作者研究了破伤风毒素及其 AB 片段对金鱼和小鼠的毒力,发现16ng 的毒素即可使金鱼麻痹和死亡;26μg 的 AB 片段即可使小鼠麻痹和死亡,而对金鱼却无作用。当抗 C 或 AB 片段的抗体与毒素结合后,可阻断毒素对金鱼的致麻痹作用。上述结果...作者研究了破伤风毒素及其 AB 片段对金鱼和小鼠的毒力,发现16ng 的毒素即可使金鱼麻痹和死亡;26μg 的 AB 片段即可使小鼠麻痹和死亡,而对金鱼却无作用。当抗 C 或 AB 片段的抗体与毒素结合后,可阻断毒素对金鱼的致麻痹作用。上述结果表明,破伤风毒素可作用于金鱼的外周神经系统,而 AB 片段则不能。毒素与其受体结合是毒素对金鱼作用所必需的。展开更多
目的比较研究Up and Down法与寇氏法测定破伤风毒素LD50值。方法 NIH小鼠皮下注射破伤风毒素,分别使用寇氏法和Up and Down法计算LD50值。结果同一破伤风毒素经寇氏法计算得LD50值为4.97ng/Kg体重,Up and Down法计算LD50值为4.93 ng/Kg...目的比较研究Up and Down法与寇氏法测定破伤风毒素LD50值。方法 NIH小鼠皮下注射破伤风毒素,分别使用寇氏法和Up and Down法计算LD50值。结果同一破伤风毒素经寇氏法计算得LD50值为4.97ng/Kg体重,Up and Down法计算LD50值为4.93 ng/Kg体重,95%置信区间为(4.71～5.13)ng/Kg体重。结论应用Up and Down法可测出与寇氏法相同结果的LD50值,且动物使用数量仅用8只。展开更多
目的建立大肠杆菌表达的重组破伤风毒素C片段(Tetanus toxin C fragment,TTc)的纯化工艺,并检测其免疫原性。方法取超声破碎后的重组菌上清,经硫酸铵沉淀、Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析和DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析...目的建立大肠杆菌表达的重组破伤风毒素C片段(Tetanus toxin C fragment,TTc)的纯化工艺,并检测其免疫原性。方法取超声破碎后的重组菌上清,经硫酸铵沉淀、Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析和DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析后,经腹腔免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清抗体水平。结果经3步纯化,目的蛋白纯度达96.7%;经还原及非还原SDS-PAGE分析蛋白条带一致,相对分子质量约为50 000,不含多聚体,为单体蛋白;纯化的TTc可刺激小鼠产生免疫应答,但血清抗体水平显著低于破伤风类毒素组(P<0.05)。结论已建立了大肠杆菌表达的重组TTc的纯化工艺,纯化的TTc对小鼠具有免疫原性。展开更多
目的对抗破伤风毒素单克隆抗体细胞培养基进行筛选与优化。方法首先通过评估多种商业无血清培养基中抗破伤风毒素单克隆抗体工程细胞株CHO-K1-G2的生长及代谢参数,筛选出一种进行组分优化的基础培养基;再利用试验设计(Design of Experim...目的对抗破伤风毒素单克隆抗体细胞培养基进行筛选与优化。方法首先通过评估多种商业无血清培养基中抗破伤风毒素单克隆抗体工程细胞株CHO-K1-G2的生长及代谢参数,筛选出一种进行组分优化的基础培养基;再利用试验设计(Design of Experiments,DOE)的方法从23种培养基添加物中筛选出能够显著促进细胞蛋白表达量的物质;最后用筛选出的基础培养基进行扩大培养,亲和纯化后获得目的蛋白,并对蛋白质性质进行初步分析。结果最终确定2号培养基作为后续优化的基础培养基;6种物质可作为培养基添加物,按照影响作用大小依次为次黄嘌呤、牛磺酸、乙醇胺、卵磷脂、柠檬酸铁和天冬氨酸。细胞表达量最优拟合值为238.22 mg/L。扩大培养后所得抗体效价为500 IU/mg,亲和常数为1.33×10^(-9)/M。结论建立了一种可促进CHO-K1-G2细胞株生长及抗体表达的"个性化培养基",为最终建立经济高效的抗体药物生产工艺奠定了基础。展开更多
目的探讨不同培养基对抗破伤风毒素人源单抗工程细胞株生长状态及抗体关键质量属性的影响,筛选出适应抗破伤风毒素人源单抗工程细胞株的培养基。方法选取Growth A、Dynamis、T543种商用培养基,采用Fed-batch培养模式培养,观察活细胞密...目的探讨不同培养基对抗破伤风毒素人源单抗工程细胞株生长状态及抗体关键质量属性的影响,筛选出适应抗破伤风毒素人源单抗工程细胞株的培养基。方法选取Growth A、Dynamis、T543种商用培养基,采用Fed-batch培养模式培养,观察活细胞密度及细胞活率;并通过SEC-HPLC和CE-SDS分析抗体纯度、cIEF法分析pI及电荷异构体。结果Growth A medium培养的细胞活细胞密度最高,细胞活率在Dynamis medium和T54 medium之间;Growth A medium培养的细胞抗体纯度最高;3种培养基培养的细胞抗体pI差异不明显;Growth A medium培养的细胞抗体电荷变异体酸性峰数量和占比均少于其他两种培养基,主峰占比在其他两种培养基之间。结论Growth A medium较适合抗破伤风毒素人源单抗工程细胞株的培养。展开更多
