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原代奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养方法的改进 被引量：9
1
作者 王仕宇 李博通 +2 位作者 刘佳玮 倪耀娣 刘明超 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第3期958-964,共7页
目前利用奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养技术,建立奶牛子宫内膜炎模型从而减少不可控因素来研究奶牛子宫内膜炎疾病已成为国内外普遍使用的一类方法,因此获得高纯度、同一性的子宫内膜上皮细胞是体外研究的关键环节,国内外所使用方法主... 目前利用奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养技术,建立奶牛子宫内膜炎模型从而减少不可控因素来研究奶牛子宫内膜炎疾病已成为国内外普遍使用的一类方法,因此获得高纯度、同一性的子宫内膜上皮细胞是体外研究的关键环节,国内外所使用方法主要是酶消化法、组织块贴壁法和组织块消化贴壁法。本文旨对先前的方法进行改良,建立一种简便易行、培养周期短、细胞活性及形态良好的原代奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养技术。采用健康未孕奶牛子宫为试验材料,取下子宫内膜组织,加入5 mL含2%双抗、40%胰酶的DMEM/F12培养基,4℃消化12 h,再将组织移至25 cm 2细胞培养瓶中贴壁培养。获得原代细胞后,应用角蛋白-18抗体对细胞进行免疫组化荧光鉴定,并对第3代细胞采用CCK-8法测定不同时间点的D 450 nm值,绘制细胞生长曲线。结果显示,培养至第8天,原代细胞基本铺满细胞培养瓶瓶底,有效地缩短了常规组织块贴壁法的周期。通过角蛋白-18免疫组化荧光鉴定,原代上皮细胞的阳性率可达98%以上,相比常规组织块贴壁法来说,纯度明显提高,省去了细胞纯化的操作步骤。细胞增殖状态,符合正常的分裂生长特性。试验结果表明将常规组织块贴壁法进行了优化改良,不仅缩短了培养周期,同时提高纯度,保持细胞活性,为原代奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养技术的改良提供一定的参考。 展开更多
关键词 奶牛子宫内膜上皮细胞 细胞培养 细胞鉴定
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鼠李糖乳杆菌GR-1介导MAPK信号通路抗大肠杆菌诱导奶牛子宫内膜上皮细胞炎性损伤 被引量：3
2
作者 刘佳玮 冯晓微 +5 位作者 焦玉兰 孙艳 靳天雄 冯鸣鹊 刘蓓 刘明超 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期99-106,共8页
为探讨鼠李糖乳杆菌GR-1(Lactobacillus rhamnosus GR-1)防治奶牛子宫内膜炎的具体通路机制。本研究利用L. rhamnosus GR-1和大肠杆菌(Escherichia coli)处理原代培养的奶牛子宫内膜上皮细胞(Bovine endometrial epithelial cells,BEEC... 为探讨鼠李糖乳杆菌GR-1(Lactobacillus rhamnosus GR-1)防治奶牛子宫内膜炎的具体通路机制。本研究利用L. rhamnosus GR-1和大肠杆菌(Escherichia coli)处理原代培养的奶牛子宫内膜上皮细胞(Bovine endometrial epithelial cells,BEECs),设对照组、E. coli攻毒组、L. rhamnosus GR-1单独处理组、L. rhamnosus GR-1预处理再加入E. coli组,然后利用细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡情况;采用Western blot技术检测p38、JNK、ERK蛋白磷酸化水平;利用MAPK特异性信号通路抑制剂抑制目的信号转导;通过Realtime qPCR技术检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)mRNA的表达水平。结果显示,与E. coli攻毒组相比,L. rhamnosus GR-1预处理组的奶牛子宫内膜上皮细胞的凋亡数量显著降低(P<0.05),且p-p38、p-JNK蛋白表达水平极显著降低(P<0.01),L.rhamnosusGR-1预处理组中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8mRNA的表达水平与E.coli攻毒组相比显著下降(P<0.05),MAPK特异性信号通路抑制剂可显著抑制E. coli诱导的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA的表达(P<0.05),产生和L. rhamnosus GR-1类似的抗炎作用。本研究结果表明L. rhamnosus GR-1可通过介导MAPK信号通路调节E. coli诱导的BEECs的炎性损伤,为奶牛子宫内膜炎的防控提供有益参考。 展开更多
关键词 奶牛子宫内膜上皮细胞 炎性反应 鼠李糖乳杆菌 大肠杆菌 丝裂原活化蛋白激酶
