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甘蔗条纹花叶病毒HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg基因酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测 被引量:7
1
作者 翟玉山 彭磊 +4 位作者 杨永庆 邓宇晴 程光远 郑艳茹 徐景升 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2016年第1期83-89,共7页
为探索甘蔗条纹花叶病毒与甘蔗的互作机制,利用酵母双杂交技术筛选与SCSMV互作的甘蔗因子基因,利用PCR技术克隆了SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg的编码区,构建到酵母双杂交诱饵载体p GBKT7上,获得了p GBKT7-HC-Pro、p GBKT7-P3N-PIPO... 为探索甘蔗条纹花叶病毒与甘蔗的互作机制,利用酵母双杂交技术筛选与SCSMV互作的甘蔗因子基因,利用PCR技术克隆了SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg的编码区,构建到酵母双杂交诱饵载体p GBKT7上,获得了p GBKT7-HC-Pro、p GBKT7-P3N-PIPO、p GBKT7-CP和p GBKT7-VPg 4个诱饵载体。结果显示,将重组质粒转化酵母Y2HGold酵母菌株后,酵母菌株在SD/-Trp平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性;在SD/-Trp/X-α-gal平板上长出白色菌落未变蓝,在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/X-α-gal/Ab A平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对MEL1、ADE2、HIS3和AUR1-C报告基因无自激活作用。构建的诱饵表达载体可以作为诱饵用于文库筛选,为探索SCSMV侵染机制和发病机理奠定了基础。 展开更多
关键词 甘蔗条纹花叶病毒 HC-PRO P3N-PIPO CP VPG 诱饵载体 酵母双杂交
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草鱼呼肠孤病毒vp5基因诱饵重组载体的构建、转化与自激活作用检测 被引量:7
2
作者 谢吉国 闫秀英 +1 位作者 简纪常 吴灶和 《广东海洋大学学报》 CAS 2012年第3期42-48,共7页
根据草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)的vp5基因设计特异性引物,并扩增其开放阅读框序列(open reading frame,ORF),然后连接至pGBKT7载体上构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-vp5,转化至酵母菌Y2HGold,并进行PCR鉴定以及自激活性... 根据草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)的vp5基因设计特异性引物,并扩增其开放阅读框序列(open reading frame,ORF),然后连接至pGBKT7载体上构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-vp5,转化至酵母菌Y2HGold,并进行PCR鉴定以及自激活性和毒性检测。PCR、酶切以及测序表明,pGBKT7-vp5重组诱饵载体构建成功。自激活性和毒性检测显示,阳性重组菌株pGBKT7-vp5/Y2HGold和阴性对照菌株pGBKT7/Y2HGold在SD/-Trp平板上出现大小相一致的乳白色菌落,且在SD/-Trp/X-α-Gel、SD/-Trp/AbA+/X-α-Gel平板上生长出蓝色菌落,而在SD/-Trp/-Ade/-His无菌落出现。表明重组菌株pGBKT7-vp5/Y2HGold表达的融合蛋白激活了报告基因AUR1-C和MEL1,没有激活报告基因ADE2和HIS3并且对宿主菌无毒性。该重组诱饵载体可用于酵母双杂交系统进一步筛选cDNA文库中与其相互作用的蛋白。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 酵母双杂交系统 诱饵载体 自激活性
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陆地棉酵母双杂交cDNA文库及VdSCP7诱饵载体的构建 被引量:6
3
