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Current and future editing reagent delivery systems for plant genome editing 被引量:17
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作者 Yidong Ran Zhen Liang Caixia Gao 《Science China(Life Sciences)》 SCIE CAS CSCD 2017年第5期490-505,共16页
Many genome editing tools have been developed and new ones are anticipated; some have been extensively applied in plant genetics, biotechnology and breeding, especially the CRISPR/Cas9 system. These technologies have ... Many genome editing tools have been developed and new ones are anticipated; some have been extensively applied in plant genetics, biotechnology and breeding, especially the CRISPR/Cas9 system. These technologies have opened up a new era for crop improvement due to their precise editing of user-specified sequences related to agronomic traits. In this review, we will focus on an update of recent developments in the methodologies of editing reagent delivery, and consider the pros and cons of current delivery systems. Finally, we will reflect on possible future directions. 展开更多
关键词 genome editing DNA RNA RNP and virus delivery Agrobacterium-mediated transformation biolistic method protoplast transfeetion ttransgene-free genome edited plant
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治疗性超声介导体外基因转染的参数优化 被引量:10
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作者 陈智毅 谢明星 +1 位作者 王新房 吕清 《中国医学影像技术》 CSCD 北大核心 2008年第10期1511-1514,共4页
目的探讨不同治疗性超声(TUS)参数对基因转染的作用,优化TUS参数以实现高效率的转染,减少对细胞活力和质粒完整性的影响。方法将质粒和Sono Vue微泡加入培养的Hela细胞后行超声辐照,改变超声强度、占空比以及辐照时间等参数,比较不同的... 目的探讨不同治疗性超声(TUS)参数对基因转染的作用,优化TUS参数以实现高效率的转染,减少对细胞活力和质粒完整性的影响。方法将质粒和Sono Vue微泡加入培养的Hela细胞后行超声辐照,改变超声强度、占空比以及辐照时间等参数,比较不同的TUS辐照策略对细胞活力及红色荧光蛋白(DsRed)表达效率的影响,以确定最佳辐照参数,并对质粒完整性进行分析。结果低超声强度(0.4 W/cm^2、1.0 W/cm^2)、低占空比(10%和20%)时,细胞存活率较高(>80%),辐照1 min和3 min之间的细胞活力差异不明显(P>0.05)。当增加超声强度(1.6 W/cm^2、2.2 W/cm^2)和占空比(50%)时,细胞活力显著下降(P<0.05)。当20%占空比,1.0 W/cm^2的TUS辐照3 min时,可实现最高的转染率。质粒DNA结构的完整性不受优化的TUS参数影响。结论TUS是一种有效的基因输送方法,优化的参数在无显著细胞死亡和DNA损伤的前提下增加转染,这种非侵袭性的基因转染方法可能是临床基因疗法的一种有用工具。 展开更多
关键词 超声检查 介入性 声孔效应 转染 基因传输 优化
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miR-183及Akt1蛋白在子宫内膜癌中的表达及其意义 被引量:7
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作者 于健 陈慧然 +1 位作者 张潘军 吴迪 《解剖科学进展》 2017年第1期50-53,共4页
