通路,发挥抗氧化作用。 展开更多

关键词 黄芩 抗氧化 Nrf2-ARE通路 植物雌激素受体 双荧光素酶报告基因系统 黄芩苷

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TGF-β1调控基质金属蛋白酶-20(MMP-20)启动子转录活性的研究 被引量：6

2

作者 韩婷婷 孙岩 +3 位作者 张娟娟 刘晓影 官秀梅 高玉光 《牙体牙髓牙周病学杂志》 CAS 北大核心 2009年第5期251-255,共5页

目的:克隆MMP-20基因启动子序列,分析转化生长因子-β1对其转录活性的影响。方法:检索并分析MMP-20基因翻译起始点上游序列。利用PCR从小鼠基因组上扩增长度为2852bp的启动子序列,并与pMD18-T克隆载体连接。经酶切反应初步鉴定后,以pMD1... 目的:克隆MMP-20基因启动子序列,分析转化生长因子-β1对其转录活性的影响。方法:检索并分析MMP-20基因翻译起始点上游序列。利用PCR从小鼠基因组上扩增长度为2852bp的启动子序列,并与pMD18-T克隆载体连接。经酶切反应初步鉴定后,以pMD18-T-MMP-20为模板,利用PCR方法获得带酶切位点的MMP-20启动子片段(2842bp),并与pGL3-Basic载体连接。pGL3-MMP-20瞬时转染小鼠成釉细胞系(ALC)过夜后,在培养基中加入1ng/mLTGF-β1,12h后检测荧光素酶的活性。结果:经酶切反应和测序结果证实MMP-20启动子成功插入pGL3-Basic质粒。与pGL3-Basic质粒转染相比较,转染pGL3-MMP-20后荧光素酶活性明显增强;培养基中加入TGF-β1能促使pGL3-MMP-20荧光素酶活性进一步增强。结论:外源性MMP-20启动子在成釉细胞中被激活;TGF-β1能增强pGL3-MMP-20荧光素酶活性,提示釉质发育过程中,TGF-β1具有调节MMP-20基因表达的生物学功能。 展开更多

关键词 转化生长因子-Β1 基质金属蛋白酶-20 启动子 双荧光素酶报告系统

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miR-203下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化 被引量：4

3

作者 李登 沙明磊 +2 位作者 陈磊 赵圣 邵怡 《现代生物医学进展》 CAS 2018年第17期3201-3208,共8页

目的:验证miR-203通过与TLR4 mRNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。方法:通过miRanda软件预测TLR4 mRNA 3'-UTR存在mi R-203结合位点。根据TLR4 mRNA 3'-UTR序列设计目的基因片段以... 目的:验证miR-203通过与TLR4 mRNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。方法:通过miRanda软件预测TLR4 mRNA 3'-UTR存在mi R-203结合位点。根据TLR4 mRNA 3'-UTR序列设计目的基因片段以及突变型目的基因片段,以pmirGLO为载体构建双荧光素酶报告基因野生型载体(pmirGLO-TLR4 3'-UTR)及其突变型载体(pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR)。将293T细胞共转染pmirGLO-TLR4 3'-UTR质粒或pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR质粒及mmu-mi R-203-3p mimics或mimic NC,通过双荧光素酶报告基因系统验证mi R-203可以与TLR4 m RNA的3'-UTR特异性结合,通过Real-time PCR及Western blot验证小鼠巨噬细胞RAW264.7转染了mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC后,M1型巨噬细胞markers (i NOS, TNF-α, CCL-3, IL-23),M2型巨噬细胞markers (Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)及TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达。使用TLR4抑制剂TAK-242抑制小鼠巨噬细胞TLR4-Myd88-NF-κB信号通路后,转染mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC,再次检测M1,M2型巨噬细胞markers及TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达。结果:双荧光素酶报告基因系统显示293T细胞转染了pmirGLO-TLR4 3'-UTR质粒及mmu-miR-203-3p mimics后,其相对荧光素酶活性△CT较转染了pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR质粒或者mimic NC均有显著降低,其差异达到统计学意义(P<0.05)。Real-time PCR及Western blot显示转染了mmu-miR-203-3p mimics的小鼠巨噬细胞M1型巨噬细胞markers (i NOS, TNF-α, CCL-3, IL-23)表达减少,M2型巨噬细胞markers (Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)表达增加,同时伴有TLR4-Myd88-NF-κB信号通路表达下调,而通过给予TAK-242抑制了mmu-miR-203-3p mimics下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路及诱导M2型巨噬细胞极化的作用。结论:mi R-203与TLR4 m RNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。 展开更多

