葡萄糖调节蛋白75(glucose-regulated protein75,Grp75)与细胞内的p53结合抑制其核移位,起到了保护细胞的作用。为研究Grp75和p53的结合与否是如何影响细胞活力,现构建Grp75缺失突变基因的真核表达载体。以SOE-PCR(genesplicing by over...葡萄糖调节蛋白75(glucose-regulated protein75,Grp75)与细胞内的p53结合抑制其核移位,起到了保护细胞的作用。为研究Grp75和p53的结合与否是如何影响细胞活力,现构建Grp75缺失突变基因的真核表达载体。以SOE-PCR(genesplicing by overlap extension)法得到Grp75缺失突变基因,与pcDNA3.0真核表达载体连接,构建Grp75缺失突变的特异性表达载体pcDNA3.0/Grp75(Δ253-282),经酶切、测序鉴定Grp75缺失突变蛋白表达载体成功构建。用脂质体将pcDNA3.0/Grp75(Δ253-282)转染到PC12细胞株,以1mg/mL浓度的G418筛选出稳定株,并命名为PC12/Grp75(Δ253-282)(+)。半定量RT-PCR和Western blot结果显示PC12/Grp75(Δ253-282)(+)细胞组内Grp75的mRNA和蛋白的表达水平较PC12细胞组增高。对PC12细胞组、PC12/Grp75(Δ253-282)(+)细胞组和PC12/Grp75(+)细胞组(pcDNA3/Grp75真核表达载体已构建)分别缺糖0h、3h、9h、18h和36h,MTT法检测各组细胞活力,Hoechst33324法检测细胞凋亡情况。结果显示PC12/Grp75(+)组细胞活力高于其它两组,PC12/Grp75(Δ253-282)(+)组高于PC12组,差异有统计学意义。Hoechst33324染色后,凋亡细胞的比率与MTT细胞活力检测结果基本一致。Western blot检测三种细胞内p53的表达量,PC12/Grp75(+)细胞内p53蛋白表达量低于另外两组,可能是由于Grp75蛋白量的增多部分抑制了p53的表达,提示Grp75对缺糖诱导细胞凋亡的抑制作用部分与p53的结合有关。以上结果表明Grp75基因的缺失突变在一定程度上降低了细胞的活力。展开更多