目的探讨miR-183及Akt1蛋白在子宫内膜癌(EC)组织中的表达,以及抑制或过表达miR-183对Ishikawa细胞内Akt1蛋白表达的影响。方法实时定量PCR方法检测子宫内膜癌组织miR-183及Akt1m RNA的表达水平,Western blot方法检测子宫内膜癌组织Akt... 目的探讨miR-183及Akt1蛋白在子宫内膜癌(EC)组织中的表达,以及抑制或过表达miR-183对Ishikawa细胞内Akt1蛋白表达的影响。方法实时定量PCR方法检测子宫内膜癌组织miR-183及Akt1m RNA的表达水平,Western blot方法检测子宫内膜癌组织Akt1蛋白表达;将miR-183 inhibitors或miR-183 mimics应用阳离子脂质体Lipofectamine TM2000转染将转染至Ishikawa细胞,实时定量PCR方法及Western blot方法分别检测转染后Akt1 mRNA及蛋白的表达变化,MTT方法检测转染后细胞增殖能力的变化。结果 miR-183在子宫内膜癌组织中的表达量较癌旁组织明显降低,Akt1蛋白及mRNA在癌组织中较癌旁组织表达明显增高(P<0.01);与对照组相比,转染miR-183 mimics的Ishikawa细胞内Akt1蛋白与mRNA水平显著降低,细胞增殖能力显著下降(P<0.01);与对照组相比,转染miR-183 inhibitors的Ishikawa细胞内Akt1蛋白与mRNA水平显著升高,细胞增殖能力亦显著升高(P<0.01)。结论 miR-183在子宫内膜癌组织中低表达,并能够抑制Ishikawa细胞增殖,抑制Akt1的表达可能是其作用机制之一。 展开更多
关键词 子宫内膜癌 miR-183 AKT1 ISHIKAWA细胞 转染
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稳定转染NDRG2基因对人肝癌细胞HepG2的作用 被引量:6
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作者 吴国强 李开宗 +2 位作者 窦科峰 药立波 刘新平 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期2127-2130,共4页
目的观察NDRG2基因(N—myc downstream regulated gene2)对肝癌细胞株HepG2生物学行为的影响。方法采用脂质体法将正义及反义NDRG2基因稳定转染HepG2及QZG细胞,采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学及Western blot法进... 目的观察NDRG2基因(N—myc downstream regulated gene2)对肝癌细胞株HepG2生物学行为的影响。方法采用脂质体法将正义及反义NDRG2基因稳定转染HepG2及QZG细胞,采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学及Western blot法进行鉴定;比较观察其生物学特性的变化。结果NDRG2基因在NDRG2-HepG2细胞中得到了稳定表达;NDRG2-HepG2与HepG2细胞在细胞计数(1、2、3、4、5、6、7d分别为3×10^5/6×10^5、4×10^5/12×10^5、5×10^5/13×10^5、6.0×10^5/13.5×10^5、6.5×10^5/15.0×10^5、6.8×10^5/16.5×10^5、7×10^5/17×10^5)、细胞集落形成(32.4±4.7/56.5±5.6)及成瘤重量(0.0462g/0.2120g)差异有统计学意义(P〈0.05);而Anti—QZG与QZG细胞的差异无统计学意义(P〉0.05)。结论NDRG2基因可抑制肝癌细胞株HepG2细胞生长增殖。 展开更多
关键词 肝细胞 NDRG2 转染
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VEGF-ASODN转染对舌癌Tca8113细胞VEGF表达及生长的抑制作用 被引量:5
5
作者 李晓光 王延秀 +1 位作者 周宝琴 亓春花 《上海口腔医学》 CAS CSCD 2009年第5期509-514,共6页
目的:研究血管内皮细胞生长因子(VEGF)-反义寡核苷酸(ASODN)转染舌癌Tca8113细胞对其VEGF表达和生长的抑制作用。方法:人工合成硫代磷酸化VEGF-ASODN,转染舌癌Tca8113细胞,24h后,应用原位杂交及免疫细胞化学法检测细胞VEGF mRNA及蛋白表... 目的:研究血管内皮细胞生长因子(VEGF)-反义寡核苷酸(ASODN)转染舌癌Tca8113细胞对其VEGF表达和生长的抑制作用。方法:人工合成硫代磷酸化VEGF-ASODN,转染舌癌Tca8113细胞,24h后,应用原位杂交及免疫细胞化学法检测细胞VEGF mRNA及蛋白表达,ELISA法检测培养液上清中VEGF蛋白含量,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,用MTT实验检测转染对细胞活性的影响,用细胞生长曲线表示转染对细胞生长的影响。结果与对照组比较,采用SPSS12.0软件包进行统计学分析。结果:VEGF-ASODN能显著降低VEGF mRNA及蛋白水平,降低培养液中VEGF蛋白含量,增加细胞凋亡,抑制细胞活性及生长(P<0.05)。结论:VEGF-ASODN转染舌鳞癌Tca8113细胞,能显著抑制VEGF mRNA及蛋白表达,增加细胞凋亡,抑制细胞生长。 展开更多
关键词 血管内皮细胞生长因子 反义寡核苷酸 转染 TCA8113细胞
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前列腺素脱氢酶对大肠癌SW480细胞恶性增殖的抑制作用 被引量:3
6
作者 李美宁 冯燕 +4 位作者 解军 常冰梅 张悦红 殷云勤 程牛亮 《肿瘤防治研究》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期236-239,共4页
