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Establishment of a Genetic Transformation System and Its Application in Thermoanaerobacter tengcongensis 被引量:9
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作者 Bo Liu Chuan Wang +1 位作者 Haihua Yang Huarong Tan 《Journal of Genetics and Genomics》 SCIE CAS CSCD 2012年第10期561-570,共10页
The whole-genome sequence of Thermoanaerobacter tengcongensis, an anaerobic thermophilic bacterium isolated from the Tengchong hot spring in China, was completed in 2002. However, in vivo studies on the genes of this ... The whole-genome sequence of Thermoanaerobacter tengcongensis, an anaerobic thermophilic bacterium isolated from the Tengchong hot spring in China, was completed in 2002. However, in vivo studies on the genes of this strain have been hindered in the absence of genetic manipulation system. In order to establish such a system, the plasmid pBOL01 containing the replication origin of the T. tengcongensis chromosome and a kanamycin resistance cassette, in which kanamycin resistance gene expression was controlled by the tte1482 promoter from T. tengcongensis, was constructed and introduced into T. tengcongensis via electroporation. Subsequently, the high transformation efficiency occurred when using freshly cultured T. tengcongensis cells without electroporation treatment, suggesting that T. tengcongensis is naturally competent under appropriate growth stage. A genetic transformation system for this strain was then established based on these important components, and this system was proved to be available for studying physiological characters of T. tengcongensis in vivo by means of hisG gene disruption and complementation. 展开更多
关键词 thermoanaerobacter tengcongensis Genetic transformation system Gene disruption and complementation
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二氧化钛富集磷酸肽方法优化及在腾冲嗜热厌氧菌磷酸化蛋白质组分析中的应用 被引量:5
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作者 林威 王京兰 +1 位作者 应万涛 钱小红 《色谱》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期763-769,共7页
为了提高二氧化钛富集磷酸肽法对磷酸肽的富集效率,以6种标准蛋白酶切肽段混合物为研究对象,对二氧化钛富集磷酸肽过程中的乙腈比例、三氟乙酸比例、二氧化钛用量等条件分别进行了优化。结果表明在乙腈含量为80%(v/v),三氟乙酸含量为1%(... 为了提高二氧化钛富集磷酸肽法对磷酸肽的富集效率,以6种标准蛋白酶切肽段混合物为研究对象,对二氧化钛富集磷酸肽过程中的乙腈比例、三氟乙酸比例、二氧化钛用量等条件分别进行了优化。结果表明在乙腈含量为80%(v/v),三氟乙酸含量为1%(v/v),二氧化钛用量与需要富集肽段的质量比为40∶1的条件下,可以取得较好的富集效果。将优化后的富集方法应用于腾冲嗜热厌氧菌磷酸化蛋白质的分析,初步鉴定到25个磷酸化蛋白质,为进一步研究这种极端环境下生存的低等生物的生命活动提供了参考信息。 展开更多
关键词 液相色谱 质谱 二氧化钛 磷酸肽 富集 腾冲嗜热厌氧菌 蛋白质组
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腾冲嗜热厌氧杆菌Cmr3的生物信息学分析及原核表达 被引量:2