关键词 miR-203 RAW264.7 双荧光素酶报告基因系统 巨噬细胞极化 TLR4-Myd88-NF-κB

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CACNB2基因多态性与原发性高血压的关联性研究 被引量：4

4

作者 孙倩 王欣 +6 位作者 黄颖 胡云良 唐疾飞 林燕 牛宇欣 王晓欧 杜兵 《中华医学遗传学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期340-344,共5页

目的探讨钙离子通道G2亚基基因（calciumchannelt72gene，CACNB2）多态性与温州汉族人群原发性高血压的相关性及应用荧光素酶报告基因技术检测rs7069292不同等位基因对基因表达的影响。方法收集原发性高血压患者637例，以血压正常者600... 目的探讨钙离子通道G2亚基基因（calciumchannelt72gene，CACNB2）多态性与温州汉族人群原发性高血压的相关性及应用荧光素酶报告基因技术检测rs7069292不同等位基因对基因表达的影响。方法收集原发性高血压患者637例，以血压正常者600名作对照，采用飞行时间质谱分型技术对CACNB2基因rs2228645、rs2357928、rs7069292、rs7099380、rs10764319和rs11014166共6个SNP位点进行分型。构建CACNB2基因5’上游-2831bp到-2460bp的rs7069292的侧翼序列的荧光素酶报告基因载体。结果高血压组rs7069292CT基因型频率及C等位基因频率高于正常对照组（5．20％vs．2．17％，2．59％vs．1．08％，均P〈0．05），分型未发现rs7069292CC基因型；含rs7069292C等位基因的启动子活性与T等位基因相比明显增高，差异有统计学意义（P〈0．05）；其余5个SNP位点各基因型频率及等位基因频率与对照组比较差异均无统计学意义（均P〉0．05）。结论CACNB2基因rs7069292多态性与温州汉族人群原发性高血压病有关联，T〉C变异可能是CACNB2基因功能表达的一个影响因子。 展开更多

关键词 原发性高血压 钙离子通道 单核苷酸多态性 双荧光素酶报告基因

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牛Sry启动子调控序列的鉴定 被引量：4

5

作者 韩凤桐 林秀坤 +2 位作者 刘娣 吴宁 廖冰 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第14期2996-3004,共9页

【目的】Sry是大多数哺乳动物雄性性别发育的决定基因,但人们仍未找到其表达的调控规律,本试验对牛Sry5′端调控序列作了初步的研究,为深入研究牛Sry的表达调控奠定了基础。【方法】克隆牛Sry5′端侧翼1056bp长的DNA序列,利用生物信息... 【目的】Sry是大多数哺乳动物雄性性别发育的决定基因,但人们仍未找到其表达的调控规律,本试验对牛Sry5′端调控序列作了初步的研究,为深入研究牛Sry的表达调控奠定了基础。【方法】克隆牛Sry5′端侧翼1056bp长的DNA序列,利用生物信息学方法对这一区域内潜在的转录起始位点进行了预测,并构建了10个不同长度的缺失牛Sry5′部分侧翼序列的报告基因载体;进一步分离了胎牛生殖嵴,进行生殖嵴细胞的原代培养,并对胎牛生殖嵴细胞进行了性别和特征鉴定;最后利用荧光素酶双报告基因分析系统,在生殖嵴细胞内检测了牛Sry核心启动子区域的位置。【结果】体外培养的生殖嵴细胞可以表达雄性生殖嵴细胞的特征基因Sry、Sox9、Sf-1和Dax1,牛Sry5′端-93、-419和-722处存在3个潜在的转录起始位点(TSS),-599—-565区域35bp内存在控制Sry基础转录活性的顺式调控元件,其中存在多个潜在的转录因子结合位点。【结论】牛Sry5′端UTR区-599—-565bp区域35bp存在部分调控序列。 展开更多

关键词 牛 SRY 核心启动子 双荧光素酶报告基因分析系统

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miR-191通过调控C/EBPβ转录影响猪前体脂肪细胞分化 被引量：4

6

作者 刘帅 宁小敏 +4 位作者 李美航 仇杨 李艳杰 董培越 杨公社 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2013年第2期165-176,共12页