作者 韦春艳 秦腾飞 +5 位作者 董娜 李玉青 董涛 郭婷 孙家良 王清连 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期549-555,共7页
由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病是制约我国棉花生产的首要病害,严重影响棉花的产量与品质。为研究棉花与黄萎病菌互作的分子机制,本研究以国审棉百棉1号为材料,提取被大丽轮枝菌侵染的棉花根部总RNA,检测质量并用D... 由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病是制约我国棉花生产的首要病害,严重影响棉花的产量与品质。为研究棉花与黄萎病菌互作的分子机制,本研究以国审棉百棉1号为材料,提取被大丽轮枝菌侵染的棉花根部总RNA,检测质量并用DNaseⅠ处理后,用RNA 5′末端的模板转换方法,即SMART技术合成双链cDNA,再经酶切、过柱纯化去除短片段后,连接至pGADT7载体上构建棉花cDNA文库。VdSCP7是定位于寄主细胞核的大丽轮枝菌效应因子,能激发棉花的免疫反应,增强棉花抗病性。以大丽轮枝菌cDNA为模板扩增VdSCP7,产物纯化后重组到载体pGBKT7上构建诱饵载体pGBKT7-SCP7。诱饵载体经酶切及测序鉴定后,转化到酵母AH109中,鉴定诱饵蛋白毒性并检测诱饵载体是否存在自激活活性。结果表明,获得了库容量为2×10^(6) CFU的棉花cDNA文库,文库片段多样性良好,文库重组率约94%,质粒文库滴度约2.0×10^(9 )CFU·mL^(-1),满足酵母双杂交cDNA文库构建要求。酶切及测序结果表明,诱饵载体pGBKT7-SCP7构建成功且经过鉴定后无毒性、无自激活活性。本研究结果为棉花抗黄萎病基因的筛选及VdSCP7和棉花互作机制的解析奠定了基础。 展开更多
关键词 棉花 酵母双杂交文库 诱饵载体 VdSCP7 大丽轮枝菌
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剑麻AhMADS8937基因酵母双杂交诱饵载体的构建、毒性和自激活检测
4
作者 杨茜 徐蕾 +2 位作者 汪询 杨子平 周文钊 《分子植物育种》 CAS 北大核心 2024年第18期5994-5999,共6页
MADS-box是植物重要的转录调控因子,参与种子休眠和萌发、根系生长、花器官发育、果实成熟等营养生长和生殖生长过程。前期研究结果表明AhMADS8937可能参与调控剑麻株芽的发育。鉴于MADS-box蛋白能以复合体的形式调控植物发育,因此为筛... MADS-box是植物重要的转录调控因子,参与种子休眠和萌发、根系生长、花器官发育、果实成熟等营养生长和生殖生长过程。前期研究结果表明AhMADS8937可能参与调控剑麻株芽的发育。鉴于MADS-box蛋白能以复合体的形式调控植物发育,因此为筛选剑麻(Agave hybrid No.11648)中与AhMADS8937蛋白相互作用的蛋白,本研究构建了pGBKT7-AhMADS8937诱饵表达载体,酶切验证和测序结果表明载体构建成功。将重组载体转化Y2HGold酵母感受态,检测其对酵母菌株是否有毒性,以及是否存在自激活。结果表明pGBKT7-Ah MADS8937诱饵载体对Y2HGold酵母菌无毒性但存在自激活,5 mmol/L的3-氨基1,2,4-三唑(3-Amino-1,2,4-triazole,3-AT)可抑制其自激活。本研究成功构建AhMADS8937酵母双杂交诱饵载体,为筛选与AhMADS8937相互作用的蛋白,解析剑麻株芽发育的分子调控网络打下基础。 展开更多
关键词 剑麻 AhMADS8937 酵母双杂交 诱饵载体 毒性和自激活性
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酵母双杂交系统筛选新橡胶延长因子HbREF3互作蛋白 被引量:5
5
作者 孙丽娜 康桂娟 +1 位作者 黎瑜 曾日中 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期358-365,共8页
橡胶延长因子(rubber elongation factor,REF)等橡胶粒子蛋白可能通过相互作用形成蛋白复合体在橡胶生物合成发挥作用。为鉴定REF家族中一新成员Hb REF3的互作蛋白,以橡胶树Hb REF3基因的c DNA序列为基础,分别构建了筛选Hb REF3相互作... 橡胶延长因子(rubber elongation factor,REF)等橡胶粒子蛋白可能通过相互作用形成蛋白复合体在橡胶生物合成发挥作用。为鉴定REF家族中一新成员Hb REF3的互作蛋白,以橡胶树Hb REF3基因的c DNA序列为基础,分别构建了筛选Hb REF3相互作用蛋白的3种诱饵载体p GBKT7-Hb REF3-F(含全长ORF序列)及p GBKT7-Hb REF3-N(含N端序列)和p GBKT7-Hb REF3-C(含C端序列),并分别转化到Y2H Gold酵母菌株中,进行诱饵表达载体的自激活性与毒性检测。