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阿魏酸抗LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞炎性作用 被引量：3
3
作者 张志聪 吕安 +6 位作者 宫平 张彤 刘艺林 李德琰 姜晓茜 刘蓓桦 刘凤华 《北京农学院学报》 2016年第4期56-60,共5页
【目的】为了探明阿魏酸的抗炎机制。【方法】采用组织块培养法获得奶牛子宫内膜上皮细胞。用噻唑蓝(MTT法)检测细胞活力。采用荧光定量PCR方法,分别对对照组、模型组、药物作用高、中、低剂量组在LPS作用3h、6h炎症基因IL-1β、IL-6、I... 【目的】为了探明阿魏酸的抗炎机制。【方法】采用组织块培养法获得奶牛子宫内膜上皮细胞。用噻唑蓝(MTT法)检测细胞活力。采用荧光定量PCR方法,分别对对照组、模型组、药物作用高、中、低剂量组在LPS作用3h、6h炎症基因IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA变化进行检测。【结果】阿魏酸在一定浓度范围内对细胞增殖无显著影响。药物预处理细胞能够显著降低LPS诱导的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达。【结论】阿魏酸能够显著降低LPS刺激细胞后炎症细胞因子的表达,说明阿魏酸是通过抑制炎症因子的表达发挥其抗炎作用。 展开更多
关键词 阿魏酸 奶牛子宫内膜上皮细胞 细胞因子 脂多糖 抗炎作用
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LPS诱导奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤模型的建立 被引量：3
4
作者 吕安 张志聪 +6 位作者 宫平 张彤 刘艺林 李德琰 姜晓茜 刘蓓桦 刘凤华 《北京农学院学报》 2016年第4期61-66,共6页
【目的】采用脂多糖(LPS)作为刺激源,建立奶牛子宫内膜上皮细胞(BEEC)氧化损伤模型。【方法】体外培养BEEC并进行细胞鉴定,用不同浓度的LPS刺激细胞,在不同时间点用CCK-8法测定细胞存活率,以确定BEEC氧化损伤模型条件。倒置显微镜下观... 【目的】采用脂多糖(LPS)作为刺激源,建立奶牛子宫内膜上皮细胞(BEEC)氧化损伤模型。【方法】体外培养BEEC并进行细胞鉴定,用不同浓度的LPS刺激细胞,在不同时间点用CCK-8法测定细胞存活率,以确定BEEC氧化损伤模型条件。倒置显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,DCFH-DA检测细胞内活性氧(ROS)含量,比色法检测细胞中的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)。【结果】与空白对照组相比,当LPS浓度为80μg/mL,作用时间为12h时,造成细胞损伤,其细胞凋亡率、ROS产生量和MDA含量明显高于对照组,SOD和CAT活性显著低于对照组。【结论】建立奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤模型的条件为LPS作用浓度80μg/mL,作用时间12h。 展开更多
关键词 奶牛子宫内膜上皮细胞 脂多糖 氧化损伤 细胞凋亡
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脂多糖对奶牛子宫内膜上皮细胞毒性作用研究 被引量：3
5
作者 张桂林 商好敏 +1 位作者 崔晓妮 曹荣峰 《中国奶牛》 2011年第6期1-3,共3页
本试验通过传代培养奶牛子宫内膜上皮细胞,以0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL 7个LPS浓度梯度刺激细胞,分别于刺激后12h、24h、36h 3个时间段做MTT细胞毒检测,同时进行细胞形态学观察,研究LP... 本试验通过传代培养奶牛子宫内膜上皮细胞,以0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL 7个LPS浓度梯度刺激细胞,分别于刺激后12h、24h、36h 3个时间段做MTT细胞毒检测,同时进行细胞形态学观察,研究LPS对子宫内膜上皮细胞的毒性作用。结果发现:0.1μg/mL、1μg/mLLPS组细胞形态学无明显改变;10μg/mL、50μg/mL、100g/mL LPS组细胞形态学与对照组相比有明显改变,500μg/mL、1000μg/mL LPS组细胞发生裂解、死亡。MTT试验结果表明LPS对细胞的抑制作用呈浓度与时间依赖关系,随着LPS浓度的增加和刺激时间的延长,细胞抑制率明显增加,细胞活力明显降低。 展开更多
关键词 子宫内膜上皮细胞 LPS 形态学 抑制率
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奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型的建立及奶牛脂肪间充质干细胞对其迁移的影响 被引量：2
6
作者 鲁文赓 司琳清 +5 位作者 田春雨 袁思琦 谢何昕 周继伟 金吉东 韩英浩 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第7期2506-2514,共9页