目的研究15-羟基前列腺素脱氢酶(15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase,PGDH)对SW480大肠癌细胞恶性增殖的抑制作用及机制。方法构建PGDH真核表达质粒(pcDNA3.1-PG-DH),在大肠癌SW480细胞中转染并表达PGDH蛋白,采用MTT法、平板集落和... 目的研究15-羟基前列腺素脱氢酶(15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase,PGDH)对SW480大肠癌细胞恶性增殖的抑制作用及机制。方法构建PGDH真核表达质粒(pcDNA3.1-PG-DH),在大肠癌SW480细胞中转染并表达PGDH蛋白,采用MTT法、平板集落和软琼脂克隆形成实验,分析PGDH对SW480恶性增殖的影响。Westernblot检测p53、p21蛋白表达改变情况。结果转染表达PGDH后,细胞增殖受到抑制,实验组平板集落形成率为16%,而对照组为58%,两者间差异显著(P<0.05);肿瘤细胞的停泊-非依赖能力降低,实验组软琼脂克隆体积小且形成个数(7±1.68)明显少于对照组(16.3±3.63),差异显著(P<0.05)。Westernblot分析表明,转染表达PGDH后伴随着p53、p21蛋白表达升高。结论转染表达PGDH蛋白能够部分逆转大肠癌SW480细胞的恶性表型,其过程可能与p53、p21通路密切相关。 展开更多
关键词 大肠癌 PGDH转染 细胞生长 P53
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Atrophin-1全长基因稳定转染和瞬时转染真核细胞系的表达分析 被引量:6
7
作者 张鑫 顾卫红 王国相 《中国现代神经疾病杂志》 CAS 2011年第1期76-81,共6页
目的建立正常(CAG重复次数为19次)和异常(CAG重复次数为82和66次)atrophin-1[齿状核红核苍白球路易体萎缩(DRPLA)致病基因]全长基因真核表达体系,通过观察细胞形态及蛋白质表达水平和分布情况,比较稳定转染和瞬时转染两种细胞表达体系,... 目的建立正常(CAG重复次数为19次)和异常(CAG重复次数为82和66次)atrophin-1[齿状核红核苍白球路易体萎缩(DRPLA)致病基因]全长基因真核表达体系,通过观察细胞形态及蛋白质表达水平和分布情况,比较稳定转染和瞬时转染两种细胞表达体系,为进一步研究建立良好的细胞模型。方法基于已构建的GFP-atrophin-1-Q19/Flp-In TREx293和GFP-atrophin-1-082/Flp-In TREx293两种稳定转染细胞株,利用四环素调控系统Tet-on诱导表达。正置荧光显微镜观察正常与异常atrophin-1融合蛋白在细胞中的表达定位,电子显微镜观察细胞超微结构的改变;脂质体介导法将重组真核表达质粒GFP-atrophin-1-Q19和GFP-atrophin-1-Q66瞬时转染293T和SH-SY5Y细胞,HE染色、倒置荧光显微镜和电子显微镜分别观察细胞形态结构、蛋白质表达定位和细胞超微结构,western blotting检测atrophin-1融合蛋白表达水平。结果在稳定转染体系中,绿色荧光信号大多位于细胞核内,异常蛋白质呈不均匀分布且有少数聚集现象;电子显微镜观察异常细胞胞核结构欠完整,核膜皱缩,核内结构紊乱。在瞬时转染293T细胞体系中,HE染色可见异常细胞核内形成粉紫色嗜酸性小体;大量atrophin-1融合蛋白在核内呈点状聚集现象;电子显微镜观察异常细胞核膜皱缩严重,核内大量电子致密物沉积且核仁消失;western blotting检测均表达atrophin-1融合蛋白。在转染的SH-SY5Y细胞体系中,蛋白质表达定位及western blotttng检测结果与转染293T细胞基本一致。结论包含异常扩增多聚谷氨酰胺链的atrophin-1融合蛋白在真核表达体系中可产生明显的核内聚集现象,并引起细胞形态改变,此为研究DRPLA核内包涵体的形成及其在发病中的作用,以及进一步的干预治疗奠定了理论基础。 展开更多
关键词 脊髓小脑共济失调 基因 转染 细胞 培养的 显微镜检查 荧光
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转染Bcl-2基因的膀胱癌细胞多药耐药性研究 被引量:4
8
作者 刘贤奎 孔垂泽 时京 《中华肿瘤防治杂志》 CAS 2006年第15期1151-1153,1162,共4页
目的:探讨转染Bcl-2基因后膀胱癌细胞的多药耐药变化。方法:采用基因重组技术构建Bcl-2基因的真核表达载体pcD-NA3.1(+)/Bcl-2,经酶切和基因测序分析对构建结果进行鉴定;通过脂质体将含Bcl-2基因的表达载体转染膀胱癌细胞BIU-87,RT-PCR... 目的:探讨转染Bcl-2基因后膀胱癌细胞的多药耐药变化。方法:采用基因重组技术构建Bcl-2基因的真核表达载体pcD-NA3.1(+)/Bcl-2,经酶切和基因测序分析对构建结果进行鉴定;通过脂质体将含Bcl-2基因的表达载体转染膀胱癌细胞BIU-87,RT-PCR检测基因转录水平;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞在不同化疗药物作用下的细胞耐药性。结果:经酶切鉴定和基因测序分析证明真核表达载体pcDNA3·1(+)/Bcl-2构建成功。将该表达载体转染BIU-87细胞后,Bcl-2基因的表达水平与野生型BIU-87细胞和转染空载体的BIU-87/neo细胞相比显著提高(P<0·01)。与BIU-87细胞和BIU-87/neo细胞相比,BIU-87/Bcl-2细胞对MMC、PHA和DDP等化疗药物的耐药性也明显增强(P<0·01)。结论:Bcl-2基因高表达是膀胱癌多药耐药的原因之一。 展开更多
