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旋毛虫抗原基因Ts87在毕赤酵母系统中优化表达的研究
1
作者 魏骏飞 顾园 +3 位作者 王少华 杨静 黄松 诸欣平 《首都医科大学学报》 CAS 2006年第2期158-161,共4页
目的优化旋毛虫抗原基因Ts87在毕赤酵母系统中的表达,提高其表达量。方法选择去除自身信号肽序列的Ts87基因构建天然N末端的重组质粒,电击转化经锂盐处理过的酵母细胞X-33,摸索诱导起始细胞浓度、甲醇诱导浓度及其添加的时间间隔、pH值... 目的优化旋毛虫抗原基因Ts87在毕赤酵母系统中的表达,提高其表达量。方法选择去除自身信号肽序列的Ts87基因构建天然N末端的重组质粒,电击转化经锂盐处理过的酵母细胞X-33,摸索诱导起始细胞浓度、甲醇诱导浓度及其添加的时间间隔、pH值及诱导时间等条件对重组菌株表达的影响,并对表达产物进行Western blotting鉴定。结果采用锂盐处理毕赤酵母细胞的感受态制备方法可以极大的提高电击转化效率,并确定pPICZαA-Ts87nature/X-33株最佳表达条件为:OD600 nm=1.0,1.0%/24 h体积比添加甲醇,pH值7.0或8.0,诱导表达72 h。将此条件下的培养物上清液30μL直接上样,表达产物可被感染旋毛虫的兔血清所识别。结论本研究优化了Ts87在毕赤酵母系统中的表达条件,为后续研究工作打下基础。 展开更多
关键词 旋毛虫 毕赤酵母 ts87 表达
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抗旋毛虫病Ts87DNA疫苗滴鼻初免-蛋白疫苗加强免疫策略增强免疫保护应答
2
作者 顾园 黄京京 +1 位作者 杨静 诸欣平 《寄生虫与医学昆虫学报》 CAS 北大核心 2016年第2期78-85,共8页
为优化抗旋毛虫病核酸疫苗免疫策略，本文探讨了Ts87DNA疫苗滴鼻初免与蛋白疫苗皮下注射加强免疫诱导产生的保护效果及免疫应答特征。分别在第0d以旋毛虫Ts87DNA疫苗sL7207／pVAx1-Ts87滴鼻初免，第14／28d以蛋白疫苗rTs87皮下注射加强... 为优化抗旋毛虫病核酸疫苗免疫策略，本文探讨了Ts87DNA疫苗滴鼻初免与蛋白疫苗皮下注射加强免疫诱导产生的保护效果及免疫应答特征。分别在第0d以旋毛虫Ts87DNA疫苗sL7207／pVAx1-Ts87滴鼻初免，第14／28d以蛋白疫苗rTs87皮下注射加强免疫小鼠，在第35d攻击感染旋毛虫肌幼虫，第84d剖杀小鼠，计算减虫率观察免疫保护效果；进行小鼠血清中特异性IgG抗体效价、抗体亚型分析及肠道盥洗液sIgA水平分析，检测脾淋巴细胞增殖反应、脾及颈部淋巴结细胞分泌细胞因子水平。结果显示，DNA疫苗滴鼻初免一重组蛋白加强的联合免疫组的保护作用优于单独DNA疫苗滴鼻及单独重组蛋白免疫组，显著提高了减虫率（46．1％）；DNA疫苗滴鼻初免和蛋白疫苗加强免疫方式不仅诱导小鼠产生了粘膜免疫应答，同时也诱导了有效的细胞和体液免疫应答，其免疫应答类型是以Th2型为主的混合型Th1／Th2免疫反应。该研究为新型抗旋毛虫病疫苗接种策略的优化提供了实验依据。 展开更多
关键词 旋毛虫 疫苗 初免-加强策略 ts87
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旋毛虫Ts87抗原的免疫学特性及保护性的初步研究 被引量：6
3
作者 杨静 诸欣平 +1 位作者 杨雅平 雷丽萍 《动物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期52-55,共4页
应用Westernblot和ELISA方法对纯化的重组蛋白PET 2 8a( + ) Ts87进行免疫学特性鉴定及保护性研究。Westernblot和ELISA结果显示 ,Ts87抗原可被人工感染旋毛虫的兔血清、病猪血清、病人血清及抗Ts87的兔血清所识别。Ts87抗原免疫BABL ... 应用Westernblot和ELISA方法对纯化的重组蛋白PET 2 8a( + ) Ts87进行免疫学特性鉴定及保护性研究。Westernblot和ELISA结果显示 ,Ts87抗原可被人工感染旋毛虫的兔血清、病猪血清、病人血清及抗Ts87的兔血清所识别。Ts87抗原免疫BABL c小鼠 ,较对照组减虫率为 2 9% ,说明Ts87抗原可作为旋毛虫免疫诊断和疫苗的候选抗原。 展开更多