实验证明,3种诱饵载体转化的酵母菌能在SD/-Trp平板上正常生长,而在SD/-Trp/-His/-Ade平板上不能生长,因此,诱饵载体本身没有自激活性,它们的表达产物也没有毒性,不影响转化酵母菌Y2H的生长,满足作为诱饵质粒的条件,并用于橡胶树胶乳c DNA酵母表达文库的筛选。结果表明,用Hb REF3基因的全长ORF编码产物作诱饵,没有筛选到任何候选互作蛋白,而用Hb REF3的N端和C端区域分别作诱饵,均筛选到了可能与Hb REF3具有相互作用的候选蛋白,其中包括REF家族的其他成员和膜联蛋白D4等。 展开更多
关键词 橡胶树 橡胶延伸因子 酵母双杂交 诱饵载体 互作蛋白
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不同毒力传染性法氏囊病病毒衣壳蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定 被引量:5
6
作者 陈玉明 张礼洲 +7 位作者 任宪刚 高立 秦立廷 高玉龙 王永强 高宏雷 王笑梅 祁小乐 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第1期30-34,共5页
传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)毒株Gx(超强毒株)、F9(中等毒力毒株)、Gt(弱毒株)遗传背景高度相似,但生物学性状差异显著。为研究不同毒力毒株与宿主细胞相互作用的分子细节,本研究将IBDV Gx、F9、Gt毒株... 传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)毒株Gx(超强毒株)、F9(中等毒力毒株)、Gt(弱毒株)遗传背景高度相似,但生物学性状差异显著。为研究不同毒力毒株与宿主细胞相互作用的分子细节,本研究将IBDV Gx、F9、Gt毒株的衣壳蛋白VP2基因克隆入pGBKT7载体,分别构建了诱饵载体pGBGxVP2、pGBF9VP2和pGBGtVP2。经Matchmaker Gold Yeast Two-hybrid System验证,结果显示所构建的3个诱饵载体均无自激活作用,对酵母细胞无毒性作用。本研究为利用酵母双杂交系统深入研究IBDV与宿主相互作用奠定了基础。 展开更多
关键词 传染性法氏囊病病毒 衣壳蛋白 酵母双杂交 诱饵载体 自激活作用 毒性作用
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用于酵母双杂交的M-CSF诱饵载体的构建和鉴定 被引量:4
7
作者 李剑敏 雷小勇 +2 位作者 孙文清 张晓红 唐圣松 《南华大学学报(医学版)》 2005年第2期144-147,165,共5页
目的 构建用于酵母双杂交系统的结合域(bindingdomain ,BD)诱饵载体pGBKT7-M -CSF ,并检测其是否具有自身激活作用。方法 用PCR方法从M -CSFcDNA中扩增出M -CSF的胞外活性区,引入酶切位点SalⅠ、NcoⅠ,与pGBKT7载体连接起来,并检测pGB... 目的 构建用于酵母双杂交系统的结合域(bindingdomain ,BD)诱饵载体pGBKT7-M -CSF ,并检测其是否具有自身激活作用。方法 用PCR方法从M -CSFcDNA中扩增出M -CSF的胞外活性区,引入酶切位点SalⅠ、NcoⅠ,与pGBKT7载体连接起来,并检测pGBKT7-M -CSF在酵母双杂交系统3中的自激活作用。结果 成功构建了BD诱饵载体pGBKT7-M -CSF ,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活作用。结论 pGBKT7-M -CSF可以用于酵母双杂交系统中,找出与M -CSF相互作用的分子。 展开更多
关键词 M—CSF 酵母双杂交 诱饵载体 自激活作用
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BmNPV DNA解旋酶基因酵母双杂交诱饵载体的构建 被引量:3
8
作者 杨金宏 王代钢 +1 位作者 卢从德 孔卫青 《山东农业大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2010年第2期161-163,共3页
为了筛选家蚕对BmNPV DNA解旋酶的受体基因,根据GenBank公布的BmNPV(T3株)的序列,设计引物对其DNA解旋酶基因的核心结构域进行PCR扩增,成功克隆该基因并利用双酶切亚克隆至酵母双杂交诱饵载体PGBKT7。实验证明重组诱饵载体不能自激活,... 为了筛选家蚕对BmNPV DNA解旋酶的受体基因,根据GenBank公布的BmNPV(T3株)的序列,设计引物对其DNA解旋酶基因的核心结构域进行PCR扩增,成功克隆该基因并利用双酶切亚克隆至酵母双杂交诱饵载体PGBKT7。实验证明重组诱饵载体不能自激活,可以作为诱饵进行蛋白结合试验。 展开更多