对实验室前期Solexa结果进行深入挖掘,结合生物信息学分析从不同发育阶段猪皮下脂肪组织差异表达的miRNAs中筛选出高丰度差异极显著的候选miR-191.采用腺病毒过表达miR-191,实时定量PCR、Western blot及双荧光素酶报告基因检测等技术方... 对实验室前期Solexa结果进行深入挖掘,结合生物信息学分析从不同发育阶段猪皮下脂肪组织差异表达的miRNAs中筛选出高丰度差异极显著的候选miR-191.采用腺病毒过表达miR-191,实时定量PCR、Western blot及双荧光素酶报告基因检测等技术方法,初步研究miR-191对猪前体脂肪细胞分化的影响.结果发现,miR-191随着猪前体脂肪细胞的分化表达量逐渐增加.与对照组相比,过表达miR-191的猪前体脂肪细胞中miR-191转录本显著增加,并引起CCAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)、PPARγ和aP2的mRNA水平降低,抑制了猪前体脂肪细胞分化.同时,Western blot结果显示,与对照组相比过表达miR-191的猪前体脂肪细胞在48 h C/EBPβ蛋白水平下降了55%.更重要的是,通过TargetScan等算法正向筛选以及MicroInspector反向筛选联合获得miR-191候选靶基因,经双荧光素酶报告基因检测结果证实,miR-191可直接作用于C/EBPβ3′UTR,从而降低萤火虫荧光素酶活性.综上所述,miR-191可能通过抑制脂肪细胞分化早期标志基因C/EBPβ的表达,从而抑制了猪前体脂肪细胞的分化. 展开更多

关键词 miR-191 C EBPβ 猪前体脂肪细胞 表达谱 靶基因预测 腺病毒 双荧光素酶报告基因检测系统

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B7-H1启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性检测 被引量：3

7

作者 吴胜昔 陈永文 +2 位作者 朱广倍 费蕾 吴玉章 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2014年第7期955-960,共6页

目的构建含B7-H1启动子的荧光素酶报告基因载体,转染肝癌Hep G2细胞进行活性检测。方法 PCR扩增B7-H1启动子上游区域基因片段,并插入到含有荧光素酶报告基因的载体PGL3-Basic中构建重组子,经双酶切和测序鉴定后,将重组子转染Hep G2细胞... 目的构建含B7-H1启动子的荧光素酶报告基因载体,转染肝癌Hep G2细胞进行活性检测。方法 PCR扩增B7-H1启动子上游区域基因片段,并插入到含有荧光素酶报告基因的载体PGL3-Basic中构建重组子,经双酶切和测序鉴定后,将重组子转染Hep G2细胞,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶表达活性。结果成功地构建了6种不同长度的PGL3-B7-H1-Luc荧光素酶表达质粒,分别命名为P88、P175、P203、P398、P723和P960。瞬时转染Hep G2后经报告基因检测,P175、P203、P398、P723和P960所含5段启动子均具有转录活性,IFN-γ作用后启动子活性明显增强,而P88转染组IFN-γ作用后,荧光素酶活性无显著变化。结论成功构建了B7-H1启动子的荧光素酶报告基因载体。 展开更多

关键词 B7-H1 启动子 双荧光素酶报告基因检测 活性测定

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雄激素受体激动剂与拮抗剂高通量筛选细胞模型的构建 被引量：3

8

作者 王卓娅 傅强 +2 位作者 刘彩云 梁高卫 吴培诚 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期472-475,共4页

有效的雄激素受体(androgen receptor,AR)激动剂与拮抗剂,可上调或下调雄激素受体刺激反应,起到治疗相关疾病的作用。高通量细胞筛选模型的建立,可扩大AR激动剂与拮抗剂筛选范围,加快筛选速度。本研究通过构建人雄激素受体表达重组质粒p... 有效的雄激素受体(androgen receptor,AR)激动剂与拮抗剂,可上调或下调雄激素受体刺激反应,起到治疗相关疾病的作用。高通量细胞筛选模型的建立,可扩大AR激动剂与拮抗剂筛选范围,加快筛选速度。本研究通过构建人雄激素受体表达重组质粒pcDNA 3.1-h AR,并与受雄激素效应元件调控的报告基因质粒MMTV-LTR-Luc F-R共转染人胚胎肾细胞293T,构建基于双荧光素酶报告基因的AR激动剂与拮抗剂筛选高通量细胞模型。AR激动剂5α-双氢睾酮可诱导该细胞模型荧光素酶的产生,AR拮抗剂尼鲁他明可拮抗5α-DHT的刺激作用,糖皮质激素受体激动剂地塞米松对细胞模型荧光素酶的产生无作用。 展开更多