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作者 毛耀芳 魏亚琴 +4 位作者 杨宇泽 孙康永杰 郑航辉 王川 万学瑞 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第7期2643-2648,共6页
本研究旨在阐明腾冲嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)Ⅲ-B型CRISPR-Cas系统Cmr蛋白在嗜热机制中的作用,利用PCR方法扩增出腾冲嗜热厌氧杆菌的cmr3基因,构建原核表达载体,将其转化至大肠杆菌(Escherichia coli)中,通过诱... 本研究旨在阐明腾冲嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)Ⅲ-B型CRISPR-Cas系统Cmr蛋白在嗜热机制中的作用,利用PCR方法扩增出腾冲嗜热厌氧杆菌的cmr3基因,构建原核表达载体,将其转化至大肠杆菌(Escherichia coli)中,通过诱导表达出Cmr3蛋白;并利用生物信息学软件分析比较cmr3基因在腾冲嗜热厌氧杆菌和两种常温菌中编码氨基酸的基本理化性质和蛋白三级结构。结果显示,腾冲嗜热厌氧杆菌Cmr3蛋白在大肠杆菌中表达,分子质量为43.4 kDa;生物信息学分析发现,腾冲嗜热厌氧杆菌cmr3基因序列长1134 bp,共编码377个氨基酸,Cmr3蛋白具有亲水性,且与常温菌相比更具有热稳定性,蛋白三级结构更为紧凑。本研究可以为了解嗜热菌CRISPR-Cas系统在嗜热过程中的作用提供科学依据。 展开更多
关键词 腾冲嗜热厌氧杆菌(thermoanaerobacter tengcongensis) 嗜热机制 CRISPR Cmr3
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napF3调控腾冲嗜热厌氧杆菌热适应机制
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作者 王若彤 刘亚娟 +5 位作者 郑航辉 陈宜军 万学瑞 赵春林 王川 杨宇泽 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期3825-3839,共15页
【目的】研究腾冲嗜热厌氧杆菌napF3在不同温度下的功能。【方法】通过同源重组构建腾冲嗜热厌氧杆菌的ΔnapF3株,观察并比较其在50、60、75和80℃下野生株和ΔnapF3株的生长趋势。通过转录组测序确定ΔnapF3株与野生株在75℃的差异表... 【目的】研究腾冲嗜热厌氧杆菌napF3在不同温度下的功能。【方法】通过同源重组构建腾冲嗜热厌氧杆菌的ΔnapF3株,观察并比较其在50、60、75和80℃下野生株和ΔnapF3株的生长趋势。通过转录组测序确定ΔnapF3株与野生株在75℃的差异表达基因。采用荧光定量PCR分析野生株和ΔnapF3株中13个基因和3个sRNA在50、60、75和80℃下的转录水平。【结果】成功构建了ΔnapF3株,生长曲线结果显示其在50℃和80℃不生长,60℃和75℃生长速度显著减缓。转录组结果显示:有899个基因表达发生差异,包括363个上调基因和536个表达下调基因,这些差异表达基因主要富集在缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、ABC运输工具、双组分系统、脂肪酸合成、硫胺素代谢等途径,并发现与嗜热机制相关的13个基因和3个非编码RNA的转录水平在特定温度下发生了变化。【结论】腾冲嗜热厌氧杆菌napF3在热适应过程中发挥重要作用。 展开更多
关键词 腾冲嗜热厌氧杆菌 napF3 热适应 机制 转录组 差异表达基因
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腾冲嗜热厌氧杆菌tte0732基因的表达及生物信息学分析 被引量:4
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作者 刘原子 王艳 +3 位作者 王川 吴润 万学瑞 吴自祥 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2018年第1期42-49,共8页
腾冲嗜热厌氧杆菌tte0732(Galu)基因编码的TTE0732是温度依赖性蛋白。为研究其在热适应中的作用,应用PCR技术克隆腾冲嗜热厌氧菌tte0732基因,构建原核表达载体pET-28a::tte0732并在大肠埃希菌BL21表达TTE0732;通过qRT-PCR分析tte0732基... 腾冲嗜热厌氧杆菌tte0732(Galu)基因编码的TTE0732是温度依赖性蛋白。为研究其在热适应中的作用,应用PCR技术克隆腾冲嗜热厌氧菌tte0732基因,构建原核表达载体pET-28a::tte0732并在大肠埃希菌BL21表达TTE0732;通过qRT-PCR分析tte0732基因在50、60、75和80℃的RNA表达量;应用生物信息学软件分析Galu在嗜热菌和常温菌中编码氨基酸的基本理化性质。成功构建了原核表达载体pET-28a::tte0732并在大肠埃希菌BL21中得到高效表达,TTE0732分子质量大小为35 ku,主要以可溶性形式存在;qRT-PCR显示tte0732 mRNA在75和80℃高表达;生物信息学分析得出tte0732基因完整的ORF全长909 bp,编码302个氨基酸,其中Ile(I)、Leu(L)含量高于常温菌,编码蛋白为酸性亲水性蛋白,等电点为5.22,含有18个潜在的磷酸化位点,不存在跨膜结构、信号肽和糖基化位点。预测其蛋白质二级空间结构以α-螺旋、无规则卷曲、β-折叠为主。腾冲嗜热厌氧杆菌TTE0732蛋白是一种亲水性蛋白,在原核系统能高效表达,本研究结果对嗜热蛋白质的热稳定性机制的研究具有一定的参考。 展开更多
