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棉花不同GbU6启动子截短克隆及功能鉴定 被引量：12
1
作者 雷建峰 李月 +4 位作者 徐新霞 阿尔祖古丽.塔什 蒲艳 张巨松 刘晓东 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期675-683,共9页
U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件,而使用较短序列的启动子也是构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的基本要求之一。将已经克隆的海岛棉GbU6-5P启动子(长度为1166 bp),采用Transfer PCR方法成功地截出6个... U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件,而使用较短序列的启动子也是构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的基本要求之一。将已经克隆的海岛棉GbU6-5P启动子(长度为1166 bp),采用Transfer PCR方法成功地截出6个长度不同的U6启动子,其长度分别为672、468、358、280、202和105 bp,并分别构建了6个启动子驱动的GUS融合植物表达载体。将构建好的6个GbU6-5Ps::GUS-pCAMBIA1300与初始克隆的GbU6-5P::GUS-pCAMBIA1300植物表达载体一起利用农杆菌真空渗透转化法分别转染棉花花粉。GUS组织化学染色显示,克隆到的7个不同截短大小的GbU6-5P启动子均能驱动GUS基因在棉花花粉中转录,棉花花粉被染成蓝色但颜色深浅存在显著差异。结果显示启动子长度越短,其转录活性越高。而且另外两种棉花U6启动子GbU6-1P和GbU6-7P也表现出类似的结果。本研究克隆了3个短小的、在棉花花粉细胞中具有转录功能的GbU6启动子。结果显示更短的U6启动子具有更高的转录活性,而且这一特点在不同U6启动子上具有共性。这预示着使用更短U6启动子不仅符合构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的要求,而且会提高sgRNA的转录水平,进而可能提高基因组编辑效率。 展开更多
关键词 棉花 GbU6启动子 截短克隆 真空渗透 棉花花粉
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不同截短U3启动子在棉花中的功能分析 被引量：3
2
作者 雷建峰 徐新霞 +3 位作者 代培红 李继洋 张巨松 刘晓东 《棉花学报》 CSCD 北大核心 2016年第3期307-314,共8页
从海岛棉中克隆了2种GbU3-2P、GbU3-3P启动子,对它们进行2种长度截短,长度分别为436、245 bp和384、233 bp,同时构建了4个相应启动子驱动GUS的融合植物表达载体。利用农杆菌真空渗透转化法将4个GbU3Ps∷GUS-sg RNA-P1300植物表达载体分... 从海岛棉中克隆了2种GbU3-2P、GbU3-3P启动子,对它们进行2种长度截短,长度分别为436、245 bp和384、233 bp,同时构建了4个相应启动子驱动GUS的融合植物表达载体。利用农杆菌真空渗透转化法将4个GbU3Ps∷GUS-sg RNA-P1300植物表达载体分别转染棉花胚性愈伤组织。经GUS组织化学染色显示:克隆得到的2种截短大小的GbU3-2P和GbU3-3P启动子均能驱动GUS基因在棉花愈伤组织中表达,棉花愈伤组织被染成蓝色,但颜色深浅没有显著差异。本研究表明,同一GbU3启动子截短后,较短的启动子和较长的启动子具有相同的转录活性。这为构建棉花CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统提供了更多理想的启动子。 展开更多
关键词 棉花 GbU3启动子 截短克隆 真空渗透 愈伤组织
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百日咳毒素S1亚单位截短片段的表达、纯化及初步应用 被引量：2
3
作者 杨瑜 朱为 +3 位作者 应通峰 黄帼英 徐帆洪 瞿爱东 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2008年第12期1058-1061,1069,共5页
目的表达并纯化百日咳毒素(PT)S1亚单位截短片段S146,以其制备抗体,初步建立检测PT的双抗体夹心ELISA法。方法PCR扩增S146基因,亚克隆至载体pUC18,鉴定正确后,插入表达载体pET16b,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-P... 目的表达并纯化百日咳毒素(PT)S1亚单位截短片段S146,以其制备抗体,初步建立检测PT的双抗体夹心ELISA法。方法PCR扩增S146基因,亚克隆至载体pUC18,鉴定正确后,插入表达载体pET16b,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用镍离子亲和层析柱纯化,复性后的蛋白免疫家兔,制备抗血清,纯化后作为包被抗体,建立检测PT的双抗体夹心ELISA法,并检测其特异性。结果表达的重组蛋白相对分子质量约为19000,主要存在于破菌沉淀中,表达量占菌体总蛋白的44%;纯化后蛋白纯度为94.5%;家兔抗血清可特异性识别天然PTSI;建立的双抗体夹心ELISA法特异性良好。结论已成功表达、纯化了PTS1亚单位截短片段S146,并以纯化的抗S146抗体作为包被抗体,初步建立了检测PT的双抗体夹心ELISA法,为研制特异性检测试剂和提供一种疫苗的质量控制方法奠定了基础。 展开更多
关键词 百日咳毒素 S1亚单位 截短片段 克隆 表达 纯化 ELISA
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猪圆环病毒Ⅱ型ORF2截短基因的克隆及原核表达 被引量：8
4
作者 林彦星 孙彦伟 +2 位作者 刘镇明 戚一达 耿忠海 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期464-468,共5页