关键词 膀胱肿瘤/药理学 基因 Bcl-2 抗药性 多药 转染
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WWOX基因转染对卵巢上皮性癌细胞生长的影响 被引量:5
9
作者 闫洪超 薛加强 +3 位作者 陆晓媛 万美荣 冯霞 刘小云 《中华妇产科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期361-365,共5页
目的 研究抑癌基因WWOX对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞生长的影响,寻求卵巢癌基因治疗的新途径。方法 将携有WWOX基因的真核表达载体体外转染卵巢癌细胞系H08910细胞(重组质粒组),筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染空载质粒(空... 目的 研究抑癌基因WWOX对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞生长的影响,寻求卵巢癌基因治疗的新途径。方法 将携有WWOX基因的真核表达载体体外转染卵巢癌细胞系H08910细胞(重组质粒组),筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染空载质粒(空质粒组)及未经转染(空白对照组)的H08910细胞作为对照,用蛋白印迹法检测重组质粒组细胞中WWOX蛋白的表达情况。体外实验:分别用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、体外侵袭实验、琼脂克隆形成实验及流式细胞仪等分析WWOX基因对H08910细胞生物学活性的影响。体内实验:将转染细胞接种于BALB/c裸鼠腹腔,观察裸鼠生存时间和肿瘤生长情况。结果 (1)重组质粒组细胞中WWOX蛋白能稳定表达,空质粒组及空白对照组细胞未检测到WWOX蛋白的表达。(2)MTT比色法检测显示,重组质粒组各时间点的细胞增殖能力较空质粒组及空白对照组明显下降,差异均有统计学意义(P〈0.05)。(3)重组质粒组细胞的琼脂克隆形成率(19.8%)明显低于空质粒组(54.5%)及空白对照组(56.0%),差异有统计学意义(P〈0.05)。(4)流式细胞仪检测显示,重组质粒组中(72.08±o'39)%的细胞被阻滞于G0/G1期,分别与空质粒组[(41.02±1.08)%]及空白对照组[(39.31±0.67)%]比较,差异均有统计学意义(P〈0.05)。(5)体外侵袭实验显示,重组质粒组穿膜细胞数为(89.7±3.1)个,分别与空质粒组[(91.2±1.3)个]及空白对照组[(91.4±1.3)个]比较,差异均无统计学意义(P〉0.05)。(6)裸鼠体内实验表明,重组质粒组裸鼠体内的成瘤能力(包括转移灶数目、转移灶重量及移植瘤最大直径、腹水量)明显低于空质粒组及空白对照组,差异均有统计学意义(P〈0.05)。结论 抑癌基因WWOX可干扰卵巢癌细胞的细胞周期并� 展开更多
关键词 卵巢肿瘤 氧化还原酶类 基因 肿瘤抑制 转染 细胞增殖 肿瘤细胞 培养的
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真皮间充质干细胞的分离培养及其NOV基因的表达 被引量:2
10
作者 刘雁平 李露斯 +1 位作者 王涛 罗晓红 《西北国防医学杂志》 CAS 2008年第3期210-212,共3页
目的:分离培养大鼠真皮来源成体多能干细胞并研究其NOV基因表达。方法:分离培养新生大鼠真皮间充质干细胞,采用形态学观察及免疫组化法进行鉴定。用脂质体法将构建的NOV基因真核表达载体转染入大鼠真皮多能干细胞中,在荧光倒置显微镜下... 目的:分离培养大鼠真皮来源成体多能干细胞并研究其NOV基因表达。方法:分离培养新生大鼠真皮间充质干细胞,采用形态学观察及免疫组化法进行鉴定。用脂质体法将构建的NOV基因真核表达载体转染入大鼠真皮多能干细胞中,在荧光倒置显微镜下观察转染产物,RT-PCR法检测转染细胞中NOV基因表达。结果:新生大鼠真皮间充质干细胞86%处于G0/G1期,多向诱导后可分化为神经细胞及中胚层来源细胞。NOV重组质粒体外转染大鼠真皮多能干细胞后,转染细胞中检测到NOV基因。结论:大鼠真皮组织中存在着成体多能干细胞,具有多胚系分化潜能。该细胞可作为NOV基因表达的细胞载体。 展开更多
关键词 真皮 间充质干细胞 转染 NOV基因
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金属蛋白酶组织抑制剂1抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡 被引量:3
11
作者 代文迪 林洪丽 +2 位作者 王楠 王可平 刘越坚 《中华肾脏病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第8期477-482,共6页