关键词 腾冲嗜热厌氧菌 tte0732基因 原核表达 生物信息学分析 QRT-PCR
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基于转录组分析的腾冲嗜热厌氧杆菌thiD的热适应机制研究
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作者 刘亚娟 郑航辉 +5 位作者 刘原子 陈宜军 万学瑞 赵春林 王川 杨宇泽 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期3453-3473,共21页
ThiD在腾冲嗜热厌氧杆菌中由thiD编码,是硫铵素合成途径的关键酶。thiD的结构和功能已在真菌、酵母菌和植物中得到阐明。然而,thiD在嗜热生物中的功能仍不清楚。【目的】探讨腾冲嗜热厌氧杆菌的嗜热机制并揭示thiD在不同温度下的功能及... ThiD在腾冲嗜热厌氧杆菌中由thiD编码,是硫铵素合成途径的关键酶。thiD的结构和功能已在真菌、酵母菌和植物中得到阐明。然而,thiD在嗜热生物中的功能仍不清楚。【目的】探讨腾冲嗜热厌氧杆菌的嗜热机制并揭示thiD在不同温度下的功能及在热适应调控中的作用。【方法】利用同源重组技术构建腾冲嗜热厌氧杆菌的ΔthiD株,观察并比较野生株和ΔthiD株在50、60、75和80℃下的生长趋势。通过转录组测序分析ΔthiD株与野生株在75℃的差异表达基因。通过实时荧光定量PCR分析比较野生株和ΔthiD株中13个基因和3个sRNAs在50、60、75、80℃下的转录水平。【结果】成功构建了ΔthiD株,生长曲线结果显示其在50℃时,ΔthiD株生长速率与野生株无显著差异。然而,在60℃和75℃时,ΔthiD株生长速度明显慢于野生株。另外,ΔthiD株在80℃时几乎不生长。转录组结果显示,与野生株相比,ΔthiD株有503个差异表达基因,其中包括278个上调差异表达基因和213个下调差异表达基因。KEGG分析表明,以下途径与热适应有关,包括硫胺素代谢、嘧啶代谢和嘌呤代谢、肽聚糖生物合成、脂肪酸代谢途径、氨基酸代谢途径、双组分系统、DNA复制、同源重组、错配修复、磷酸转移酶系统。通过实时荧光定量PCR分析发现,在野生株和ΔthiD株中与嗜热机制相关的13个基因和3个sRNAs在特定温度下的转录水平发生了变化。【结论】thiD在腾冲嗜热厌氧杆菌热适应过程中发挥重要作用。本研究为揭示thiD在不同温度下的功能和在热适应过程中的调控机制提供实验数据和理论依据。 展开更多
关键词 腾冲嗜热厌氧杆菌 thiD 转录组 差异表达基因 热适应
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腾冲嗜热厌氧杆菌ahpC编码基因的克隆表达及生物信息学分析 被引量:3
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作者 郑航辉 高昇 +4 位作者 杨宇泽 吴润 万学瑞 王川 刘磊 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期36-40,共5页
为了研究腾冲嗜热厌氧杆菌( Thermoanaerobacter tengcongensis )AhpC在嗜热中的作用,应用PCR技术扩增腾冲嗜热厌氧菌 tte0270 基因(即 ahpC 编码基因),构建了原核表达载体pET-28a:: ahpC 并在大肠杆菌BL21(DE3)表达 AhpC ,并通过荧光定... 为了研究腾冲嗜热厌氧杆菌( Thermoanaerobacter tengcongensis )AhpC在嗜热中的作用,应用PCR技术扩增腾冲嗜热厌氧菌 tte0270 基因(即 ahpC 编码基因),构建了原核表达载体pET-28a:: ahpC 并在大肠杆菌BL21(DE3)表达 AhpC ,并通过荧光定量PCR分析 ahpC 在50 ℃、60 ℃、75 ℃和80 ℃的mRNA表达量;同时利用生物信息学软件分析AhpC在腾冲嗜热厌氧杆菌、单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌中编码氨基酸的基本理化性质和蛋白质三级结构。在BL21(DE3)中腾冲嗜热厌氧杆菌AhpC蛋白能高效的表达,以可溶性形式存在,分子质量为26 ku;荧光定量PCR结果表明腾冲嗜热厌氧杆菌 ahpC mRNA表达量随温度升高而提高;生物信息学分析得出AhpC含有220个氨基酸,为酸性亲水性蛋白,等电点为6.126,蛋白质有29.1%的氨基酸参与α-螺旋结构的形成。嗜热菌AhpC中Glu(E)和Lys(K)的含量高于常温细菌。腾冲嗜热厌氧杆菌AhpC的三级结构明显比大肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌的更紧凑。结果对腾冲嗜热菌嗜热机制研究具有一定的启发。 展开更多
关键词 腾冲嗜热厌氧菌 AHPC 热适应
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腾冲嗜热厌氧菌热休克蛋白60及其基因表达的热激动态变化分析 被引量:1
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作者 孟博 王敬强 +2 位作者 李娜 马延和 刘斯奇 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期269-274,共6页