参照GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型（Porcinecircovirus type 2，PCV2）的ORF2基因序列，设计合成1对引物，对PCV-2ZS株ORF2基因上含主要抗原位点的片段（ORF2-ME）进行PCR扩增，并克隆到pMD18-T Simple Vector中，进行序列测定。将重组质粒... 参照GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型（Porcinecircovirus type 2，PCV2）的ORF2基因序列，设计合成1对引物，对PCV-2ZS株ORF2基因上含主要抗原位点的片段（ORF2-ME）进行PCR扩增，并克隆到pMD18-T Simple Vector中，进行序列测定。将重组质粒pMD—ORF2-ME的EcoR Ⅴ和Xhol Ⅰ双酶切产物插入原核表达载体pET-32a（＋），构建原核表达载体pET—ORF—ME。测序分析表明，克隆的ORF2-ME与GenBank上公布的PCV2毒株核苷酸序列同源性为99％～100％，推导的氨基酸序列同源性介于91％～100％之间。原核表达载体导入BL21（DE3）后用IPTG进行诱导表达，收集菌液进行SDS—PAGE和Western Blotting分析，结果表明ORF2-ME在BL21（DE3）中成功表达，所表达融合蛋白的相对分子质量约为40000，并能被PCV2阳性血清所识别，这就为PCV2感染诊断和抗体检测提供了依据。 展开更多
关键词 PCV2 ORF2截短基因 克隆 表达
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田鼠巴贝西虫Babesiamicroti截短型分泌抗原的重组表达及其在诊断上的应用 被引量：4
5
作者 黄艳丽 曹杰 +4 位作者 蔺智兵 张厚双 周勇志 胡永浩 周金林 《寄生虫与医学昆虫学报》 CAS 2012年第4期213-219,共7页
田鼠巴贝西虫分泌抗原l（Babesiamicrotisecretedantigen1，BmSA1）是一个重要的诊断抗原候选分子，但全长蛋白的表达量少，也不宜纯化。本研究在此基础上，通过生物信息学分析，选取N-末端信号肽后，C-末端跨膜区前，包含CPSF73-100_C... 田鼠巴贝西虫分泌抗原l（Babesiamicrotisecretedantigen1，BmSA1）是一个重要的诊断抗原候选分子，但全长蛋白的表达量少，也不宜纯化。本研究在此基础上，通过生物信息学分析，选取N-末端信号肽后，C-末端跨膜区前，包含CPSF73-100_C功能区的228个氨基酸所编码基因片段，重组高效表达了一个可溶性截短型抗原，解决了完整蛋白重组表达纯化的困难。纯化的截短型抗原作为酶联免疫试验（ELISA）诊断抗原，可清晰地区分阴性及阳性鼠血清，并与其他病原感染无交叉反应，显示其诊断的特异性。鼠人工感染田鼠巴贝西虫系列血清检测表明，该抗原可检测早期感染（5天）和感染（55天）以后的样本，显示其对不同时期感染的宿主均具有诊断价值。结果表明，重组B．microti截短型抗原可作为一种诊断制剂检测田鼠巴贝西虫抗体。 展开更多
关键词 田鼠巴贝西虫 截短型抗原BmSAl 克隆 表达 诊断
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HSV-1截短gB基因DNA疫苗的构建及初步鉴定 被引量：1
6
作者 史霖 范桂香 +1 位作者 袁育康 王军阳 《西安医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期425-428,450,共5页
目的　为有效预防单纯疱疹Ⅰ型病毒 (HSV - 1 )感染 ,给多价DNA疫苗的构建奠定基础 ,构建表达截短HSV - 1 gB糖蛋白的DNA疫苗。方法　用PCR技术从HSV - 1基因组中扩增出编码HSV 1gB糖蛋白 1 - 5 1 7氨基酸序列的一段基因序列 ,通过 pGEM... 目的　为有效预防单纯疱疹Ⅰ型病毒 (HSV - 1 )感染 ,给多价DNA疫苗的构建奠定基础 ,构建表达截短HSV - 1 gB糖蛋白的DNA疫苗。方法　用PCR技术从HSV - 1基因组中扩增出编码HSV 1gB糖蛋白 1 - 5 1 7氨基酸序列的一段基因序列 ,通过 pGEM -T中介载体 ,将其插入到真核表达质粒pcDNA 3 1 (+)的CMV启动子下游。结果　构建的重组真核表达质粒可在动物体内正确表达目的基因 ,对HSV - 1病毒攻击具有免疫保护作用。结论　本研究对截短HSV - 1 gB基因DNA疫苗进行了初步的探索性研究 ,也为多价HSV 1DNA疫苗的构建奠定了基础。 展开更多
关键词 单纯疱疹病毒I型 糖蛋白B截短基因 DNA疫苗 分子克隆
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人截断型LBP基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建
7
作者 王晓东 刘友生 +2 位作者 张杰 高波 薛沿宁 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期637-640,共4页
目的　构建人N端截断型脂多糖结合蛋白 (tLBP)基因的杆状病毒表达载体 ,为后续的蛋白表达及其抗内毒素保护作用研究奠定基础。方法　采用PCR技术从人全长LBP基因cDNA中扩增长度为 6 95bp的基因片段 ,经pGEM T载体亚克隆筛选和序列分析... 目的　构建人N端截断型脂多糖结合蛋白 (tLBP)基因的杆状病毒表达载体 ,为后续的蛋白表达及其抗内毒素保护作用研究奠定基础。方法　采用PCR技术从人全长LBP基因cDNA中扩增长度为 6 95bp的基因片段 ,经pGEM T载体亚克隆筛选和序列分析后 ,应用Bac To Bac杆状病毒表达系统 ,基因重组和外源基因转座分别构建转移质粒pFASTBACtLBP和穿梭质粒pBacmidtLBP。结果　经PCR、琼脂糖凝胶电泳、酶切分析及序列测定 ,所克隆的基因片段为 70 0bp左右的tLBP ,并证实其目的基因重组载体发生了特异转座和病毒重组。结论　本实验成功克隆了tLBP目的基因片段并构建其杆状病毒表达载体。 展开更多
关键词 截断型脂多糖结合蛋白 基因克隆 重组载体 杆状病毒 tLBP
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