目的探讨金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)在高糖诱导的肾小球系膜细胞(MC)凋亡中的作用及机制。方法用流式AnnexinV/PI双染法及吖啶橙染色检测大鼠MC经不同浓度葡萄糖作用后的凋亡率。用脂质体法将正义、反义人TIMP(hTIMP)-1转染到MC中... 目的探讨金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)在高糖诱导的肾小球系膜细胞(MC)凋亡中的作用及机制。方法用流式AnnexinV/PI双染法及吖啶橙染色检测大鼠MC经不同浓度葡萄糖作用后的凋亡率。用脂质体法将正义、反义人TIMP(hTIMP)-1转染到MC中。采用PCR及RT-PCR检测hTIMP-1的整合及大鼠内源性TIMP-1(rTIMP-1)、bax和bcl-2表达。用CaspACETMAssaySystem检测半胱氨酸天胱氨酸蛋白酶(caspase-3)的蛋白活性。结果高糖以剂量及时间依赖的方式诱导凋亡,相关系数r分别为0.925、0.9867,P均<0.01。在葡萄糖浓度为30mmol/L培养条件下,hTIMP-1正义转染组的MC24h凋亡率为(4.30±1.11)%,48h为(7.78±0.92)%,与正常对照组[24h(14.95±1.60)%,48h(43.03±4.20)%]及空载体组[24h(16.50±0.83)%,48h(40.82±2.46)%]相比,细胞凋亡显著减少(P<0.01);hTIMP-1反义转染组MC24h凋亡率为(22.5±1.60)%,48h为(53.68±3.40)%,与正常对照组和空载体组相比,细胞凋亡显著增加(P<0.01)。高糖作用后,正义TIMP-1下调MCbaxmRNA的表达,反义hTIMP-1使之表达上调。与对照组(A值0.1407±0.007)相比,正义hTIMP-1组caspse-3活性(A值0.086±0.009)显著降低,(P<0.01),反义hTIMP-1组caspase-3活性(A值0.186±0.02)显著增高,(P<0.01)。TIMP-1转染不影响bcl-2mRNA水平的表达。结论TIMP-1能够抑制高糖诱导的MC凋亡,这种作用部分是通过bax及easpase-3途径来实现的。 展开更多
关键词 金属蛋白酶组织抑制剂1 高糖 大鼠 肾小球系膜 细胞凋亡 高血糖症
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miR-21、miR-494对黑素瘤A375细胞凋亡和细胞周期的影响 被引量:4
12
作者 王焱 王震英 +4 位作者 孙建方 陈浩 周武庆 方方 张国成 《中华皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期719-722,共4页
目的探讨miR-21抑制物和miR-494模拟物转染A375细胞的最佳有效转染浓度及其对黑素瘤A375细胞增殖的影响。方法取6个浓度梯度的miR-21抑制物和miR-494模拟物转染A375细胞,实时荧光定量PCR法检测相应的miRNA。继而用Cy5标记的miRNA模拟... 目的探讨miR-21抑制物和miR-494模拟物转染A375细胞的最佳有效转染浓度及其对黑素瘤A375细胞增殖的影响。方法取6个浓度梯度的miR-21抑制物和miR-494模拟物转染A375细胞,实时荧光定量PCR法检测相应的miRNA。继而用Cy5标记的miRNA模拟物阴性对照转染A375细胞,荧光显微镜下观察转染效率。用流式细胞仪检测转染后细胞增殖的变化。结果从A375细胞中成功提出miRNA。定量PCR结果显示,当转染物miR-21抑制物浓度为120nmol/L时,转染细胞内有miR-21模拟物最大程度的下调表达,2^-△△Cr值为0.80(0.65~0.92),低于对照组;当miR-494模拟物浓度为250nmol/L时,转染细胞内有miR-494模拟物最大程度的上调,2^-△△Cr值为126.82(111.52~144.22),明显高于对照组;miR-21抑制物转染组与miR-494模拟物转染组G。期细胞比率分别为(61.61±3.25)%、(61.05±3.17)%,高于对照组(P〈0.05);增殖指数分别为(38.39±3.25)%、(38.95±3.17)%,低于对照组(P〈0.05);细胞凋亡率分别为(27.74±1.39)%、(34.30±2.35)%,高于对照组(P〈0.01),细胞转染效率达90%以上。结论miR-21抑制物和miR-494模拟物促使肿瘤细胞的G,期阻滞和促进凋亡作用,miR-21可增强A375细胞增殖,有原癌基因样功能;miR-494可抑制A375细胞增殖,有抑癌基因样作用。 展开更多
关键词 黑色素瘤 MIRNA-21 miRNA-494 转染 细胞周期 细胞凋亡
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大鼠脂肪间充质干细胞体外转染为胰岛素分泌细胞的实验研究 被引量:4
13
作者 葛亮 赵建勇 +1 位作者 孙诚谊 贾文胜 《中华消化外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期592-596,共5页
目的探讨脂肪间充质干细胞(ADMSCs)体外转染成为胰岛素分泌细胞的可能性及其在不同浓度葡萄糖环境下的胰岛素分泌情况。方法以未转染的ADMSCs作为对照组,含有PcDNA3-1的ADMSCs作为空载体组,含有PcDNA3.1-hINS的ADMSCs作为重组载体... 目的探讨脂肪间充质干细胞(ADMSCs)体外转染成为胰岛素分泌细胞的可能性及其在不同浓度葡萄糖环境下的胰岛素分泌情况。方法以未转染的ADMSCs作为对照组,含有PcDNA3-1的ADMSCs作为空载体组,含有PcDNA3.1-hINS的ADMSCs作为重组载体组,转染后再将重组载体组根据培养时间不同分为1、6、12、18d组,并将重组载体18d组根据葡萄糖浓度的不同分为高糖组和低糖组。RT-PCR扩增人胰岛素基因,并构建含有人胰岛素基因的真核表达重组载体PcDNA3.1-hINS。经离心消化法获得ADMSCs,并通过流式细胞仪检测。