热休克蛋白60(HSP60)是细菌体内一种非常重要的分子伴侣,其可以协助蛋白质或肽链的正确折叠和构型,防止变性和降解。基于本实验室的早期观察,腾冲嗜热厌氧菌的HSP60是一个典型的温度相关蛋白质,在80℃的表达水平最高。为了进一步了解嗜... 热休克蛋白60(HSP60)是细菌体内一种非常重要的分子伴侣,其可以协助蛋白质或肽链的正确折叠和构型,防止变性和降解。基于本实验室的早期观察,腾冲嗜热厌氧菌的HSP60是一个典型的温度相关蛋白质,在80℃的表达水平最高。为了进一步了解嗜热菌应急的分子机制,继续进行了在热激后HSP60基因表达的动态研究。将最适温度(75℃)下培养的腾冲嗜热厌氧菌迅速地转移至80℃继续培养,然后在不同的时间点上分别取样,并通过双向电泳、Western blot和Real_time PCR等方法,分析了HSP60在mRNA和蛋白质水平上的表达量的改变。试验结果表明,在80℃热处理4h内的短期应急过程中,HSP60蛋白水平一直呈上升趋势,而它的mRNA水平则表现为先升高后下降的一个非对称性的峰形变化。HSP60的mRNA和蛋白质的对温度的应答快慢程度是不同的。HSP60的mRNA水平的显著变化在1h内便可观察到,而蛋白质水平的显著改变要延迟3h左右。此外,HSP60的mRNA和蛋白质对温度的应答量变大小也是不同的。 展开更多
关键词 热休克蛋白60 热激动态变化 腾冲嗜热厌氧菌 嗜热菌
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Gene expression and molecular characterization of a thermostable trehalose phosphorylase from Thermoanaerobacter tengcongensis
9
作者 REN Yuanyuan 1,2 , DAI Xiuyu 1 , ZHOU Jian 1 , LIU Jingfang 1 , PEI Huadong 1,2 & XIANG Hua 1 1. State Key Laboratory of Microbial Resources and Center for Molecular Microbiology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China 2. Graduate School of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100037, China 《Science China(Life Sciences)》 SCIE CAS 2005年第3期221-227,共7页
A gene encoding the trehalose phosphorylase (TreP), which reversibly catalyzes trehalose degradation and synthesis from α-glucose-1-phosphate (α-Glc-1-P) and glucose, was cloned from Thermoanaerobacter tengcongensis... A gene encoding the trehalose phosphorylase (TreP), which reversibly catalyzes trehalose degradation and synthesis from α-glucose-1-phosphate (α-Glc-1-P) and glucose, was cloned from Thermoanaerobacter tengcongensis and successfully expressed in Escherichia coli. The overexpressed TreP, with a molecular mass of approximately 90 kDa, was determined by SDS-PAGE. It catalyzes trehalose synthesis and degradation optimally at 70℃ (for 30 min), with the optimum pHs at 6.0 and 7.0, respectively. It is highly thermostable, with a 77% residual ac- tivity after incubation at 50℃ for 7 h. Under the optimum reaction conditions, 50 μg crude en- zyme of the TreP is able to catalyze the synthesis of trehalose up to 11.6 mmol/L from 25 mmol/L α-Glc-1-P and 125 mmol/L glucose within 30 min, while only 1.5 mmol/L out of 250 mmol/L tre- halose is degraded within the same time period. Dot blotting revealed that the treP gene in T. tengcongensis was upregulated in response to salt stress but downregulated when trehalose was supplied. Both results indicate that the dominant function of the T. tengcongensis TreP is catalyzing trehalose synthesis but not degradation. Thus it might provide a novel route for indus- trial production of trehalose. 展开更多
关键词 gene expression thermoanaerobacter tengcongensis TREHALOSE phosphorylase dot blot.