关键词 雄激素受体 激动剂 拮抗剂 双荧光素酶报告系统 高通量筛选

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转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用 被引量：3

9

作者 高书颖 李恩民 +2 位作者 杜则澎 陆晓峰 许丽艳 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期695-698,共4页

目的:明确转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用。方法:将转录因子表达载体CMV-Sp1和CMV-Sp3分别转染食管癌EC109细胞,采用定量RT-PCR和Western blot技术检测过表达转录因子Sp1和Sp3对ezrinmR-NA和蛋白表达的影响;将ez... 目的:明确转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用。方法:将转录因子表达载体CMV-Sp1和CMV-Sp3分别转染食管癌EC109细胞,采用定量RT-PCR和Western blot技术检测过表达转录因子Sp1和Sp3对ezrinmR-NA和蛋白表达的影响;将ezrin基因启动子驱动的报告基因表达载体与内参照质粒pRL-TK和转录因子表达载体共转染EC109细胞,采用双荧光素酶报告基因分析系统检测转录因子Sp1和Sp3对ezrin基因启动子的激活作用以及这种激活作用是否依赖于ezrin基因的Sp1结合位点-75/-69。结果:过表达转录因子Sp1和Sp3显著提高EC109细胞ezrinmRNA和蛋白表达水平以及启动子活性。Sp1和Sp3增强ezrin基因启动子活性的作用位点不同,只有Sp1通过-75/-69位点调控ezrin基因启动子活性。结论:转录因子Sp1和Sp3可调控EC109细胞ezrin基因的表达。 展开更多

关键词 EZRIN基因 食管癌细胞 转录因子 双荧光素酶报告基因分析系统

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人热休克因子1对抗增殖蛋白基因启动子转录调控的研究 被引量：2

10

作者 刘晓华 郭东升 +4 位作者 王新兴 张志清 战锐 王晓明 钱令嘉 《中国应用生理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期349-352,共4页

目的:研究人热休克因子1(hHSF1)对抗增殖蛋白(prohibitin)启动子转录活性的影响。方法:采用PCR方法扩增hHSF1全长编码序列,构建pcDNA3.1(+)-hHSF1真核表达载体,将pcDNA3.1(+)-hHSF1和人prohibitin基因启动子表达载体pGL3-prohibitin共... 目的:研究人热休克因子1(hHSF1)对抗增殖蛋白(prohibitin)启动子转录活性的影响。方法:采用PCR方法扩增hHSF1全长编码序列,构建pcDNA3.1(+)-hHSF1真核表达载体,将pcDNA3.1(+)-hHSF1和人prohibitin基因启动子表达载体pGL3-prohibitin共同转染HEK293细胞,采用双荧光素酶报告基因检测系统,检测双荧光素酶活性,分析hHSF1对抗增殖蛋白基因启动子的转录调控作用。结果:成功构建pcDNA3.1(+)-hHSF1真核表达载体,荧光素酶活性测定发现hHSF1明显上调pGL3-prohibitin转录。结论:hHSF1对prohibitin具有转录调控作用。 展开更多

关键词 PROHIBITIN hHSF1 转录调控 双荧光素酶报告基因检测系统

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棉铃虫细胞色素P450基因CYP9A17v2核心启动子区缺失分析 被引量：2

11

作者 严宇澄 武淑文 +1 位作者 杨亦桦 吴益东 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期825-831,共7页

CYP9A17v2的过量表达与棉铃虫Helicoverpa armigera对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性相关。为了研究CYP9A17v2表达调控机制,对CYP9A17v2核心启动子区域的功能进行了分析;构建了含荧光素酶报告基因和CYP9A17v2启动子不同长度缺失片段(-1095～+... CYP9A17v2的过量表达与棉铃虫Helicoverpa armigera对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性相关。为了研究CYP9A17v2表达调控机制,对CYP9A17v2核心启动子区域的功能进行了分析;构建了含荧光素酶报告基因和CYP9A17v2启动子不同长度缺失片段(-1095～+43)的重组质粒,转染Sf9细胞瞬时表达后用双荧光素酶报告基因检测系统检测启动子活性。功能分析结果表明:所有的7个缺失片段均具有启动子活性,-197～+43启动子区域的转录活性最高。在CYP9A17v2基因5′-调控区-197～-113区域内可能存在转录增强因子的结合位点,而在-1095～-197区域内可能存在转录抑制因子的结合位点。本研究为探索棉铃虫CYP9A17v2过量表达的转录调控机理奠定了重要基础。 展开更多