关键词 家蚕核型多角体病毒 DNA解旋酶 诱饵载体 自激活
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剑麻AhKH1775基因克隆及其酵母双杂交诱饵载体构建
9
作者 汪询 杨倩 +3 位作者 柯智 周文钊 杨子平 吕玲玲 《分子植物育种》 CAS 北大核心 2023年第15期4935-4940,共6页
KH结构域蛋白参与调控植物开花时间、花器官形成、叶发育、miRNA产生和对生物非生物胁迫的响应。前期实验发现AhKH1775可能参与调控剑麻株芽的发育,但是其调控机制仍不清楚。KH结构域蛋白可以通过复合体的方式参与转录后基因表达调控。... KH结构域蛋白参与调控植物开花时间、花器官形成、叶发育、miRNA产生和对生物非生物胁迫的响应。前期实验发现AhKH1775可能参与调控剑麻株芽的发育,但是其调控机制仍不清楚。KH结构域蛋白可以通过复合体的方式参与转录后基因表达调控。为获得与AhKH1775相互作用的蛋白,本研究克隆了AhKH1775的完整编码框,构建了酵母双杂交诱饵载体,并检测了诱饵载体的毒性和自激活性。结果显示,克隆获得一个918 bp的编码框,成功构建了诱饵载体,诱饵载体无毒性,但存在自激活性,25 mmol/L的3-AT可以抑制诱饵载体的自激活性。本研究结果为进一步筛选与AhKH1775相互作用的蛋白和深入研究AhKH1775在剑麻中的功能提供依据。 展开更多
关键词 剑麻 KH结构域 基因克隆 酵母双杂交 诱饵载体
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IBDV强、弱毒VP2诱饵载体构建及在酵母双杂交系统中自激活作用的检测 被引量:3
10
作者 李铁强 高玉龙 +3 位作者 高宏雷 邓小芸 王笑梅 王立群 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期1-4,共4页
采用Gateway技术将鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)Gx株和Gt株vp2基因分别克隆到载体pDEST-32构建诱饵载体,通过酶切和PCR鉴定并测序正确后,用醋酸锂法转化酵母菌株MaV203,通过缺陷型平板筛选和X-gal颜色筛选检测诱饵载体有无自激活作用。... 采用Gateway技术将鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)Gx株和Gt株vp2基因分别克隆到载体pDEST-32构建诱饵载体,通过酶切和PCR鉴定并测序正确后,用醋酸锂法转化酵母菌株MaV203,通过缺陷型平板筛选和X-gal颜色筛选检测诱饵载体有无自激活作用。结果表明,成功构建了诱饵载体pDEST-32-Gxvp2和pDEST-32-Gtvp2,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活作用。为下一步利用酵母双杂交方法从鸡法氏囊B淋巴细胞和鸡胚成纤维细胞cDNA表达文库中筛选与强、弱毒VP2诱饵载体作用的分子奠定了基础。 展开更多
关键词 IBDV 酵母双杂交 诱饵载体 自激活
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The Self-activated Experimental of T_(1083) Substitution Mutation Vector pGBKT7-TS in Yeast 被引量:3
11
作者 袁亮 纪耀坤 张伟彬 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2010年第3期65-67,共3页
[Objective] The research aimed to study the self-activation test of inverting T1083 substitution mutation BD fusion vector pGBKT7-TS into yeast,and discuss whether its expression product can be used as bait for furthe... [Objective] The research aimed to study the self-activation test of inverting T1083 substitution mutation BD fusion vector pGBKT7-TS into yeast,and discuss whether its expression product can be used as bait for further two-hybrid screening.