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依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱方法的建立及其初步应用 被引量:2
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作者 毛心丽 卫军营 +6 位作者 牛明 周廉淇 王雪颖 佟巍 秦伟捷 张养军 钱小红 《色谱》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期170-177,共8页
建立了依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱方法,并与非依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱分析方法对不同体系(牛血清白蛋白酶切物、6种标准蛋白质混合物酶切物、腾冲嗜热菌蛋白提取液酶切物)的分析结果进行了系统比较。... 建立了依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱方法,并与非依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱分析方法对不同体系(牛血清白蛋白酶切物、6种标准蛋白质混合物酶切物、腾冲嗜热菌蛋白提取液酶切物)的分析结果进行了系统比较。结果表明,引入色谱保留时间后的智能化选择反应监测质谱方法能够显著提高肽段及蛋白质的鉴定量,并且在复杂体系(如腾冲嗜热菌蛋白提取液酶切物)中效果尤为明显,鉴定到的肽段及蛋白质的覆盖率可分别达到目标肽段和蛋白质数量的89.62%和92.41%,并且灵敏度高、重复性好,能够实现对质荷比相同但保留时间有差异的肽段的准确鉴定。该方法将在复杂生物样本目标蛋白质组高通量、高灵敏度的鉴定、验证和确认中发挥独特作用。 展开更多
关键词 液相色谱 保留时间 智能化选择反应监测 质谱 目标蛋白质组学 腾冲嗜热菌
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腾冲嗜热厌氧菌葡萄糖激酶在不同温度下的表达和催化活性 被引量:2
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作者 钱忠 王敬强 +2 位作者 周传奇 马延和 刘斯奇 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期243-248,共6页
尽管在腾冲嗜热厌氧菌的基因组注释中缺乏葡萄糖激酶(Glucokinase,GLK)(EC 2.7.1.2),但是该菌的蛋白质表达谱分析表明,TTE0090可能是一种新型的葡萄糖激酶。利用体外克隆表达的方法,表达了重组TTE0090;此蛋白质不仅具备使葡萄糖磷酸化... 尽管在腾冲嗜热厌氧菌的基因组注释中缺乏葡萄糖激酶(Glucokinase,GLK)(EC 2.7.1.2),但是该菌的蛋白质表达谱分析表明,TTE0090可能是一种新型的葡萄糖激酶。利用体外克隆表达的方法,表达了重组TTE0090;此蛋白质不仅具备使葡萄糖磷酸化的催化活性,同时在高温下也能参与反应。采用Western blot和阴离子交换层析的方法进一步检验了TTE0090在腾冲嗜热厌氧菌体内的蛋白质表达及其催化活性,发现体内TTE0090蛋白表达量随温度的升高而降低,而酶比活力却与生长温度呈正相关。这可能预示不同温度下腾冲嗜热厌氧菌中的糖酵解途径的催化通量是相对恒定的。实验数据均表明,TTE0090是存在于腾冲嗜热厌氧菌中的一种新型的葡萄糖激酶。TTE0090基因和其蛋白产物的研究工作,将进一步加深人们对嗜热菌的温度适应性以及它们的生存机理的了解。 展开更多
关键词 腾冲嗜热厌氧菌 葡萄糖激酶 温度 糖酵解
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腾冲菌脂肪酶的表达纯化及酶学性质的表征 被引量:2
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作者 李迅 仲惠 +3 位作者 王亮亮 邓若冰 高红 王飞 《化工进展》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第12期3337-3341,共5页
将来自腾冲菌的脂肪酶(LipA)基因(lipA)克隆到大肠杆菌表达载体pET28a(含T7启动子)和pTrc99A (含Trc启动子)中,转入大肠杆菌表达,发现Trc启动子更适合LipA的表达。通过热处理和DEAE-Sepharose阴离子柱纯化过程,重组LipA得到... 将来自腾冲菌的脂肪酶(LipA)基因(lipA)克隆到大肠杆菌表达载体pET28a(含T7启动子)和pTrc99A (含Trc启动子)中,转入大肠杆菌表达,发现Trc启动子更适合LipA的表达。通过热处理和DEAE-Sepharose阴离子柱纯化过程,重组LipA得到纯化,比酶活达到1.9U/mg,重组LipA分子量为42kDa。重组LipA在80℃、pH 4.5时酶活最高,经85℃保温2h,酶活保持60%以上;在pH值4.0~6.0之间,LipA具有较好的稳定性;Cu^2+和Zn^2+对酶活力分别有38.9%和69.2%的抑制作用,Mn^2+、Co^2+和Tween-20对该酶有较大的激活作用;以p-nitrophenyl-laurate (p-NP-C12)为底物时,该酶的Km值为1.5mmol/L,kcat为34.5s-1。 展开更多