关键词 旋毛形线虫 ts87抗原 诊断 保护性免疫 ELISA
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旋毛虫Ts87抗原基因克隆体外表达条件的研究 被引量：6
4
作者 杨静 诸欣平 杨雅平 《首都医科大学学报》 CAS 2002年第4期307-309,共3页
为提高融合蛋白PET 2 8a(+) /Ts87/BL2 1的表达水平 ,对诱导时间、诱导物浓度、诱导时细菌生长状态等条件与表达量的关系进行了研究。结果表明 ,在细菌生长的适宜状态 (OD6 0 0nm=0 .6)和诱导条件 (3 7℃ 4h)下 ,此融合蛋白的表达量最... 为提高融合蛋白PET 2 8a(+) /Ts87/BL2 1的表达水平 ,对诱导时间、诱导物浓度、诱导时细菌生长状态等条件与表达量的关系进行了研究。结果表明 ,在细菌生长的适宜状态 (OD6 0 0nm=0 .6)和诱导条件 (3 7℃ 4h)下 ,此融合蛋白的表达量最高 ,约占菌体总蛋白的 3 0 展开更多
关键词 旋毛虫 ts87抗原 基因克隆 体外表达条件 融合蛋白
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应用RNA干扰技术对旋毛虫Ts87基因功能的初步研究 被引量：5
5
作者 郝冉 杨雅平 +2 位作者 杨静 王少华 诸欣平 《寄生虫与医学昆虫学报》 CAS 2008年第1期26-33,共8页
为研究旋毛虫Ts87基因的功能,通过RNA干扰途径抑制目的基因的表达。针对Ts87基因序列设计并合成特异性dsRNA、siRNA,通过浸泡方式分别将dsRNA、siRNA导入肌幼虫体内,利用实时荧光定量PCR分析Ts87基因及旋毛虫管家基因GAPDH的表达。此外... 为研究旋毛虫Ts87基因的功能,通过RNA干扰途径抑制目的基因的表达。针对Ts87基因序列设计并合成特异性dsRNA、siRNA,通过浸泡方式分别将dsRNA、siRNA导入肌幼虫体内,利用实时荧光定量PCR分析Ts87基因及旋毛虫管家基因GAPDH的表达。此外,测定RNA干扰作用下的肌幼虫体外存活率的变化。根据实时荧光定量PCR结果,dsRNA及siRNA均能有效抑制Ts87基因mRNA的表达。此外,两种RNA能够在一定程度上降低肌幼虫体外存活率。实验表明,RNA干扰技术能够有效抑制旋毛虫功能基因Ts87表达,从而为研究旋毛虫基因的功能提供一种新的有效途径。 展开更多
关键词 RNA干扰 小干扰RNA DSRNA 旋毛虫 ts87基因
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旋毛虫Ts87基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化 被引量：5
6
作者 杨静 诸欣平 +3 位作者 杨雅平 詹斌 冯建军 Hotez Peter 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2003年第3期25-27,40,共4页
目的　为进一步研究和应用旋毛虫Ts87基因 ,本文原核表达了PET - 2 8a(+) /Ts87重组质粒 ,并纯化鉴定了该蛋白。方法　将Ts87基因片段克隆入原核表达载体PET - 2 8a(+) ,形成重组质粒PET - 2 8a(+) /Ts87,转化后经IPTG诱导得到表达蛋白 ... 目的　为进一步研究和应用旋毛虫Ts87基因 ,本文原核表达了PET - 2 8a(+) /Ts87重组质粒 ,并纯化鉴定了该蛋白。方法　将Ts87基因片段克隆入原核表达载体PET - 2 8a(+) ,形成重组质粒PET - 2 8a(+) /Ts87,转化后经IPTG诱导得到表达蛋白 (约 4 0kDa) ,利用固定化金属离子 (Ni2 + )配体亲和层析纯化目的蛋白 ,进行复性 ,并用兔人工感染旋毛虫血清鉴定表达产物。结果与结论　成功构建了PET - 2 8a(+) /Ts87,SDS -PAGE显示融合蛋白主要以包涵体形式存在 ,经过亲和层析得到纯化的目的蛋白 。 展开更多
关键词 旋毛虫 ts87基因 大肠杆菌 表达 表达产物 纯化
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旋毛虫Ts87抗原的免疫组化定位研究 被引量：3
7
作者 杨雅平 诸欣平 +2 位作者 杨静 雷丽萍 景鹏 《首都医科大学学报》 CAS 2003年第2期108-110,共3页
