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亮氨酸拉链促进蛋白质剪接介导的双载体转凝血Ⅷ因子基因 被引量：2
1
作者 朱甫祥 杨树德 +3 位作者 刘泽隆 缪静 屈慧鸽 迟晓艳 《药学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期39-44,共6页
作者最近基于蛋白内含子(intein)的双载体转B区缺失型凝血Ⅷ因子(BDD-FⅧ)基因研究证明,表达后的重、轻链可通过蛋白质反式剪接成为共价连接的完整BDD-FⅧ分子并发挥凝血生物活性,但存在不完全剪接的前体蛋白。本文试图通过将具有特异... 作者最近基于蛋白内含子(intein)的双载体转B区缺失型凝血Ⅷ因子(BDD-FⅧ)基因研究证明,表达后的重、轻链可通过蛋白质反式剪接成为共价连接的完整BDD-FⅧ分子并发挥凝血生物活性,但存在不完全剪接的前体蛋白。本文试图通过将具有特异性强相互作用的亮氨酸拉链引入intein序列,提高反式剪接的效率,用双载体系统向培养的COS-7细胞共转融合intein的重链和轻链基因,通过瞬时表达观察了细胞内BDD-FⅧ的剪接和分泌至培养上清液的剪接BDD-FⅧ量和生物活性。结果显示,Western blotting检测到共转基因细胞内明显增强的BDD-FⅧ剪接,表现为前体蛋白的减少;分别用ELISA和Coatest法分析共转基因细胞培养上清液中分泌的剪接BDD-FⅧ蛋白量和生物活性为(106±12)ng.mL-1和(0.89±0.11)U.mL-1,明显高于无亮氨酸拉链的intein融合重链和轻链基因共转基因细胞[(72±10)ng.mL-1和(0.62±0.07)U.mL-1],而且不依赖细胞机制的蛋白质剪接反应明显增强,表现为混合培养的转重链和轻链基因细胞上清液中增加的剪接BDD-FⅧ蛋白量和生物活性[(36±11)ng.mL-1和(0.28±0.09)U.mL-1]。结果表明,亮氨酸拉链可通过增强融合于重链和轻链的intein间的相互作用提高蛋白质反式剪接的效率,改善基于蛋白质剪接的双载体转BDD-FⅧ基因的效果,为进一步的动物体内基于蛋白质剪接的双腺相关病毒(AAV)载体转FⅧ基因研究提供了实验依据。 展开更多
关键词 凝血Ⅷ因子 INTEIN 蛋白质反式剪接 亮氨酸拉链
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轻链二硫键缺失突变促进链间重组二硫键BDD-FVⅢ变构体分泌 被引量：1
2
作者 刘泽隆 缪静 +2 位作者 屈慧鸽 迟晓艳 朱甫祥 《药学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期54-59,共6页
凝血VⅢ因子(coagulation factor VⅢ, FVⅢ)分子内含有8对二硫键,参与维持其结构和功能,轻链A3结构域中Cys1899/Cys1903间的二硫键阻碍分泌,本室曾通过在FVⅢ重链和轻链间引入重组二硫键,证明其可促进消除B结构域的FVⅢ (B domain-dele... 凝血VⅢ因子(coagulation factor VⅢ, FVⅢ)分子内含有8对二硫键,参与维持其结构和功能,轻链A3结构域中Cys1899/Cys1903间的二硫键阻碍分泌,本室曾通过在FVⅢ重链和轻链间引入重组二硫键,证明其可促进消除B结构域的FVⅢ (B domain-deleted FVⅢ, BDD-FVⅢ)重、轻链异源二聚体的组装和分泌。本文在此基础上将BDD-FVⅢ的重链A2区Met662和轻链A3区Asp1828突变为Cys,从而构建可形成链间二硫键的变构体F8C。将F8C轻链A3区Cys1899和Cys1903突变为Gly,从而消除内源性二硫键,得到变构体F8CG,并探索这两种BDD-FVⅢ变构体的分泌促进作用。通过HEK293和COS-7细胞的基因瞬时转染实验,检测细胞表达变构体多肽的二硫键形成情况和培养上清中变构体多肽的分泌量和凝血活性,并检测变构体的血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)结合力。结果显示,细胞转基因表达产物F8C和F8CG均以二硫键连接的异源二聚体多肽为主,而野生型BDD-FVⅢ以易于解离的异源二聚体多肽为主。F8C分泌量和活性明显高于野生型BDD-FVⅢ, F8CG的分泌量和活性相对于F8C得到进一步提高,显示轻链二硫键的破坏对分泌具有促进作用,而对vWF的结合力无显著性影响。本文为进一步的变构体体内转基因研究奠定了基础。 展开更多
关键词 凝血vⅲ因子 二硫键突变 转基因 分泌
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前肽缺失vWF促进细胞分泌蛋白质剪接的L303E/F309S突变体凝血第八因子
3
作者 朱甫祥 刘泽隆 +2 位作者 缪静 屈慧鸽 迟晓艳 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期988-991,共4页
该文旨在探索前肽缺失的von Willebrand因子(vWF-ΔPro)对蛋白质剪接的L303E/F309S突变体凝血第八因子(FVIII)分泌的影响。将vWF-ΔPro基因与蛋白内含子融合的FVIII重链和轻链基因共转HEK293细胞。结果显示,转vWF-ΔPro细胞的剪接蛋白FV... 该文旨在探索前肽缺失的von Willebrand因子(vWF-ΔPro)对蛋白质剪接的L303E/F309S突变体凝血第八因子(FVIII)分泌的影响。将vWF-ΔPro基因与蛋白内含子融合的FVIII重链和轻链基因共转HEK293细胞。结果显示,转vWF-ΔPro细胞的剪接蛋白FVIII分泌量和活性分别为(196±27)ng/mL和(1.39±0.31)IU/mL,明显高于对照细胞的(116±24)ng/mL和(0.91±0.18)IU/mL。表明vWF-ΔPro可提高剪接的L303E/F309S突变体FVIII蛋白分泌量和活性。 展开更多
关键词 vWF 凝血第八因子 蛋白质剪接 分泌
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第三批人凝血因子VⅢ浓制剂国家标准品的协作标定
4
作者 沈琦 任跃明 +11 位作者 刘大英 季荣科 吴志华 王德生 薛镭 贾玉华 何慧敏 杨晓敏 曹勤立 王丹君 沈宝荣 王坚 《微生物学免疫学进展》 2002年第3期42-45,共4页
为更替第二批人凝血因子VⅢ浓制剂国家标准品 ,以WHO 97/ 6 16批重组人凝血因子VⅢ浓制剂国际标准品为对照 ,采用一期法协作标定第三批人凝血因子Ⅷ浓制剂二个候选国家标准品X和Y。并将标准品分别置 4℃、2 2℃、37℃保存 4 .5个月 ,用... 为更替第二批人凝血因子VⅢ浓制剂国家标准品 ,以WHO 97/ 6 16批重组人凝血因子VⅢ浓制剂国际标准品为对照 ,采用一期法协作标定第三批人凝血因子Ⅷ浓制剂二个候选国家标准品X和Y。并将标准品分别置 4℃、2 2℃、37℃保存 4 .5个月 ,用加速破坏试验进行稳定性考查。结果表明 ,X(2 0 0 10 6 0 6批 )候选标准品效价为 3.8IU/支 ;Y(2 0 0 10 6 0 7批 )候选标准品效价为 7.3IU/支。X批候选标准品比Y候选标准品稳定性好。其它项目均达到国家标准品要求。 展开更多
关键词 人凝血因子vⅲ浓制剂 国家标准品 协作标定 稳定性
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