关键词 腾冲菌 脂肪酶 酶学性质 对硝基苯十二酸酯
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腾冲嗜热厌氧杆菌cmr4基因的表达及生物信息学分析 被引量:1
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作者 俞海山 魏亚琴 +3 位作者 杨宇泽 万学瑞 王川 曾巧英 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期3088-3094,共7页
腾冲嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)cmr4基因是CRISPR-CasⅣ-B亚型原核防御系统的一部分。为研究其在腾冲嗜热厌氧杆菌热适应中的作用,通过PCR技术扩增得到cmr4基因,构建原核表达载体pET-28a::cmr4并在大肠杆菌BL21中... 腾冲嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)cmr4基因是CRISPR-CasⅣ-B亚型原核防御系统的一部分。为研究其在腾冲嗜热厌氧杆菌热适应中的作用,通过PCR技术扩增得到cmr4基因,构建原核表达载体pET-28a::cmr4并在大肠杆菌BL21中表达Cmr4蛋白;同时利用生物信息学软件分析腾冲嗜热厌氧杆菌、布氏酸菌以及肉毒杆菌中cmr4所编码氨基酸的理化性质。成功构建了原核表达载体pET-28a::cmr4,腾冲嗜热厌氧杆菌cmr4基因并在大肠杆菌BL21中得到表达,Cmr4蛋白其分子质量为40 kD,以可溶形式存在。实时荧光定量PCR结果表明腾冲嗜热厌氧杆菌cmr4 mRNA在75℃和80℃高表达;生物信息学分析显示腾冲嗜热厌氧杆菌cmr4基因编码349个氨基酸,Cmr4为亲水性蛋白,等电点为5.19,不存在糖基化位点,潜在的磷酸化位点有29个。本研究结果对Cmr4在嗜热菌中热适应作用机制的研究有一定的参考价值。 展开更多
关键词 腾冲嗜热厌氧杆菌 原核表达 CRISPR cmr4 生物信息学分析
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腾冲嗜热厌氧杆菌Cas2原核表达及生物信息学分析 被引量:1
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作者 王川 刘原子 +5 位作者 魏亚琴 毛婷 杨宇泽 俞海山 张钊 万学瑞 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2021年第2期10-16,共7页
为研究CRISPR/Cas系统及其相关蛋白Cas2(TTE2657)在腾冲嗜热厌氧杆菌热适应中的作用,应用PCR技术构建了原核重组质粒pET-28a::cas2,并在大肠埃希菌BL21表达Cas2蛋白;结合生物信息学软件对cas2编码蛋白的基本理化性质、氨基酸同源性、空... 为研究CRISPR/Cas系统及其相关蛋白Cas2(TTE2657)在腾冲嗜热厌氧杆菌热适应中的作用,应用PCR技术构建了原核重组质粒pET-28a::cas2,并在大肠埃希菌BL21表达Cas2蛋白;结合生物信息学软件对cas2编码蛋白的基本理化性质、氨基酸同源性、空间结构及蛋白质相互作用网络进行预测和分析。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-28a::cas2并在大肠埃希菌BL21中得到表达,Cas2分子质量大小为9.9 ku,主要以可溶性形式存在;qRT-PCR显示cas2 mRNA在60℃和75℃高表达;生物信息学分析显示cas2基因其完整的ORF全长264 bp,编码88个氨基酸,其中Ile(14)、Ser(14)、Phe(12)含量较高,等电点为9.31,不存在跨膜结构。其蛋白质二级空间结构以α-螺旋、无规则卷曲、β-折叠为主,蛋白互作预测网络显示Cas2与Cas3、Cas5、Cas7等其家族大部分蛋白存在相互作用。进化树分析显示腾冲嗜热厌氧杆菌cas2基因与厌氧菌芽胞杆菌B7M1同源性最高(39.5%)。腾冲嗜热厌氧杆菌cas2编码蛋白是一种亲水性蛋白,在原核系统能高效表达。本研究为嗜热蛋白质的热稳定性机制的研究提供参考。 展开更多
关键词 腾冲嗜热厌氧菌 cas2基因 QRT-PCR 原核表达 生物信息学分析
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腾冲嗜热厌氧菌6-磷酸果糖激酶的克隆、表达及其生物活性 被引量:1
