【目的】人微小纤溶酶原是由261个氨基酸组成的肽链,位于人纤溶酶原第549~790位,含有纤溶酶原活性区域,被激活后具有纤溶活性,能够降解纤维蛋白。本文旨在优化人微小纤溶酶原cDNA在毕赤酵母中的表达条件。【方法】在NCBI中获取人微小纤...【目的】人微小纤溶酶原是由261个氨基酸组成的肽链,位于人纤溶酶原第549~790位,含有纤溶酶原活性区域,被激活后具有纤溶活性,能够降解纤维蛋白。本文旨在优化人微小纤溶酶原cDNA在毕赤酵母中的表达条件。【方法】在NCBI中获取人微小纤溶酶原氨基酸序列,根据毕赤酵母密码子偏爱性原理,设计对应的DNA序列,然后进行人工合成。合成的基因序列经测序验证后酶切与表达载体pPICZαA连接形成重组表达质粒pPICZαA-mPlg,转入大肠杆菌JM109中扩增质粒,提取阳性菌落中的重组质粒,双酶切获得人微小纤溶酶原的表达单元,然后构建4拷贝(表达单元)pPICZαA-mPlg,单酶切线性化质粒。然后电转化导入感受态毕赤酵母SMD1168中,经表型筛选、PCR筛选阳性克隆,获得高表达人微小纤溶酶原工程菌。培养工程菌后,甲醇诱导工程菌细胞让人微小纤溶酶c DNA表达,用SDS-PAGE检查其分子量,发色底物法检测微小纤溶酶原活性,通过发酵条件优化提高人微小纤溶酶原的产量,用SP-Sepharose fast flow凝胶层析方法纯化目标蛋白。【结果】SDS-PAGE检测到符合人微小纤溶酶原分子量大小的蛋白条带,同时发色底物法检测出样品中含有纤溶活性,其水平达到90 U/mL。【结论】本文为后续进行大规模表达人微小纤溶酶原打下了基础。展开更多
目的初步研究具有自主知识产权的重组表达人凝血因子(rFⅧ)在研品种的临床前药代动力学。方法建立并优化生色底物活性检测方法,用于测定血浆样品中FⅧ活性浓度(FⅧ∶C);选择市售进口的同类药物Xyntha为参比药物,对只敲除了FⅧ基因的...目的初步研究具有自主知识产权的重组表达人凝血因子(rFⅧ)在研品种的临床前药代动力学。方法建立并优化生色底物活性检测方法,用于测定血浆样品中FⅧ活性浓度(FⅧ∶C);选择市售进口的同类药物Xyntha为参比药物,对只敲除了FⅧ基因的模型小鼠(HA小鼠)分组(n=18)单次尾静脉注射280 IU·kg-1受试药rhFⅧ或参比药Xyntha,在0、0.083、1、3、6、9、24、36和48 h采集血浆样品(30μL/只,每个时间点6个样品),测定其FⅧ∶C并计算药代动力学参数。结果受试rhFⅧ组和参比药Xyntha组给药后,0.083、1、3、6、9、24、36和48 h的血浆FⅧ∶C(IU·mL-1)分别为3.218±1.511 vs 3.616±1.504、2.089±0.593 vs 2.786±1.157、1.953±0.546 vs1.942±0.807、0.613±0.360 vs 1.025±0.321、0.515±0.370 vs 0.894±0.297、0.187±0.082 vs 0.310±0.108、0.061±0.038 vs 0.115±0.040、0.043±0.042 vs 0.023±0.012(P>0.05);主要药代动力学参数:t1/2(h)分别为8.83 vs9.15,AUC0-t(h·IU·mL-1)分别为19.67 vs 27.70,Vd(mL·kg-1)分别为176.37 vs 132.00,CL(mL·h-1·kg-1)分别为13.85 vs 10.00,MRT0-t(h)分别为8.64 vs 9.62。结论受试rhFⅧ单次HA小鼠尾静脉给药280 IU·kg-1后在小鼠体内的药代动力学过程与市售同类进口药物Xyntha基本一致。展开更多
文摘【目的】人微小纤溶酶原是由261个氨基酸组成的肽链,位于人纤溶酶原第549~790位,含有纤溶酶原活性区域,被激活后具有纤溶活性,能够降解纤维蛋白。本文旨在优化人微小纤溶酶原cDNA在毕赤酵母中的表达条件。【方法】在NCBI中获取人微小纤溶酶原氨基酸序列,根据毕赤酵母密码子偏爱性原理,设计对应的DNA序列,然后进行人工合成。合成的基因序列经测序验证后酶切与表达载体pPICZαA连接形成重组表达质粒pPICZαA-mPlg,转入大肠杆菌JM109中扩增质粒,提取阳性菌落中的重组质粒,双酶切获得人微小纤溶酶原的表达单元,然后构建4拷贝(表达单元)pPICZαA-mPlg,单酶切线性化质粒。然后电转化导入感受态毕赤酵母SMD1168中,经表型筛选、PCR筛选阳性克隆,获得高表达人微小纤溶酶原工程菌。培养工程菌后,甲醇诱导工程菌细胞让人微小纤溶酶c DNA表达,用SDS-PAGE检查其分子量,发色底物法检测微小纤溶酶原活性,通过发酵条件优化提高人微小纤溶酶原的产量,用SP-Sepharose fast flow凝胶层析方法纯化目标蛋白。【结果】SDS-PAGE检测到符合人微小纤溶酶原分子量大小的蛋白条带,同时发色底物法检测出样品中含有纤溶活性,其水平达到90 U/mL。【结论】本文为后续进行大规模表达人微小纤溶酶原打下了基础。
文摘目的初步研究具有自主知识产权的重组表达人凝血因子(rFⅧ)在研品种的临床前药代动力学。方法建立并优化生色底物活性检测方法,用于测定血浆样品中FⅧ活性浓度(FⅧ∶C);选择市售进口的同类药物Xyntha为参比药物,对只敲除了FⅧ基因的模型小鼠(HA小鼠)分组(n=18)单次尾静脉注射280 IU·kg-1受试药rhFⅧ或参比药Xyntha,在0、0.083、1、3、6、9、24、36和48 h采集血浆样品(30μL/只,每个时间点6个样品),测定其FⅧ∶C并计算药代动力学参数。结果受试rhFⅧ组和参比药Xyntha组给药后,0.083、1、3、6、9、24、36和48 h的血浆FⅧ∶C(IU·mL-1)分别为3.218±1.511 vs 3.616±1.504、2.089±0.593 vs 2.786±1.157、1.953±0.546 vs1.942±0.807、0.613±0.360 vs 1.025±0.321、0.515±0.370 vs 0.894±0.297、0.187±0.082 vs 0.310±0.108、0.061±0.038 vs 0.115±0.040、0.043±0.042 vs 0.023±0.012(P>0.05);主要药代动力学参数:t1/2(h)分别为8.83 vs9.15,AUC0-t(h·IU·mL-1)分别为19.67 vs 27.70,Vd(mL·kg-1)分别为176.37 vs 132.00,CL(mL·h-1·kg-1)分别为13.85 vs 10.00,MRT0-t(h)分别为8.64 vs 9.62。结论受试rhFⅧ单次HA小鼠尾静脉给药280 IU·kg-1后在小鼠体内的药代动力学过程与市售同类进口药物Xyntha基本一致。