瞬时转染,RT-PCR测各组胰岛素DNA的转录,ELISA法检测各组胰岛素分泌量,并对重组载体18d组行葡萄糖刺激实验,计量资料以x-±s表示,多组间的比较采用方差分析,两组比较采用t检验。结果流式细胞仪检测ADMSCs表面抗原:CIM4、CD90、CD106表达阳性,CD34、CD45、CDllb表达阴性。RT-PCR法检测重组载体组有胰岛素DNA转录,对照组和空载体组均无转录。ELISA法检测重组载体1、6、12、18d组胰岛素分泌量分别为(4.7±0.8)mIU/L、(8.8±0.5)mIU/L、(8.9±0.8)mIU/L、(8.6±0.6)mIU/L,与对照组的(1.3±0.6)mIU/L和空载体组的(1.7±0.8)mIU/L分别比较,差异均有统计学意义(t=10.09,32.64,22.20,55.53;9.23,27.56,19.43,51.25,P〈0.05);重组载体1d组与6、12、18d组的胰岛素分泌量分别比较,差异有统计学意义(t=12.77,12.26,13.93,P〈0.05);而6、12、18d组间的胰岛素分泌量比较,差异无统计学意义(F=45.67,P〉0.05)。高糖组和低糖组胰岛素分泌量比较,差异有统计学意义(t=2.03,P〈0.05)。葡萄糖刺激实验阴性。结论ADMSCs成功转染为胰岛素分泌细胞,并可以稳定分泌胰岛素,虽然胰岛素分泌量不能根据葡萄糖的浓度改变而改变� 展开更多
关键词 脂肪间充质干细胞 糖尿病 转染 干细胞
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重组腺相关病毒-色素上皮衍生因子抑制氧诱导小鼠视网膜新生血管的作用 被引量:3
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作者 李涛 丁小燕 +3 位作者 马红婕 梁小玲 罗燕 唐仕波 《中华眼底病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期212-214,共3页
目的 观察重组腺相关病毒-色素上皮衍生因子(rAAV2-PEDF)对氧诱导小鼠视网膜新生血管(RNV)的作用.方法 选择3日龄C57/BL6小鼠22只,左眼为实验服,右眼为对照眼,微量注射器玻璃体腔分别注射rAAV2-PEDF和rAAV2-绿色荧光蛋白1μl.注射... 目的 观察重组腺相关病毒-色素上皮衍生因子(rAAV2-PEDF)对氧诱导小鼠视网膜新生血管(RNV)的作用.方法 选择3日龄C57/BL6小鼠22只,左眼为实验服,右眼为对照眼,微量注射器玻璃体腔分别注射rAAV2-PEDF和rAAV2-绿色荧光蛋白1μl.注射后立即将小鼠放入氧箱,建立氧诱导血管增生性视网膜病变模型.取13日龄小鼠4只提取视网膜总蛋白,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测色素上皮衍生因子(PEDF)蛋白表达.17日龄小鼠12只,荧光素心脏灌注视网膜铺片观察血管形态和分布.17日龄小鼠6只,视网膜冰冻切片外源凝集素标记后染色观察血管形态和分布.Image-Pro Plus5.1软件测量分析无荧光素灌注区和RNV的绝对面积和相对面积.结果 实验眼PEDF蛋白表达显著高于对照眼.视网膜铺片定量结果显示,实验眼和对照跟绝对无灌注区面积分别为(0.96±0.22)、(1.96±0.34)mm^2,差异有统计学意义(t=-8.554,P〈0.01);相对无灌注区面积分别为(8.64±1.52)%、(17.27±2.98)%,差异有统计学意义(t=-8.97,P〈0.01).实验眼和对照眼绝对新生血管面积分别为(0.37±0.11)、(1.26±0.38)mm^2,差异有统计学意义(t=-7.8,P〈0.01);相对新生血管面积分别为(3.96±0.66)%、(11.45±2.06)%,差异有统计学意义(t=-8.51,P〈0.01).外源凝集素标记定量结果显示,实验眼和对照眼RNV面积分别为(0.11±0.003)、(0.41 4-0.02)mm^2,差异有统计学意义(t=-5.14,P〈0.01).结论 rAAV2-PEDF可成功转染小鼠视网膜组织并稳定表达PEDF蛋白,不仅可以减少氧诱导血管增生性视网膜病变小鼠视网膜无灌注面积,而且可显著抑制RNV生成. 展开更多
关键词 视网膜新生血管化/预防和控制 细胞因子类 基因转移技术 转染 动物实验
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人Ⅰ型胶原基因脂质体转染牛耳细胞克隆筛选方法 被引量:2
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作者 刘婷婷 王亮 +2 位作者 吕自力 彭涛 王安江 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期10-16,共7页
构建连接有人Ⅰ型胶原基因的质粒(PGC1-collagen),利用脂质体介导的方法转染荷斯坦奶牛耳成纤维细胞,优化一系列转染条件以提高转染效率,再利用G418和GFP荧光的表达来筛选稳定转染的细胞,最后以未转染的成纤维细胞作为阴性对照组,PGC1... 构建连接有人Ⅰ型胶原基因的质粒(PGC1-collagen),利用脂质体介导的方法转染荷斯坦奶牛耳成纤维细胞,优化一系列转染条件以提高转染效率,再利用G418和GFP荧光的表达来筛选稳定转染的细胞,最后以未转染的成纤维细胞作为阴性对照组,PGC1-collagen作为阳性对照组对转染的细胞进行PCR验证。结果显示:在6孔培养板中细胞融合度达到50%~60%左右介导1~3μg重组质粒转染24 h,转染效率可达25%~30%,筛选单克隆细胞在荧光显微镜观察检测到绿色荧光蛋白的表达。在使用800 U的G418筛选效果最好,维持浓度300~600 U,获得25个稳定表达的阳性细胞系,从中选取6个克隆进行PCR验证。成功利用脂质体转染方法将人Ⅰ型胶原基因成功转染到荷斯坦奶牛耳成纤维细胞,PCR验证结果正确。 展开更多