关键词 棉铃虫 细胞色素P450 CYP9A17v2 启动子 双荧光素酶报告基因系统 转录调控

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AP-2α对基质金属蛋白酶-20作用的研究 被引量：2

12

作者 赵娜 王玉民 +4 位作者 孙学玲 曲正 孙岩 张娟娟 高玉光 《牙体牙髓牙周病学杂志》 CAS 北大核心 2012年第4期183-188,共6页

目的:通过研究AP-2α转录因子对基质金属蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,进一步明确AP-2α的功能,为研究AP-2α在釉质形成中的作用奠定基础。方法:利用RT-PCR法、双荧光素酶报告基因检测系统、染色... 目的:通过研究AP-2α转录因子对基质金属蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,进一步明确AP-2α的功能,为研究AP-2α在釉质形成中的作用奠定基础。方法:利用RT-PCR法、双荧光素酶报告基因检测系统、染色体免疫共沉淀技术等来分析AP-2α与MMP-20启动子区域的转录调控能力。结果:小鼠成釉细胞转染AP-2αsiRNA后,成釉细胞中MMP-20 mRNA的表达水平显著上调。染色体免疫共沉淀结果显示,AP-2α可能通过与MMP-20启动子特征性序列相互作用,从而调控MMP-20的表达。双荧光素酶报告基因检测显示预测结合位点突变后,AP-2α对MMP-20启动子的表达水平无显著影响。结论:AP-2α基因沉默可显著上调MMP-20的mRNA表达水平;而AP-2α过表达可显著抑制MMP-20活性。提示AP-2α转录因子与成釉细胞内MMP-20启动子的特征性序列相互作用,从而调控MMP-20的表达水平。 展开更多

关键词 AP-2α转录因子 基质金属蛋白酶-20 RT-PCR 双荧光素酶报告基因检测 染色体免疫共沉淀

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AngⅡ通过AP-1调控内皮细胞中巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的表达 被引量：1

13

作者 冯治宽 单志新 +6 位作者 林秋雄 朱杰宁 麦丽萍 谭虹虹 邓春玉 邝素娟 余细勇 《热带医学杂志》 CAS 2010年第2期115-119,共5页

目的明确介导AngⅡ调控人内皮细胞中巨噬细胞移动抑制因子(migration inhibitory factor,MIF)表达的转录因子。方法构建长度依次递减的MIF基因5’调控区的荧光报告基因表达载体,并将其转化入人脐静脉内皮细胞EAhy926。利用双荧光基因报... 目的明确介导AngⅡ调控人内皮细胞中巨噬细胞移动抑制因子(migration inhibitory factor,MIF)表达的转录因子。方法构建长度依次递减的MIF基因5’调控区的荧光报告基因表达载体,并将其转化入人脐静脉内皮细胞EAhy926。利用双荧光基因报告系统检测AngⅡ诱导后MIF基因5’调控区不同区段的转录活性。通过突变转录活性高的MIF5’调控区序列,初步确定可能的转录因子结合序列。设计针对可能的转录因子的小干扰RNA(siRNA)序列,并构建其表达载体,分别检测候选转录因子沉默的HEAY926中MIF的转录活性和表达水平。结果双荧光基因报告检测显示,AngⅡ调控MIF表达的高转录活性区段位于-507至-188之间。序列突变和荧光素酶活性分析显示,MIF基因5’调控区-350至-339间的AP-1结合序列决定了MIF基因的转录活性。AP-1沉默后的HEAY926中AngⅡ调控的MIF转录活性显著降低(P<0.05),MIFmRNA和蛋白的表达水平也显著降低(P<0.05)。结论AngⅡ通过转录因子AP-1调控内皮细胞中MIF的表达。 展开更多

关键词 双萤光素酶报告基因系统 巨噬细胞移动抑制因子 AngⅡ 克隆 分子

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丙型肝炎病毒核心蛋白对胞外基质金属蛋白酶诱导物基因转录的影响 被引量：1