[Method] T1083 substitution mutation BD fusion vector pGBKT7-TS was inverted into yeast to make the self-activation and protein expression toxic detection test.[Result] This expression product of the fragment was inactive and had no toxic to yeast cell.It could be used as bait for further two-hybrid screening.[Conclusion] The research laid the experimental foundation for further study of the effect of T1083 substitution mutation on the interaction of NtKrp and its target partner. 展开更多
关键词 pGBKT7-TS vector Yeast two-hybrid bait vector SELF-ACTIVATION
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NDRG家族成员酵母双杂交诱饵载体的构建,表达及自激活检测 被引量:1
12
作者 张璟 张健 +4 位作者 刘娜 王立峰 李霞 刘新平 药立波 《第四军医大学学报》 北大核心 2005年第5期385-388,共4页
目的:构建NDRG家族4个成员的酵母双杂交诱饵 载体,验证其在酵母中的表达并检测其自激活作用,为用酵母 双杂交方法寻找与NDRG家族相互作用的分子奠定实验基 础.方法:用PCR方法获得NDRG家族4个成员cDNA全长,将4个片段按正确读框插入酵母... 目的:构建NDRG家族4个成员的酵母双杂交诱饵 载体,验证其在酵母中的表达并检测其自激活作用,为用酵母 双杂交方法寻找与NDRG家族相互作用的分子奠定实验基 础.方法:用PCR方法获得NDRG家族4个成员cDNA全长,将4个片段按正确读框插入酵母表达质粒PGBKT7中,经限 制性酶切鉴定正确后,PEG/LiAc法转化酵母菌株AH109, Western验证4个分子的正确表达,用表型筛选法及颜色筛选 法检测其自激活作用.结果:构建了NDRG家族4个成员的 酵母双杂交诱饵载体,并在酵母中正确表达,除NDRG4 B外 NDRG1,2,3均无自激活作用.结论:NDRG1,2,3可以用酵母 双杂交方法钓取与之相互作用的分子.NDRG4 B由于有自激 活作用不能用于酵母双杂交的筛选. 展开更多
关键词 NDRG 诱饵载体 酵母双杂交 自激活作用
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HCV截短型E2蛋白在酵母双杂交系统中的表达及自激活作用检测 被引量:3
13
作者 吕欣 尹文 +3 位作者 雷迎峰 杨敬 康健 姚敏 《生物技术》 CAS CSCD 2008年第5期9-11,共3页
目的:获得不包含C末端跨膜区的HCV包膜糖蛋白E2蛋白(E2 661)编码基因,构建酵母双杂交诱饵载体,并检测对报告基因的激活作用。方法:PCR扩增HCV E2661 cDNA片段,先克隆入pMD-18T载体中,经测序正确后,再亚克隆入诱饵载体 pGBKT7,将重组质粒... 目的:获得不包含C末端跨膜区的HCV包膜糖蛋白E2蛋白(E2 661)编码基因,构建酵母双杂交诱饵载体,并检测对报告基因的激活作用。方法:PCR扩增HCV E2661 cDNA片段,先克隆入pMD-18T载体中,经测序正确后,再亚克隆入诱饵载体 pGBKT7,将重组质粒pGBKT7-E2661用醋酸锂法转化入酵母菌AH109,检测目的蛋白在酵母细胞中的表达以及对报告基因有无激活作用。结果:成功构建含有HCVE2661基因片段的酵母双杂交诱饵载体,目的片段可在酵母细胞AH109中正确表达,对酵母菌无毒性且对报告基因无自主激活作用。结论:可利用所构建的pGBKT7-E2661作为酵母双杂交系统中的"诱饵",进行相互作用分子的筛选研究。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 包膜糖蛋白 酵母双杂交 诱饵载体
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拟南芥At4g05060基因的酵母双杂交诱饵表达载体的构建、表达及自激活检测 被引量:3