关键词 胶原基因 转染 成纤维细胞 阳性克隆
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稳定高表达RORα基因的人胃癌MGC803细胞系的构建与鉴定 被引量:3
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作者 赵晓红 向姝霖 +5 位作者 刘芳 夏红 曾希 苏波 凌晖 苏琦 《中南医学科学杂志》 CAS 2016年第1期5-10,共6页
目的构建维甲酸相关孤核受体α(RORα)基因的真核表达载体,并建立稳定高表达RORα的人胃癌MGC803细胞,为研究RORα的功能奠定基础。方法根据RORα基因的c DNA全序列,设计一对带有限制性酶切位点的引物。从人胃癌MGC803细胞中提取mRNA作... 目的构建维甲酸相关孤核受体α(RORα)基因的真核表达载体,并建立稳定高表达RORα的人胃癌MGC803细胞,为研究RORα的功能奠定基础。方法根据RORα基因的c DNA全序列,设计一对带有限制性酶切位点的引物。从人胃癌MGC803细胞中提取mRNA作为模板合成RORαc DNA第一链,并用上述引物扩增目的基因全序列,然后经双酶切插入到真核表达载体pc DNA3.1(+),转化大肠杆菌DH5α;用氨苄青霉素筛选pc DNA3.1(+)-RORα的阳性菌株,双酶切和测序进行鉴定。用经鉴定的重组质粒pc DNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞,G418筛选获得RORα/MGC803细胞株;Real-time PCR和Western blot检测该细胞株RORα的表达情况。结果经双酶切鉴定,构建的真核表达载体pc DNA3.1(+)-RORα包含有大约1 640 bp的插入片段,与预期大小一致;表达载体经测序鉴定,其插入片段碱基序列与RORα基因的c DNA序列完全一致。用构建的真核表达载体pc DNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞后,筛选到可稳定传代的RORα/MGC803细胞株。Real-time PCR与Western blot检测显示,RORα/MGC803细胞RORαmRNA和蛋白表达增高。结论成功构建真核表达载体pc DNA3.1(+)-RORα和建立高表达RORα基因的RORα/MGC803细胞。 展开更多
关键词 维甲酸相关孤核受体α 真核表达 转染 人胃癌MGC803细胞
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光化学作用增强阳离子聚合物介导EGFP转染结肠癌 被引量:3
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作者 肖卫东 陈炜 +2 位作者 陈祖林 刘嘉 葛海燕 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第9期922-925,共4页
目的观察光化学基因转染技术对阳离子聚合物介导目的DNA转染结肠癌细胞效率的影响。方法以结肠癌细胞SW 480、HT29为靶细胞,激光共聚焦显微镜观察光敏剂TPPS2 a的胞内分布,MTT法观察基于TPPS2 a的光化学作用对结肠癌细胞的生长抑制作用... 目的观察光化学基因转染技术对阳离子聚合物介导目的DNA转染结肠癌细胞效率的影响。方法以结肠癌细胞SW 480、HT29为靶细胞,激光共聚焦显微镜观察光敏剂TPPS2 a的胞内分布,MTT法观察基于TPPS2 a的光化学作用对结肠癌细胞的生长抑制作用,同时以阳离子聚合物PEI为DNA载体,EGFP质粒为目的DNA,通过流式细胞技术对比观察光化学作用对阳离子聚合物介导EGFP质粒转染结肠癌细胞的影响。结果TPPS2 a在2种结肠癌细胞系呈颗粒状分布于细胞质;基于TPPS2 a的光动力效应对结肠癌细胞的生长抑制作用随光照剂量增大而逐渐加大,SW 480细胞取得IC50的光照时间为约6 m in,而HT29取得IC50的光照时间为约12 m in;与单纯质粒转染组和阳离子聚合物转染组相比,光化学作用可将阳性细胞率分别提高至(29.61±1.15)(SW 480细胞)和(23.47±0.62)(HT29细胞)(P<0.05)。结论TPPS2 a的胞内分布与内吞密切相关;基于TPPS2 a的光化学细胞毒性作用呈剂量依赖性;与单纯质粒转染组和阳离子聚合物转染组相比,光化学作用可明显提高阳离子聚合物介导转染目的DNA的阳性细胞率。 展开更多
关键词 光敏剂 光动力疗法 阳离子聚合物 转染
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connexin43基因体外转染大鼠L6骨骼肌成肌细胞的研究 被引量:3
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作者 王多 张雷 +3 位作者 邵素霞 吕萍 张金平 崔轶 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第19期1821-1823,共3页