【目的】探讨奶牛脂肪间充质干细胞(bovine adipose-derived mesenchymal stem cells,bAD-MSCs)对氧化应激条件下奶牛子宫内膜上皮细胞迁移能力的影响。【方法】使用0、5、25、50、100、200μmol/L H_(2)O_(2)处理奶牛子宫内膜上皮细胞2... 【目的】探讨奶牛脂肪间充质干细胞(bovine adipose-derived mesenchymal stem cells,bAD-MSCs)对氧化应激条件下奶牛子宫内膜上皮细胞迁移能力的影响。【方法】使用0、5、25、50、100、200μmol/L H_(2)O_(2)处理奶牛子宫内膜上皮细胞2、4、6、8、12 h后,通过MTT试验检测细胞存活率、流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平来筛选H_(2)O_(2)诱导奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型的最佳条件。在细胞划痕试验中设立对照组、H_(2)O_(2)组、bAD-MSCs共培养组(1∶0.5)、bAD-MSCs共培养组(1∶1)、奶牛乳腺上皮细胞(MACT)共培养组(1∶0.5)和MACT共培养组(1∶1)共6组,分析奶牛子宫内膜上皮细胞迁移能力,并利用Western blotting检测细胞外蛋白调节激酶(Erk)和磷酸化细胞外蛋白调节激酶(pErk)蛋白的表达水平。【结果】MTT试验结果显示,4~12 h内50μmol/L H_(2)O_(2)组细胞存活率为50%~80%,适用于构建氧化应激模型。流式细胞术结果显示,用50μmol/L H_(2)O_(2)刺激奶牛子宫内膜上皮细胞2 h时,ROS水平显著高于对照组与4、6、8、12 h组(P<0.05)。划痕试验结果显示,与对照组相比,H_(2)O_(2)组奶牛子宫内膜上皮细胞的迁移能力显著降低(P<0.05);与H_(2)O_(2)组相比,bAD-MSCs共培养组奶牛子宫内膜上皮细胞的迁移能力均显著增加(P<0.05),MACT共培养组细胞迁移能力均显著降低(P<0.05)。Western blotting结果显示,与对照组相比,H_(2)O_(2)组奶牛子宫内膜上皮细胞中pErk蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与H_(2)O_(2)组相比,bAD-MSCs共培养组奶牛子宫内膜上皮细胞中pErk蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),MACT共培养组细胞中pErk蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。【结论】50μmol/L H_(2)O_(2)处理2 h可成功构建奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型,bAD-MSCs可促进氧化应激条件下奶牛子宫内膜上皮细胞的迁移并参与调控Erk蛋白的表达。 展开更多
关键词 牛脂肪间充质干细胞 氧化应激 奶牛子宫内膜上皮细胞 细胞迁移
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Microcystin-LR对体外牛子宫内膜上皮细胞增殖和凋亡的影响 被引量：2
7
作者 张贵学 李晓宇 +6 位作者 黄富硕 马铭钧 王子铭 冯瑞 李玉龙 许钟峯 郑鹏 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期29-37,共9页
使用Microcystin-LR体外处理牛子宫内膜上皮细胞,探究其对细胞活率影响及分子调控机制,以期为提高牛繁殖效率提供理论基础和实践依据。试验运用CCK-8检测MC-LR处理后细胞存活率;流式细胞术检测细胞周期变化和细胞凋亡率;Annexin V-FITC... 使用Microcystin-LR体外处理牛子宫内膜上皮细胞,探究其对细胞活率影响及分子调控机制,以期为提高牛繁殖效率提供理论基础和实践依据。试验运用CCK-8检测MC-LR处理后细胞存活率;流式细胞术检测细胞周期变化和细胞凋亡率;Annexin V-FITC试剂盒检测细胞凋亡;实时荧光定量检测Pi3k、Akt、mTOR、Cyt-c、Caspase-3、Caspase-9和p53基因mRNA表达量。Western blot检测Pi3k、Akt、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达量。结果表明,不同浓度和时间处理下细胞存活率出现升高和降低两种相反情况,根据CCK-8检测结果,选择12 h,100μg·L^(-1)和24 h,160μg·L^(-1)两种处理方案开展后续试验。在12 h,100μg·L^(-1)条件下,Pi3k、Akt、mTOR的mRNA表达量升高(P<0.01),Cyt-c、Caspase-3和Caspase-9基因mRNA表达量下降(P<0.05),Pi3k和Akt蛋白表达量升高(P<0.05),Caspase-3和Caspase-9蛋白表达量降低(P<0.05)。处于G0/G1期细胞数量减少(P<0.01),处于G2/M和S期细胞数量增加(P<0.01);p53基因mRNA表达量升高(P<0.05)。在24 h,160μg·L^(-1)处理条件下,Caspase-3、Caspase-9、Bax/Bcl2基因mRNA表达量升高(P<0.05),Caspase-3和Caspase-9蛋白表达量升高(P<0.05)。研究表明,100μg·L^(-1)MC-LR处理细胞12 h,细胞通过增强Pi3k-Akt-mTOR信号通路,抑制线粒体凋亡通路促进细胞增殖,同时导致处于G1期细胞数量减少、G2/M期和S期细胞数量增加。160μg·L^(-1)MC-LR处理细胞24 h,细胞通过活化线粒体凋亡通路发生凋亡。 展开更多