14
作者 萨娜瓦尔.艾比布拉 陈全家 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期138-142,共5页
为研究At4g05060基因功能,采用PCR扩增拟南芥VAMP(vesicle-associated membrane protein)家族基因At4g05060的ORF序列,定向克隆至酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7,经酶切鉴定并测序后将其转化至酵母Y187细胞;然后采用Western blotting技... 为研究At4g05060基因功能,采用PCR扩增拟南芥VAMP(vesicle-associated membrane protein)家族基因At4g05060的ORF序列,定向克隆至酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7,经酶切鉴定并测序后将其转化至酵母Y187细胞;然后采用Western blotting技术分析At4g05060基因在酵母中的表达水平,通过缺陷型培养基培养进行自激活检测。结果表明,成功构建酵母诱饵表达载体pGBKT7-At4g05060,并在酵母细胞正确表达,表达产物对报告基因无自激活作用。 展开更多
关键词 拟南芥 VAMP蛋白 At4g05060基因 酵母双杂交 诱饵载体
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玉米ZmMPK5酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用检测 被引量:3
15
作者 马芳芳 王瑞云 蒋明义 《山西农业大学学报(自然科学版)》 CAS 2016年第3期170-175,共6页
玉米中ZmMPK5参与了ABA诱导的抗氧化防护从而增强了植物对干旱、盐渍以及氧化胁迫的忍受能力,然而截至目前对其潜在的分子机制却知之甚少。为构建玉米ZmMPK5酵母双杂交诱饵表达载体,并检测其在宿主酵母菌MaV203中的自激活活性和毒性,利... 玉米中ZmMPK5参与了ABA诱导的抗氧化防护从而增强了植物对干旱、盐渍以及氧化胁迫的忍受能力,然而截至目前对其潜在的分子机制却知之甚少。为构建玉米ZmMPK5酵母双杂交诱饵表达载体,并检测其在宿主酵母菌MaV203中的自激活活性和毒性,利用gateway技术,以实验室保存的重组质粒pMD19T-ZmMPK5为模板,扩增得到带有attB位点的ZmMPK5基因的ORF片段,通过BP重组反应和LR重组反应,最终将该片段构建到诱饵表达空载体pDEST32上,PCR及测序鉴定结果表明,成功构建了阅读框方向和序列均正确的重组诱饵载体pDEST32-ZmMPK5。用PEG/LiAc法将重组诱饵质粒pDEST32-ZmMPK5转化酵母菌株MaV203感受态细胞,通过缺陷型平板表型分析以及X-gal分析实验检测诱饵载体表达的蛋白对宿主细胞是否具有毒性和自激活作用。最终结果表明构建的诱饵载体对宿主酵母菌MaV203既无毒性也无自激活活性,可用于后续研究,为进一步利用酵母双杂交方法从玉米cDNA文库中筛选与ZmMPK5相互作用蛋白奠定了基础。 展开更多
关键词 ZmMPK5 酵母双杂交 诱饵载体 MaV203 自激活
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牛源犬新孢子虫NcAMA1基因酵母双杂交诱饵载体构建及鉴定 被引量:2
16
作者 李积旭 张守发 +1 位作者 李男礼 贾立军 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期66-69,共4页
为筛选牛源犬新孢子虫AMA1与虫体互作的靶蛋白,构建NcAMA1基因酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-AMA1。本试验应用RT-PCR技术从虫体总RNA中扩增了去除跨膜螺旋的AMA1基因,定向克隆到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组诱饵载体转化酵母Y2H,并... 为筛选牛源犬新孢子虫AMA1与虫体互作的靶蛋白,构建NcAMA1基因酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-AMA1。本试验应用RT-PCR技术从虫体总RNA中扩增了去除跨膜螺旋的AMA1基因,定向克隆到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组诱饵载体转化酵母Y2H,并验证其在酵母细胞中毒性作用和有无自激活现象。结果显示:本试验成功构建了诱饵载体pGBKT7-AMA1,并证明其对酵母细胞无毒性,且对报告基因无自激活。结果表明:诱饵载体pGBKT7-AMA1可用于酵母双杂交系统筛选与虫体互作的宿主蛋白。 展开更多