目的将含有connexin 43基因的质粒在脂质体的介导下转染进入大鼠L6骨骼肌成肌细胞,使用G418根据有限稀释法筛选单克隆细胞株L6myoblast-Cx43。方法通过免疫细胞化学技术、Western blot技术,对整合有connexin43基因的阳性细胞克隆进行检... 目的将含有connexin 43基因的质粒在脂质体的介导下转染进入大鼠L6骨骼肌成肌细胞,使用G418根据有限稀释法筛选单克隆细胞株L6myoblast-Cx43。方法通过免疫细胞化学技术、Western blot技术,对整合有connexin43基因的阳性细胞克隆进行检测。结果两个阳性克隆组Cx43蛋白表达均明显高于对照组。结论获得的两个持续高表达connexin43蛋白的细胞株可用于进行移植细胞之间及移植细胞与宿主细胞之间能否形成良好的电偶联的研究。 展开更多
关键词 CONNEXIN43 骨骼肌成肌细胞 基因表达 转染 细胞克隆
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β1整合素反义寡核苷酸对人结肠癌细胞黏附和侵袭抑制作用 被引量:2
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作者 谭晓杰 张建立 高军 《齐鲁医学杂志》 2009年第4期286-288,共3页
目的研究β1整合素反义寡核苷酸(ASODN)对人结肠癌HT-29细胞侵袭的抑制作用。方法以脂质体为载体将硫代磷酸修饰的β1整合素ASODN及无义寡核苷酸(NSODN)转染人结肠癌HT-29细胞,通过RT-PCR及Western-Blot试验,分别测定ASODN组、NSODN组... 目的研究β1整合素反义寡核苷酸(ASODN)对人结肠癌HT-29细胞侵袭的抑制作用。方法以脂质体为载体将硫代磷酸修饰的β1整合素ASODN及无义寡核苷酸(NSODN)转染人结肠癌HT-29细胞,通过RT-PCR及Western-Blot试验,分别测定ASODN组、NSODN组和空白对照组β1整合素mRNA和蛋白的表达,MTT法和Transwell小室法分别测定其黏附力和侵袭力。结果与NSODN组和空白对照组相比较,ASODN组中β1整合素mRNA和蛋白表达强度明显降低;ASODN组和NSODN组转染的人结肠癌HT-29细胞侵袭力均下降,但前者下降较为明显。结论β1整合素ASODN转染HT-29细胞后,通过降低其β1整合素mRNA和蛋白表达水平,从而抑制其对细胞外基质的侵袭。 展开更多
关键词 HT29细胞 抗原 CD29 寡核苷酸类 反义 转染
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骨形态发生蛋白2基因转染人羊水干细胞复合β-磷酸三钙支架促进骨再生 被引量:2
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作者 马超 刘光旺 +6 位作者 张艳玲 高娟 郭含军 曲新华 翟赞京 谢幼专 戴尅戎 《中华生物医学工程杂志》 CAS 2014年第2期94-99,共6页
目的研究重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白2(BMP-2)基因转染人羊水干细胞(hAFSC)的体外成骨分化,评价基因修饰的hAFSC负载于β-磷酸三钙(β-TCP)多孔支架后体内成骨能力。方法收集人工破膜后的中段羊水原代培养hAFSC,免疫磁珠分... 目的研究重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白2(BMP-2)基因转染人羊水干细胞(hAFSC)的体外成骨分化,评价基因修饰的hAFSC负载于β-磷酸三钙(β-TCP)多孔支架后体内成骨能力。方法收集人工破膜后的中段羊水原代培养hAFSC,免疫磁珠分选CDl17/c-kit阳性的hAFSC,分别转染腺病毒介导的BMP-2或增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,转染组转染BMP-2和EGFP基因、对照组转染无BMP-2编码序列的EGFP基因,空白组不做病毒转染。48h后荧光显微镜下观察细胞荧光表达及生长状况,应用流式细胞仪检测转染率。转染第7、14、21、28天采用ELISA检测各组hAFSC培养液中的BMP.2分泌量以确认转染后目的蛋白表达效果。各组hAFSC成骨诱导14d后进行碱性磷酸酶(ALP)染色,28d后进行茜素红染色评价成骨能力;成骨诱导3、7、14d后定量检测各组细胞ALP活性。20只8周龄裸小鼠随机分为Adv-hBMP-2-hAFSC-β-TCP组、Adv-EGFP-hAFSC-β-TCP组、hAFSC-β-TCP组和β-TCP组,每组5只,将细胞载体复合物植入各组裸小鼠股骨,8周后观察异位成骨组织学情况。结果hAFSC生长良好,Adv-hBMP-2或Adv-EGFP基因转染48h后荧光显微镜下见细胞贴壁良好,发出强绿色荧光,无死细胞产生,转染阳性率达(89.00±4.25)%。转染Adv-hBMP-2组hAFSC培养液上清中BMP-2第7、14、21、28天分别为(3.405±0.229)μg/L、(4.575±0.179)μg/L、(3.910±0.175)μg/L、(2.694±0.205)μg/L,第14天蛋白BMP-2分泌已达到高峰且第28天仍有蛋白表达,各时间点均明显高于对照组与空白组(均P〈0.05)。hAFSC成骨诱导14d后细胞相连成片,与对照组及空白组比较,ALP染色转染组染色阳性面积更大、阳性细胞数量更多。成骨诱导28d后茜素红染色见转染组细胞多中心聚集,伴大量红色钙结节形成,结节数量与大小明显优于对照组与空白组。成骨诱� 展开更多
关键词 骨形态发生蛋白质类 羊水干细胞 基因 转染 β-磷酸三钙支架 骨再生
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