14

作者 冯晓燕 郭兰芹 +3 位作者 贺锋 许立博 宋晓国 张贺秋 《生物技术通讯》 CAS 2009年第2期166-168,172,共4页

目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN)基因转录的影响。方法:构建HCV核心蛋白真核表达载体和EMMPRIN启动子删除突变体pGL3载体,应用双萤光素酶报告基因系统检测EMMPRIN启动子不同删除突变体的转录活... 目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN)基因转录的影响。方法:构建HCV核心蛋白真核表达载体和EMMPRIN启动子删除突变体pGL3载体,应用双萤光素酶报告基因系统检测EMMPRIN启动子不同删除突变体的转录活性,并寻找核心蛋白上调EMMPRIN转录相关的关键启动子区段。结果:HCV核心蛋白可以显著上调EMMPRIN的表达;调节EMMPRIN转录的启动子关键区段为+1～435bp,HCV核心蛋白主要通过该关键区段上调EMMPRIN的转录,并呈现剂量依赖性。结论:HCV核心蛋白有可能通过EMMPRIN启动子关键区段上调EMMPRIN的转录,从而上调基质金属蛋白酶,最终导致肝癌转移。 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒核心蛋白 胞外基质金属蛋白酶诱导物 双萤光素酶报告基因系统 转录

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微小RNA-124调控靶基因IQ结构域三磷酸鸟苷合酶-激活蛋白1的表达抑制甲状腺乳头状癌细胞生长、侵袭、转移的研究 被引量：1

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作者 王卓路 夏发达 +2 位作者 冯铁诚 彭瑶 李新营 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期79-83,共5页

目的检测微小RNA（miRNA，miR）-124在甲状腺乳头状癌（PTC）组织中的表达，探讨miR-124在PTC发生发展、侵袭转移中的相关功能机制，验证IQ结构域三磷酸鸟苷合酶-激活蛋白1（IQGAP1）为miR-124的靶基因。方法收集手术切除并经病理检查... 目的检测微小RNA（miRNA，miR）-124在甲状腺乳头状癌（PTC）组织中的表达，探讨miR-124在PTC发生发展、侵袭转移中的相关功能机制，验证IQ结构域三磷酸鸟苷合酶-激活蛋白1（IQGAP1）为miR-124的靶基因。方法收集手术切除并经病理检查确诊的不同病理学背景的甲状腺组织。检测miR-124在上述组织中的表达。选取3个PTC细胞株及正常甲状腺细胞株检测miR-124的表达差异。将人类miR-124模拟物（Has—miR-124 mimics）转染入K1细胞，检测转染后miR-124的表达。同时检测下游靶基因IQGPAl的表达；噻唑蓝（MTr）法、划痕实验、Transwell法、流式细胞学检测细胞生物学活性变化。运用生物信息学预测IQGAPl为miR-124的可能的下游靶基因并用双荧光素酶报告基因系统验证。结果有转移PTC淋巴结转移灶中miR-124的相对表达量为1．120±0．104，低于转移PTC原发灶、无转移PTC、正常甲状腺组织中miR-124的表达量（P〈0．05）。PTC细胞株中miR-124的表达也较正常甲状腺细胞株明显降低（P〈0．05）。miR-124 mimics转染K1后检测证实miR-124被成功增强。K1细胞中miR-124表达增强后24～72h后活细胞数目明显少于对照组（P〈0．05）。迁徙能力为对照组的50％，侵袭能力为对照组的40％（P〈0．05）。细胞增殖指数降低，凋亡增加（P〈0．05）。用生物信息学方法预测IQGAPl为miR-124的可能靶基因。证实miR．124增强后IQGAP]的表达量有不同程度地降低。证实了IQGAPl为miR-124的下游靶基因。结论miR-124在PTC及PTC细胞株中低表达。miR-124表达增强后，K1细胞的迁徙侵袭、增殖能力降低，凋亡增加。生物信息学预测，IQGAP1为miR-124的靶基因。miR-124表达增强后，K1细胞中的IQGAP1表达降低。 展开更多

关键词 甲状腺癌 微小RNA-124 IQ结构域三磷酸鸟苷合酶-激活蛋白1 双荧光素酶报告基因

原文传递

利用双萤光素酶报告基因系统筛选有效的siRNA 被引量：1

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作者 单志新 林秋雄 +4 位作者 谭虹虹 邓春玉 刘晓颖 肖定璋 余细勇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期1577-1581,1584,共6页

