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重组GST-Crosstide蛋白的表达纯化及其在AGC型蛋白激酶活性检测中的应用
1
作者 吕逢春 杨一 +1 位作者 杜林方 刘科 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期223-226,共4页
AGC型蛋白激酶在信号通路中占据着极为重要的地位,通过对各种信号通路的调控来影响细胞的生长、增殖和凋亡进程.为方便检测AGC型蛋白激酶的活性,设计并构建了新型AGC型蛋白激酶特异底物GST-Crosstide.通过同位素标记体外磷酸化的方法研... AGC型蛋白激酶在信号通路中占据着极为重要的地位,通过对各种信号通路的调控来影响细胞的生长、增殖和凋亡进程.为方便检测AGC型蛋白激酶的活性,设计并构建了新型AGC型蛋白激酶特异底物GST-Crosstide.通过同位素标记体外磷酸化的方法研究了酵母表达的Pkh1、Ypk1和大肠杆菌表达的Akt1三种AGC型蛋白激酶磷酸化GSTCrosstide的能力.结果显示,酵母表达的有活性的Pkh1和Ypk1均可有效磷酸化GST-Crosstide,并且由于Pkh1对Ypk1的进一步激活,二者共同作用可显著增加GST-Crosstide磷酸化.而仅采用大肠杆菌表达的没有被活化的Akt1则无法磷酸化GST-Crosstide,但Akt1可以被Pkh1或Ypk1激活,从而获得磷酸化GST-Crosstide的能力.研究表明,GST-Crosstide可以作为AGC蛋白激酶活性检测的有效工具,并将有效促进真核生物蛋白激酶调控的细胞信号转导通路的研究. 展开更多
关键词 GST-Crosstide AGC型蛋白激酶 体外磷酸化 AKT1 ypk1 Pkh1
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过量表达的出芽酵母蛋白激酶Ypk1磷酸化调控
2
作者 黄鹏 郄蓓蓓 +3 位作者 闾磊 刘军 杜林方 刘科 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期241-248,共8页
出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的Ypk1与人体蛋白激酶SGK(Human serum-and glucocorticoid-induciblekinase)同源.Ypk1的504位苏氨酸残基是其激活环内的磷酸化位点,也称之为PDK1位点,而662位苏氨酸残基是位于其疏水区的PDK2位点... 出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的Ypk1与人体蛋白激酶SGK(Human serum-and glucocorticoid-induciblekinase)同源.Ypk1的504位苏氨酸残基是其激活环内的磷酸化位点,也称之为PDK1位点,而662位苏氨酸残基是位于其疏水区的PDK2位点,这两个位点的磷酸化对其激酶活性非常重要.对Ypk1过量表达后其PDK1和PDK2位点的磷酸化调控研究结果显示,Ypk1过量表达后其PDK1和PDK2位点磷酸化水平在对数生长期呈现递增趋势,至平台期趋于稳定并在7 d的时序衰老过程中始终维持较高的磷酸化水平.在野生型细胞中分别过量表达Ypk1T504A和Ypk1T662A两个突变体会导致细胞对渗透压胁迫敏感性增加.而短暂渗透压胁迫处理会导致过量表达的Ypk1的PDK1和PDK2位点部分去磷酸化.研究结果表明过量表达的Ypk1的PDK1和PDK2位点磷酸化在出芽酵母时序衰老及胁迫应答过程中发挥着重要作用. 展开更多
关键词 出芽酵母 ypk1 PDK1位点 PDK2位点 磷酸化 胁迫应答 时序衰老
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过量表达蛋白激酶YPK1使酵母细胞对高盐胁迫的高度敏感依赖于雷帕霉素靶蛋白
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作者 曹红平 王一慧 +4 位作者 钟彦 刘昕 苗敏 Wei Duan 刘科 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期1069-1074,共6页
YPK1是酵母中和哺乳动物蛋白激酶SGK同源的一种丝氨酸3苏氨酸蛋白激酶,在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生理调节中有重要的作用,和酵母细胞壁的完整性、细胞骨架中肌动蛋白极性、细胞内吞作用、细胞在氮源缺乏和营养条件调节下细... YPK1是酵母中和哺乳动物蛋白激酶SGK同源的一种丝氨酸3苏氨酸蛋白激酶,在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生理调节中有重要的作用,和酵母细胞壁的完整性、细胞骨架中肌动蛋白极性、细胞内吞作用、细胞在氮源缺乏和营养条件调节下细胞内部的翻译情况密切相关。【目的】为了深入研究YPK1蛋白激酶的细胞功能以及在细胞信号传导中的作用,【方法】我们构建了过量表达YPK1的高拷贝质粒,研究了过量表达YPK1的酵母细胞在盐胁迫条件下的生长情况,【结果】发现过量表达YPK1会导致酵母细胞对盐胁迫高度敏感,并且这种敏感性依赖于TOR1的存在。【结论】我们的研究结果首次初步揭示YPK1与细胞盐胁迫应答的关系,并初步证明YPK1的功能充分发挥需要TOR1的参与。 展开更多
关键词 酵母 ypk1 雷帕霉素靶蛋白(target of RAPA mycin TOR1) 蛋白激酶 盐胁迫
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