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悬铃木方翅网蝽化学感受蛋白CcilCSP1的结构及其结合寄主挥发物的预测分析 被引量：9
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作者 付宁宁 刘佳 +4 位作者 渠成 王然 许奕华 罗晨 李峰奇 《林业科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2017年第10期109-117,共9页
【目的】分析悬铃木方翅网蝽化学感受蛋白编码基因CcilCSP1的序列和表达特征,重点研究CcilCSP1结合二球悬铃木寄主植物挥发物的能力,旨在为CcilCSP1的功能研究提供理论参考,为通过化学感受蛋白反向模拟筛选悬铃木方翅网蝽的信息素物质... 【目的】分析悬铃木方翅网蝽化学感受蛋白编码基因CcilCSP1的序列和表达特征,重点研究CcilCSP1结合二球悬铃木寄主植物挥发物的能力,旨在为CcilCSP1的功能研究提供理论参考,为通过化学感受蛋白反向模拟筛选悬铃木方翅网蝽的信息素物质提供依据。【方法】用分子克隆技术获得悬铃木方翅网蝽化学感受蛋白CcilCSP1基因ORF的全长序列,用RT-qPCR研究该基因的表达模式,并通过生物信息学方法分析其序列特征。用Swiss-model构建CcilCSP1蛋白的三维结构,并通过AutoDock 4.2开展CcilCSP1蛋白与寄主植物9种挥发物成份的分子对接,用Amber 14对其中结合最为稳定的反式-β-石竹烯与CcilCSP1蛋白的复合物开展了10 000 ps的分子动力学模拟,并进一步通过"Y"型嗅觉仪测定反式-β-石竹烯对悬铃木方翅网蝽成虫的行为学影响。【结果】成功克隆到该虫的化学感受蛋白基因CcilCSP1,且该基因在成虫中显著高表达。序列分析表明,CcilCSP1具有CSPs家族的典型特征,该基因与绿盲蝽的AlucCSP1,AlucCSP3,AlucCSP8以及苜蓿盲蝽的AlinCSP1亲缘关系较近。同源建模和分子对接发现,在二球悬铃木9种植物挥发物中反式-β-石竹烯与CcilCSP1的结合能力最强(k_l=2.63μm,Binding Energy=-7.61),通过分析二者的结合特性,推测TYR-29、GLN-83、LEU-64、ASP-30可能是CcilCSP1蛋白结合反式-β-石竹烯所需的关键氨基酸位点。分子动力学模拟结果显示,CcilCSP1蛋白能够与反式-β-石竹烯稳定结合。进一步的行为学试验表明,0.1μg的反式-β-石竹烯对悬铃木方翅网蝽成虫有显著的驱避作用。【结论】本研究克隆到在成虫中显著高表达的悬铃木方翅网蝽化学感受蛋白基因CcilCSP1。用分子对接和分子动力学模拟方法发现CcilCSP1能与二球悬铃木寄主挥发物成份反式-β-石竹烯稳定结合,并通过进一步的行为学试验进行证实。该研究可为悬铃木方翅网蝽化学 展开更多
关键词 悬铃木方翅网蝽 化学感受蛋白 寄主植物挥发物 分子对接 分子动力学模拟
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Q型烟粉虱化学感受蛋白CSP1与植物挥发物的结合特征 被引量：9
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作者 吴帆 张晓曼 +3 位作者 赵磊 崔旭红 李红亮 罗晨 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第10期1955-1961,共7页
【目的】克隆Q型烟粉虱(Bemisia tabaci)化学感受蛋白1(chemosensory protein 1,CSP1)基因,诱导表达Q型烟粉虱CSP1重组蛋白(以下简称Bt CSP1),研究其与主要寄主植物挥发性气味分子的结合特性。【方法】利用全长引物通过RT-PCR扩增并克隆... 【目的】克隆Q型烟粉虱(Bemisia tabaci)化学感受蛋白1(chemosensory protein 1,CSP1)基因,诱导表达Q型烟粉虱CSP1重组蛋白(以下简称Bt CSP1),研究其与主要寄主植物挥发性气味分子的结合特性。【方法】利用全长引物通过RT-PCR扩增并克隆Q型烟粉虱CSP1基因ORF全长,连接并构建p ET-30a(+)原核表达载体,转化入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,并用IPTG诱导表达Bt CSP1重组蛋白。收集菌液后超声破碎细胞,离心取上清,经Ni2+-琼脂糖柱结合梯度浓度咪唑洗脱纯化后,经PBS反复透析获得重组蛋白,并用Bradford法测定重组蛋白浓度。采用常见的N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)荧光探针作为报告子,利用荧光竞争结合法研究重组Bt CSP1蛋白与植物挥发物的结合功能。首先用1 mmol·L-1 1-NPN滴定Bt CSP1蛋白溶液,直至蛋白最大发射波长处的荧光值完全猝灭为止,然后再以各供试配基滴定Bt CSP1-1-NPN体系,通过配基竞争猝灭1-NPN最大发射波长,并用Scatchard等方程计算表征Bt CSP1与配基亲和力大小的解离常数KD。【结果】克隆了Q型烟粉虱CSP1基因ORF全长,经双酶切和连接构建了p ET-30a(+)/CSP1重组质粒,在IPTG终浓度为1 mmol·L-1的条件下诱导获得了Bt CSP1重组蛋白,Ni2+-琼脂糖柱纯化透析后测定重组蛋白浓度,稀释至1.5μmol·L-1作为工作浓度。在荧光光谱试验中,Scatchard方程线性化后(相关系数达到0.9967),显示Bt CSP1与1-NPN的解离常数K1-NPN为2.78μmol·L-1,结合位点数n为0.82,表明两者结合较好,且基本是1:1结合,适合作为本试验中竞争性荧光结合试验的报告子。在荧光竞争结合试验中,有多种供试植物挥发物分子能使1-NPN的相对荧光强度降低到50%以下,其中包括能引起烟粉虱趋避行为的化合物,如3-蒈烯、p-伞花烃、顺-3-己烯-1-醇和α-蒎烯(KD值分别为26.47、39.43、54.01和83.46μmol·L-1),且3-蒈烯具有较强的竞争结合能力,能在200μmol· 展开更多
关键词 烟粉虱 化学感受蛋白 原核表达 植物挥发物 结合特性
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