目的建立一种利用双萤光素酶报告基因系统筛选能有效抑制目的基因表达的小干扰RNA(siRNA)的方法。方法以绿色荧光蛋白(GFP)基因为研究对象,构建3个候选的靶向GFP的siRNA表达质粒pSi-GFPsiRNA1、pSi-GFPsiRNA2、pSi-GFPsiRNA3和阴性对照p... 目的建立一种利用双萤光素酶报告基因系统筛选能有效抑制目的基因表达的小干扰RNA(siRNA)的方法。方法以绿色荧光蛋白(GFP)基因为研究对象,构建3个候选的靶向GFP的siRNA表达质粒pSi-GFPsiRNA1、pSi-GFPsiRNA2、pSi-GFPsiRNA3和阴性对照pSi-Negative。构建拥有同一Kozak共有翻译启始序列、翻译启始密码子ATG的GFP与萤光素酶基因(LUC)的融合表达载体pGL3-GFPf。将包含3个GFPsiRNA靶序列的GFP片段插入到改建过的pGL3-promoter载体上LUC的3'非翻译区(UTR),构建pGL3-GFPp。将GFPsiRNA表达质粒联同内参照质粒pRL-TK分别与pGL3-GFPf、pGL3-GFPp共转化HEK293细胞。利用双萤光素酶检测试剂盒测定各组细胞中萤光素酶的活力水平,用荧光定量PCR检测各组细胞中GFPmRNA的表达水平。结果同对照组相比,与pGL3-GFPf共转化GFPsiRNA表达质粒的各组细胞中萤火虫萤光素酶/海肾萤光素酶比值明显降低,其中GFPsiRNA1表达组中降低最显著(P<0.01);定量PCR检测也显示,GFPsiRNA1表达组中GFPmRNA的表达水平降低最明显(P<0.01)。双萤光素酶活性检测和定量PCR结果还显示,与pGL3-GFPp共转化GFPsiRNA表达质粒的各组细胞中,GFPsiRNA1抑制GFP的表达最显著(P<0.01)。结论本文建立了通过双萤光素酶活性检测来筛选有效的siRNA的方法,并为进行多个基因的有效siRNA的筛选提供解决方案。 展开更多

关键词 双萤光素酶报告基因系统 RNA干扰 荧光定量PCR 绿色荧光蛋白

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Cyclin H基因启动子区-1 SNP对转录活性的影响 被引量：1

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作者 陈佩林 陈鑫 +1 位作者 郑红霞 吴奇涵 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2008年第7期734-737,共4页

目的探讨CCNH基因启动子区-1SNP位点碱基变异对CCNH基因转录活性的影响。方法通过PCR和定点突变技术,构建了含CCNH基因基础启动子及-1G突变启动子,用双荧光素酶报告系统观察此SNP对CCNH基因启动子转录活性的影响。结果在AD293细胞中,-1... 目的探讨CCNH基因启动子区-1SNP位点碱基变异对CCNH基因转录活性的影响。方法通过PCR和定点突变技术,构建了含CCNH基因基础启动子及-1G突变启动子,用双荧光素酶报告系统观察此SNP对CCNH基因启动子转录活性的影响。结果在AD293细胞中,-1G突变启动子活性比CCNH基础启动子活性低26%(P<0.05)。结论-1T→G碱基变异可显著降低CCNH基因启动子转录活性。 展开更多

关键词 CCNH基因 SNP 双荧光素酶报告系统

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hsa-miR-26b沉默载体的构建及验证

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作者 史春梅 徐广峰 +6 位作者 宋桂仙 季晨博 陈玲 杨蕾 庞玲霞 赵亚萍 郭锡熔 《临床检验杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期503-506,共4页

目的构建hsa-miR-26b沉默载体,与其靶基因PTEN共转染HEK-293T细胞验证其沉默效果。方法用miRNA海绵体技术设计并合成与hsa-miR-26b成熟序列反向互补的3个重复序列的双链DNA,将短发卡状RNA(shRNA)克隆入LV3-GFP-Puro载体,与靶基因PTEN共... 目的构建hsa-miR-26b沉默载体,与其靶基因PTEN共转染HEK-293T细胞验证其沉默效果。方法用miRNA海绵体技术设计并合成与hsa-miR-26b成熟序列反向互补的3个重复序列的双链DNA,将短发卡状RNA(shRNA)克隆入LV3-GFP-Puro载体,与靶基因PTEN共转染HEK-293T细胞,于24 h后收集细胞RNA,用real-time PCR检测hsa-miR-26b表达水平,同时用双荧光素报告系统检测其对靶基因的作用。结果成功构建了有效的hsa-miR-26b沉默载体,经测序验证与设计序列一致;real-time PCR验证hsa-miR-26b表达水平降低了75%;双荧光素报告系统验证其对靶基因无抑制作用(P>0.05)。结论成功构建hsa-miR-26b沉默载体,并验证其对靶基因PTEN无抑制作用。 展开更多