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作者 周传奇 王敬强 +2 位作者 钱忠 马延和 刘斯奇 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期249-254,共6页
6_磷酸果糖激酶(PFK)是糖酵解途径一个关键酶。基于腾冲嗜热厌氧菌基因组中的注释,基因TTE1816可能是PFK的一种,但是,它是否确有生物活性还必须有实验数据的支持。腾冲嗜热厌氧菌在最适温度培养后,提取细菌全蛋白,并采用双向电泳将可溶... 6_磷酸果糖激酶(PFK)是糖酵解途径一个关键酶。基于腾冲嗜热厌氧菌基因组中的注释,基因TTE1816可能是PFK的一种,但是,它是否确有生物活性还必须有实验数据的支持。腾冲嗜热厌氧菌在最适温度培养后,提取细菌全蛋白,并采用双向电泳将可溶性蛋白质分离,然后运用质谱鉴定若干染色斑点。实验表明,TTE1816在高温条件下能够表达蛋白质。将TTE1816基因体外克隆至细菌表达载体,并在BL_21大肠杆菌中表达为可溶性蛋白。酶动力学实验表明,重组蛋白TTE1816具有PFK的催化活性,最适反应温度在60℃。它还能够催化葡萄糖、果糖、甘露糖和6_磷酸葡萄糖的磷酸化反应。另外,在高底物浓度和酶浓度的条件下,TTE1816还表现果糖二磷酸酶的特性。结果证明,TTE1816是腾冲嗜热厌氧菌中PFK家族的一个新成员。 展开更多
关键词 腾冲嗜热厌氧菌 嗜热菌 6-磷酸果糖激酶 糖酵解
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腾冲嗜热厌氧菌耐热解旋酶Tte-uvrD的克隆表达及粗酶的初步应用
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作者 章丽 余以刚 +1 位作者 黄秀丽 肖性龙 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期226-229,235,共5页
以腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)基因组DNA为模版,通过PCR克隆编码解旋酶Tte-uvrD的基因tte-uvrd,将该基因插入原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达载体pET-32a(+)-tte-uvrd,转入E.coli BL21中,经蓝白斑筛选和双... 以腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)基因组DNA为模版,通过PCR克隆编码解旋酶Tte-uvrD的基因tte-uvrd,将该基因插入原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达载体pET-32a(+)-tte-uvrd,转入E.coli BL21中,经蓝白斑筛选和双酶切法筛选阳性重组转化子,挑取测序正确的单个阳性菌落,在IPTG诱导下表达出重组蛋白Tte-uvrD。诱导后的菌体经超声破碎和离心,上清液用硫酸铵沉淀法初步纯化,透析除盐,冻干复溶后得到粗酶液。用tHDA反应来验证Tte-uvrD粗酶液的活性,比较不同储存温度下粗酶液酶活保持的时间,并比较-20℃下储存两个月的粗酶液与商品化纯酶的tHDA反应灵敏度。结果表明,用本研究建立的克隆方法可成功克隆出耐热解旋酶TteuvrD,其粗酶液能用于tHDA反应,说明粗酶液具有解旋活性;粗酶液在-20℃下第80d酶活仍能保持稳定,4℃下则只能保持酶活约一周;-20℃下储存两个月的粗酶液能达到与商品化纯酶相当的灵敏度。 展开更多
关键词 腾冲嗜热厌氧菌 Tte-uvrD 克隆表达 粗酶 tHDA
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泉生热袍菌结构基因组的选靶研究
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作者 裴剑锋 来鲁华 《物理化学学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第5期499-503,共5页
对泉生热袍菌进行了结构基因组的选靶研究,从泉生热袍菌的蛋白组中挑选了20个蛋白质作为第一批进行结构测定的目标,以发现新的蛋白质折叠模式.选靶研究主要使用了BLAST搜索,PSI-BLAST搜索和ProtoNet数据库搜索等方法.另外,还用PredictPr... 对泉生热袍菌进行了结构基因组的选靶研究,从泉生热袍菌的蛋白组中挑选了20个蛋白质作为第一批进行结构测定的目标,以发现新的蛋白质折叠模式.选靶研究主要使用了BLAST搜索,PSI-BLAST搜索和ProtoNet数据库搜索等方法.另外,还用PredictProtein程序对选中的蛋白质进行了二级结构和外形预测.选中的20个蛋白质中有8个被克隆、表达和纯化,其中2个得到了单晶并收集了X衍射数据.实验结果和最近一些文献报道的结果表明,挑选的一些蛋白质具有新的折叠模式,表明了这种选靶策略的有效性. 展开更多
关键词 泉生热袍菌 结构基因组 选靶 蛋白质结构 BLAST PSI-BLAST ProtoNet