关键词 牛 牛子宫内膜上皮细胞 MC-LR PI3K-AKT 线粒体凋亡
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甲硫脑啡肽对脂多糖作用下奶牛子宫内膜上皮细胞增殖的影响 被引量：2
8
作者 柴立昂 孙法壮 +4 位作者 蔡和乐 李建基 王亨 李俊 崔璐莹 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期772-779,共8页
为探究甲硫脑啡肽(methionine enkephalin,MENK)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞(BEEC)增殖的影响,利用CCK-8检测细胞增殖活性变化,荧光定量PCR检测细胞增殖相关基因(EGFR、VEGF、TGF-β3、FGF-2)表达,蛋... 为探究甲硫脑啡肽(methionine enkephalin,MENK)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞(BEEC)增殖的影响,利用CCK-8检测细胞增殖活性变化,荧光定量PCR检测细胞增殖相关基因(EGFR、VEGF、TGF-β3、FGF-2)表达,蛋白免疫印迹法检测Wnt/β-catenin通路关键因子、c-Myc和Cyclin D1表达。结果显示,LPS单独作用时,细胞活性增强(P<0.05),细胞增殖相关基因表达升高(P<0.05),β-catenin、c-Myc、Cyclin D1表达升高(P<0.05)。MENK能显著抑制LPS诱导的细胞活性(P<0.05)、细胞增殖相关因子及Wnt/β-catenin通路关键蛋白的表达(P<0.05);非选择性阿片受体拮抗剂纳洛酮可阻断MENK对细胞活性、细胞增殖相关因子和通路的抑制效应。MENK可抑制LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞的增殖作用,该机制很可能由阿片受体介导。 展开更多
关键词 甲硫脑啡肽 奶牛子宫内膜上皮细胞 脂多糖 纳洛酮 细胞增殖
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精氨酸对干扰素-tau处理牛子宫内膜上皮细胞基因表达的影响
9
作者 余婕 胡修忠 +6 位作者 向敏 王定发 陶弼菲 夏瑜 陶虎 熊琪 程蕾 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第7期2495-2503,共9页
试验旨在研究精氨酸(Arg)对干扰素-tau(interferon-tau,IFNT)处理的牛子宫内膜上皮细胞的调控作用及其可能的机制。将牛子宫内膜上皮细胞接种至6孔细胞培养板中,当达到70%~80%融合度时,向细胞培养基中加入不同浓度的IFNT(0、100 ng/mL),... 试验旨在研究精氨酸(Arg)对干扰素-tau(interferon-tau,IFNT)处理的牛子宫内膜上皮细胞的调控作用及其可能的机制。将牛子宫内膜上皮细胞接种至6孔细胞培养板中,当达到70%~80%融合度时,向细胞培养基中加入不同浓度的IFNT(0、100 ng/mL),12 h后收集细胞检测未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)通路相关基因的表达情况;用不同浓度(0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mmol/L)Arg处理牛子宫内膜上皮细胞,24 h后用CCK8法检测其对增殖率的影响,筛选出Arg的最佳作用浓度;将子宫内膜上皮细胞随机分为Arg饥饿组、Arg饥饿+IFNT处理组、Arg添加+IFNT处理组,在Arg饥饿或添加处理6 h后加入100 ng/mL IFNT,IFNT处理12 h后检测UPR通路(BiP、PERK、CHOP、ATF6)、凋亡(BAX、Caspase9)和容受性(HOXA10)相关基因表达情况。结果显示,IFNT刺激可诱导牛子宫内膜上皮细胞UPR通路相关基因BiP、PERK、CHOP、ATF6的表达显著上调;0.5 mmol/L Arg可显著提高牛子宫内膜上皮细胞的增殖率(P<0.05);Arg缺失可显著上调IFNT诱导下牛子宫内膜上皮细胞中BiP、PERK、CHOP、ATF6和BAX基因mRNA的表达(P<0.05),并显著下调HOXA10基因mRNA的表达(P<0.05),但对Caspase9基因mRNA表达无显著影响(P>0.05)。结果表明,Arg缺失可导致牛子宫内膜上皮细胞发生内质网应激,并影响子宫内膜宫受性的建立,可为进一步揭示Arg对牛子宫内膜的调控机制及制定减少妊娠早期胚胎丢失的营养调控策略提供参考。 展开更多
关键词 精氨酸(Arg) 干扰素-tau 牛子宫内膜上皮细胞 未折叠蛋白反应
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