关键词 hsa-miR-26b 海绵体载体 双荧光素报告系统 人脂肪细胞

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DAX-1真核表达载体的构建及其活性的检测

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作者 杨丽华 王芳 +1 位作者 余柯达 邹立波 《浙江临床医学》 2021年第5期637-639,共3页

目的克隆剂量敏感的性别反转-先天性肾上腺发育不良基因1(DAX-1)的cDNA,构建带HA多肽标签的DAX-1真核表达载体,并检测其在小鼠肾上腺皮质瘤细胞(Y-1)中的转录活性.方法应用RT-PCR法从人睾丸中扩增DAX-1,将测序正确的PCR产物克隆至3'... 目的克隆剂量敏感的性别反转-先天性肾上腺发育不良基因1(DAX-1)的cDNA,构建带HA多肽标签的DAX-1真核表达载体,并检测其在小鼠肾上腺皮质瘤细胞(Y-1)中的转录活性.方法应用RT-PCR法从人睾丸中扩增DAX-1,将测序正确的PCR产物克隆至3'端带HA多肽标签pcDNA3.1(+)真核表达载体中,以脂质体方式将该质粒或pcDNA3.1(+)-3'HA空载与类固醇激素灵敏调节蛋白(StAR)启动子荧光素酶报告基因载体共转染至Y-1细胞中,24 h后利用双荧光素酶报告系统检测DAX-1对StAR表达的影响.结果RT-PCR获取编码DAX-1基因的全序列cDNA,大小为1413bp;DNA测序和PCR方法证实DAX-1基因成功克隆到pcDNA3.1(+)-3'HA真核表达载体中;瞬时转染Y-1细胞,经报告基因检测结果显示DAX-1与StAR共转染组(实验组)的荧光素酶活性是空载组(对照组)的1/3.结论成功构建人DAX-1真核表达载体,并在Y-1细胞中初步活性分析得知所克隆的DAX-1存在转录活性,为进一步研究DAX-1功能及调控机制奠定实验基础. 展开更多

关键词 DAX-1 STAR 载体构建 双荧光素酶报告系统

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SPDEF调控小鼠成釉细胞MMP-20基因表达的分子机制研究

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作者 纪虹利 杜森 +3 位作者 董超 张世龙 靖旭 高玉光 《潍坊医学院学报》 2013年第1期18-21,共4页

目的通过克隆转录因子SPDEF以及其真核表达载体的构建,分析该基因对成釉细胞MMP-20基因表达的影响,为进一步研究转录因子SPDEF在牙釉质形成中发挥的作用奠定基础。方法利用RT-PCR技术从小鼠成釉细胞中获得SPDEF基因,测序正确后克隆至pcD... 目的通过克隆转录因子SPDEF以及其真核表达载体的构建,分析该基因对成釉细胞MMP-20基因表达的影响,为进一步研究转录因子SPDEF在牙釉质形成中发挥的作用奠定基础。方法利用RT-PCR技术从小鼠成釉细胞中获得SPDEF基因,测序正确后克隆至pcDNA3.1/myc-HisA载体中,将重组质粒瞬时转染成釉细胞,并用双荧光素酶报告基因系统检测技术来检测MMP-20启动子区域的转录活性。结果①SPDEF基因经过RT-PCR扩增得到的产物与预期片段978bp相符,将所获得的目的基因与GenBank提供的已知序列(NM:013891.4)完全一致。②重组质粒pcDNA3.1/myc-HisA-SPDEF转染成釉细胞后,用荧光素酶分析系统检测显示MMP-20启动子转录活性升高。结论成功构建了SPDEF真核表达载体,初步研究证明SPDEF可能与MMP-20特征性序列结合从而上调MMP-20的表达。 展开更多

关键词 转录因if-SPDEF 金属机制蛋白 -20 RT—PCR 双荧光素酶报告基因检测

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