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腾冲嗜热厌氧菌的超氧化物歧化酶的进化踪迹分析
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作者 刘元东 刘楚干 +1 位作者 丁建南 邱冠周 《湖南师范大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2007年第4期110-113,共4页
通过同源模建和分子动力学模拟,一个由腾冲嗜热厌氧菌的sod基因编码的蛋白质的可靠的分子结构被建立.对建立的结构进行进化踪迹分析识别出了11个踪迹残基.在它们当中,残基Asn36,Gly101和Glu158的位置遍布整个结构,无规可循;其余的残基... 通过同源模建和分子动力学模拟,一个由腾冲嗜热厌氧菌的sod基因编码的蛋白质的可靠的分子结构被建立.对建立的结构进行进化踪迹分析识别出了11个踪迹残基.在它们当中,残基Asn36,Gly101和Glu158的位置遍布整个结构,无规可循;其余的残基都明显地聚于一个靠近铁原子的子类当中.这些结果表明,该基因编码含铁的超氧化物歧化酶;同时,那些铁原子附近的踪迹残基跟铁的绑定和催化功能直接相关. 展开更多
关键词 超氧化物歧化酶 腾冲嗜热厌氧菌 同源建模 进化踪迹分析 分子动力学
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腾冲嗜热厌氧菌新型变旋酶的表达、纯化及晶体分析
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作者 武岚 钱忠 +2 位作者 付俊 缪时英 王琳芳 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期696-701,共6页
目的纯化腾冲嗜热厌氧菌新型变旋酶TTE1925,用于晶体生长和三维结构分析。方法将tte1925基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,将菌落PCR和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL21(DE 3)后获得表达菌株。该菌株经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷... 目的纯化腾冲嗜热厌氧菌新型变旋酶TTE1925,用于晶体生长和三维结构分析。方法将tte1925基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,将菌落PCR和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL21(DE 3)后获得表达菌株。该菌株经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导高效表达出带有谷胱甘肽S转移酶标签的可溶性融合蛋白,经过GlutathioneSepharoseTM4B亲和层析、Resource Q 6 mL离子交换层析和10/300 superdex 200分子筛层析纯化后,得到目的蛋白TTE1925。结果纯化后蛋白的纯度达到99%以上。蛋白采用悬滴气相扩散法得到衍射至1.9的棒状晶体。结论成功制备了高纯度TTE1925蛋白,获得TTE1925蛋白质晶体,为进一步解析变旋酶的三维结构及其生物学功能分子机制研究奠定了基础。 展开更多
关键词 腾冲菌 TTE1925 半乳糖变旋酶 原核表达 蛋白质纯化 结晶
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分子动力学模拟极端嗜热核糖结合蛋白的热力学稳定性 被引量:1
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作者 冯献礼 赵熹 +3 位作者 于辉 王乙博 孙铁东 黄旭日 《化学学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2012年第5期606-610,共5页
采用分子动力学模拟方法研究极端嗜热性核糖结合蛋白(tteRBP)的嗜热机理.在常温(300 K)和最佳活性温度(375 K)时,分别对tteRBP分子进行动力学模拟,结果表明,整体分子均保持结构稳定,但分子内部的协调运动不同.在375 K时蛋白整体柔性显... 采用分子动力学模拟方法研究极端嗜热性核糖结合蛋白(tteRBP)的嗜热机理.在常温(300 K)和最佳活性温度(375 K)时,分别对tteRBP分子进行动力学模拟,结果表明,整体分子均保持结构稳定,但分子内部的协调运动不同.在375 K时蛋白整体柔性显著提高,使分子能够局部调整构象以适应极端高温.蛋白结构变化的分析也确认了高温时构象局部微调对蛋白极端高温稳定性的关键作用. 展开更多
关键词 tteRBP(thermoanaerobacter tengcongensis RIBOSE BINDING protein) 分子动力学 分子内部协调运动 柔性 极端嗜热
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