关键词 犬新孢子虫 AMA1 酵母双杂交 诱饵载体
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香蕉束顶病毒cp和mp酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活验证 被引量:2
17
作者 王祥 张秀春 +3 位作者 余乃通 周朋 梁洁 刘志昕 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期1351-1355,共5页
分别用两对引物PCR扩增BBTV cp、BBTV mp片段,混合各自PCR产物进行熔化退火可得到1/4两端含有Eco R玉和Bam H玉的PCR产物,分别克隆到酵母双杂交系统的p GBKT7诱饵载体中,并成功获得p GBKT7-cp和p GBKT7-mp。将重组质粒导入酵母Y2H菌株,... 分别用两对引物PCR扩增BBTV cp、BBTV mp片段,混合各自PCR产物进行熔化退火可得到1/4两端含有Eco R玉和Bam H玉的PCR产物,分别克隆到酵母双杂交系统的p GBKT7诱饵载体中,并成功获得p GBKT7-cp和p GBKT7-mp。将重组质粒导入酵母Y2H菌株,转化成功后进行诱饵载体的自激活验证及毒性验证。结果表明,获得了正确的BBTV-cp和BBTV-mp基因片段,并成功克隆到p GBKT7诱饵载体中,同时在SD/-Trp营养缺陷平板上转化有诱饵载体的Y2H生长良好,说明诱饵载体的表达产物对酵母细胞无毒性,对报告基因也无自激活作用,最后自激活验证确定了p GBKT7-cp和p GBKT7-mp可用于该系统的互作蛋白筛选,为下一步利用酵母双杂交系统检测与CP、MP蛋白相互作用的寄主蛋白奠定基础。 展开更多
关键词 香蕉束顶病毒 酵母双杂交 诱饵载体 构建 自激活
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绵羊FHL2基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定 被引量:2
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作者 张丽萌 聂晓宁 +7 位作者 李闰婷 陈龙欣 王林青 邢真真 宋月 刘爱菊 田树军 马润林 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第21期25-29,175-176,共7页
为了利用绵羊卵巢酵母双杂交cDNA文库筛选与FHL2蛋白相互作用的宿主蛋白,构建重组诱饵载体pGBKT7-FHL2,试验从绵羊卵巢组织中提取总RNA并反转录为cDNA,依据FHL2基因核苷酸序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增FHL2目的片段,连接到经限制... 为了利用绵羊卵巢酵母双杂交cDNA文库筛选与FHL2蛋白相互作用的宿主蛋白,构建重组诱饵载体pGBKT7-FHL2,试验从绵羊卵巢组织中提取总RNA并反转录为cDNA,依据FHL2基因核苷酸序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增FHL2目的片段,连接到经限制性内切酶EocRⅠ和BamHⅠ酶切后的酵母空载体pGBKT7上,并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,进行PCR鉴定及测序比对分析,将构建好的重组诱饵载体pGBKT7-FHL2转化到酵母Y2HGlod感受态细胞中,利用酵母双杂交系统检测其表达情况、自激活活性及细胞毒性。结果表明:PCR扩增出大小约为876 bp的目的条带;成功构建出重组诱饵载体pGBKT7-FHL2,测序结果与NCBI中预测的FHL2碱基序列同源性为100%;重组诱饵载体pGBKT7-FHL2可在酵母Y2HGold感受态细胞中表达FHL2蛋白,对酵母Y2HGold感受态细胞无自激活活性和毒性作用。说明试验成功构建出重组诱饵载体pGBKT7-FHL2,通过检测证明该重组诱饵载体能够用于酵母双杂交系统筛选互作蛋白。 展开更多
关键词 FHL2 诱饵载体 酵母双杂交 自激活活性 毒性检测
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小鼠巨细胞病毒即刻早期基因M122酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用的检测 被引量:2