为了确定旋毛虫Ts87抗原在虫体上的分布及其是否属于旋毛虫排泄分泌(ES)抗原,借助激光扫描共聚焦显微镜,采用免疫组化和Western Bloting等方法进行研究。结果表明:旋毛虫幼虫皮质层富含Ts87蛋白,而且Ts87抗原是旋毛虫排泄分泌抗原中的... 为了确定旋毛虫Ts87抗原在虫体上的分布及其是否属于旋毛虫排泄分泌(ES)抗原,借助激光扫描共聚焦显微镜,采用免疫组化和Western Bloting等方法进行研究。结果表明:旋毛虫幼虫皮质层富含Ts87蛋白,而且Ts87抗原是旋毛虫排泄分泌抗原中的组分。 展开更多
关键词 旋毛虫 ts87抗原 免疫组化定位 研究 激光扫描共聚焦显微镜
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不同佐剂对旋毛虫Ts87重组蛋白免疫小鼠保护性的影响 被引量：4
8
作者 李强 杨静 +4 位作者 杨雅平 顾园 刘智英 黄松 诸欣平 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期101-105,共5页
目的比较福氏完全佐剂(CFA)等6种佐剂对于旋毛虫Ts87重组蛋白(rTs87)免疫保护性的影响。方法经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析鉴定的rTs87分别与上述各种佐剂免疫ICR小鼠,每间隔2周免... 目的比较福氏完全佐剂(CFA)等6种佐剂对于旋毛虫Ts87重组蛋白(rTs87)免疫保护性的影响。方法经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析鉴定的rTs87分别与上述各种佐剂免疫ICR小鼠,每间隔2周免疫1次,共免疫3次。ELISA检测免疫小鼠血中抗原特异性IgG抗体水平。攻击感染45 d后剖杀小鼠取肌幼虫(ML)并计数,计算肌幼虫减虫率。结果rTs87相对分子质量(Mr)约为40 000,可被旋毛虫感染鼠血清和rTs87免疫鼠血清识别,分别与佐剂CFA(或IFA)、IMS 1312、ISA720、Quil-A及氢氧化铝免疫后均引起较强的IgG抗体反应,各佐剂免疫组减虫率分别为49.4％、49．2％、63．5％、65．1％和70．8％,与空白对照组比较有统计学意义;单纯抗原rTs87免疫组获得了23．7％的减虫率,与对照组及各佐剂免疫组差异均有统计学意义(P<0．05)。结论佐剂CFA(或IFA)、IMS1312、ISA720、Quil-A及氢氧化铝均能不同程度增强rTs87对小鼠的保护性免疫力,其中佐剂ISA720、Quil-A和氢氧化铝的保护效果更好。 展开更多
关键词 旋毛虫 旋毛虫ts87重组蛋白(rts87) 佐剂 保护性
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旋毛虫pcDNA3.1/Ts87重组质粒的构建和表达 被引量：2
9
作者 杨雅平 诸欣平 +4 位作者 杨静 张路平 徐旭娜 黄松 Pascal Boireau 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期93-95,共3页
目的 构建和表达旋毛虫重组质粒。方法 PCR法在旋毛虫抗原基因Ts87两端加上合适的酶切位点和KOZAK序列,与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3.1/Ts87重组质粒。采用Lipofectamine介导的细胞外源DNA转染法,把重组质粒导入COS7细胞... 目的 构建和表达旋毛虫重组质粒。方法 PCR法在旋毛虫抗原基因Ts87两端加上合适的酶切位点和KOZAK序列,与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3.1/Ts87重组质粒。采用Lipofectamine介导的细胞外源DNA转染法,把重组质粒导入COS7细胞。分别用肌肉注射和基因枪免疫小鼠。结果和结论 成功构建pcD-NA3.1/Ts87重组质粒,并在COS7细胞和BALB/c小鼠体内表达。 展开更多
关键词 旋毛虫病 疫苗 pcDNA3.1/ts87重组质粒 细胞外源DNA转染法 基因枪 COS7细胞
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