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作者 王慧 田佳 +4 位作者 罗丹 刘兴楼 舒赛男 张慧娟 方峰 《实用儿科临床杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期289-292,共4页
目的构建小鼠巨细胞病毒(MCMV)即刻早期基因M122的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-M122,并检测其自激活作用及对酵母AH109菌株有无毒性作用,用于筛选小鼠胚胎脑cDNA文库。方法采用反转录(RT)-PCR的方法扩增MCMV的M122基因片段,并将其插入到pM... 目的构建小鼠巨细胞病毒(MCMV)即刻早期基因M122的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-M122,并检测其自激活作用及对酵母AH109菌株有无毒性作用,用于筛选小鼠胚胎脑cDNA文库。方法采用反转录(RT)-PCR的方法扩增MCMV的M122基因片段,并将其插入到pMD18-Tsimple vector,构建重组质粒pMD18-T-M122。用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ将重组质粒酶切鉴定,并测序。测序正确的pMD18-T-M122重组质粒和载体pGBKT7-BD分别用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切,凝胶回收M122基因片段及pGBKT7-BD载体片段。将回收的M122基因片段和pGBKT7-BD载体片段,用T4 DNA连接酶16℃连接过夜,构建诱饵质粒pGBKT7-M122。对pGBKTT-M122进行酶切鉴定,测序。将测序正确的pGBKT7-M122转化AH109酵母感受态细胞,转化菌液涂布于营养缺陷培养基SD/-Trp平板和SD/-Trp/X-α-Gal平板。空载体质粒pGBKT7-BD和阳性质粒pCL作为对照亦被转入AH109酵母感受态细胞,转化菌液分别涂布于SD/-Trp平板和SD/-Leu/X-α-Gal平板。观察平板上菌落的颜色、数量及大小。结果1.成功构建了用于酵母双杂交筛选的诱饵载体pGBKT7-M122,其在SD/-Trp/X-α-Gal平板上的菌落为白色。2.转化有重组质粒pGBKT7-M122和空载体质粒pGBKT7的酵母菌株AH109,在2个SD/-Trp平板上长出的菌落大小一致数量相当。结论构建的诱饵质粒pG-BKT7-M122无自激活作用,对酵母菌株AH109亦无毒性。能够用于酵母双杂交系统以筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白分子。 展开更多
关键词 M122基因 诱饵载体 酵母双杂交系统 自激活作用 小鼠巨细胞病毒
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杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测 被引量:2
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作者 柴丹丹 李庆华 +4 位作者 阎赟梦 毛丽红 李靓 朱立强 薛乐勋 《郑州大学学报(医学版)》 CAS 北大核心 2012年第1期16-20,共5页
目的:构建杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-SAHH,并检测其对酵母细胞的毒性和自激活作用。方法:应用RT-PCR扩增杜氏盐藻的SAHHcDNA,测序分析后与酵母双杂交诱饵载体pGBKT7连接,构建诱饵载体pGBKT7-SAHH... 目的:构建杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-SAHH,并检测其对酵母细胞的毒性和自激活作用。方法:应用RT-PCR扩增杜氏盐藻的SAHHcDNA,测序分析后与酵母双杂交诱饵载体pGBKT7连接,构建诱饵载体pGBKT7-SAHH。用PEG/LiAc法将诱饵载体转入AH109和Y187酵母中,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母有无毒性和自激活作用。结果:成功构建了诱饵载体pGBKT7-SAHH并成功转化到酵母细胞AH109和Y187中,表达的融合蛋白对宿主酵母细胞无毒性。在AH109和Y187酵母细胞中诱饵载体均未激活报告基因HIS3和ADE2,但是激活了报告基因MEL1。结论:诱饵载体pGBKT7-SAHH可用酵母双杂交方法筛选与SAHH相互作用的蛋白。 展开更多
关键词 S腺苷高半胱氨酸水解酶 酵母双杂交 诱饵载体 自激活 杜氏盐藻
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