目的 优化重组破伤风毒素重链片段C (recombinant tetanus toxin heavy chain fragment C,rTTHc)蛋白的原核表达条件。方法 将密码子优化后的rTTHc基因片段分别插入原核表达载体pET30a、低温表达载体pColdⅡ和高温诱导表达载体pBV220中...目的 优化重组破伤风毒素重链片段C (recombinant tetanus toxin heavy chain fragment C,rTTHc)蛋白的原核表达条件。方法 将密码子优化后的rTTHc基因片段分别插入原核表达载体pET30a、低温表达载体pColdⅡ和高温诱导表达载体pBV220中,构建重组表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以表达量及可溶性为检测指标,比较不同温度条件下rTTHC蛋白的表达情况。结果 42℃诱导4 h pBV220-rTTHc表达量较低,蛋白可溶性较差;37℃诱导4h pET30a-rTTHc表达量与15℃诱导8 h pCold-rTTHc表达量相当,但可溶性表达略低于pCold-rTTHc。28℃诱导4 h,pET30a-rTTHc可获得高表达量和高可溶性表达,且表达周期短。结论 pET30a-rTTHc在28℃经2mg/mL IPTG诱导可高效表达rTTHc蛋白。展开更多
目的用离子交换+疏水层析法代替传统的盐析沉淀技术制备高纯度精制破伤风毒素。方法破伤风毒素浓缩液经Q Sepharose Fast Flow(QFF)离子交换层析去除杂蛋白,将收集到目标蛋白破伤风毒素经2.0 mol/L硫酸铵-磷酸盐缓冲液等量稀释后,再用Ph...目的用离子交换+疏水层析法代替传统的盐析沉淀技术制备高纯度精制破伤风毒素。方法破伤风毒素浓缩液经Q Sepharose Fast Flow(QFF)离子交换层析去除杂蛋白,将收集到目标蛋白破伤风毒素经2.0 mol/L硫酸铵-磷酸盐缓冲液等量稀释后,再用Phenyl Sepharose^(TM)6 Fast Flow(high sub)疏水层析去除大部分杂质及色素制得纯度较高的精制破伤风毒素。结果用离子交换+疏水层析法纯化破伤风毒素实验重复3次,精制破伤风毒素絮状单位平均值达到3600 Lf/mL,纯度平均值为100%,精制破伤风毒素的特异蛋白条带相对分子质量分别在148000~153000、98000~103000、53000~57000范围内。与盐析法相比,离子交换+疏水层析法各项指标均有较大提高。结论离子交换+疏水层析法能有效、稳定地制备符合要求的精制破伤风毒素。在破伤风毒素的纯化中,离子交换+疏水层析法可取代传统的盐析沉淀技术。展开更多
文摘作者研究了破伤风毒素及其 AB 片段对金鱼和小鼠的毒力,发现16ng 的毒素即可使金鱼麻痹和死亡;26μg 的 AB 片段即可使小鼠麻痹和死亡,而对金鱼却无作用。当抗 C 或 AB 片段的抗体与毒素结合后,可阻断毒素对金鱼的致麻痹作用。上述结果表明,破伤风毒素可作用于金鱼的外周神经系统,而 AB 片段则不能。毒素与其受体结合是毒素对金鱼作用所必需的。
文摘目的比较研究Up and Down法与寇氏法测定破伤风毒素LD50值。方法 NIH小鼠皮下注射破伤风毒素,分别使用寇氏法和Up and Down法计算LD50值。结果同一破伤风毒素经寇氏法计算得LD50值为4.97ng/Kg体重,Up and Down法计算LD50值为4.93 ng/Kg体重,95%置信区间为(4.71～5.13)ng/Kg体重。结论应用Up and Down法可测出与寇氏法相同结果的LD50值,且动物使用数量仅用8只。
文摘目的建立大肠杆菌表达的重组破伤风毒素C片段(Tetanus toxin C fragment,TTc)的纯化工艺,并检测其免疫原性。方法取超声破碎后的重组菌上清,经硫酸铵沉淀、Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析和DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析后,经腹腔免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清抗体水平。结果经3步纯化,目的蛋白纯度达96.7%;经还原及非还原SDS-PAGE分析蛋白条带一致,相对分子质量约为50 000,不含多聚体,为单体蛋白;纯化的TTc可刺激小鼠产生免疫应答,但血清抗体水平显著低于破伤风类毒素组(P<0.05)。结论已建立了大肠杆菌表达的重组TTc的纯化工艺,纯化的TTc对小鼠具有免疫原性。
文摘目的对抗破伤风毒素单克隆抗体细胞培养基进行筛选与优化。方法首先通过评估多种商业无血清培养基中抗破伤风毒素单克隆抗体工程细胞株CHO-K1-G2的生长及代谢参数,筛选出一种进行组分优化的基础培养基;再利用试验设计(Design of Experiments,DOE)的方法从23种培养基添加物中筛选出能够显著促进细胞蛋白表达量的物质;最后用筛选出的基础培养基进行扩大培养,亲和纯化后获得目的蛋白,并对蛋白质性质进行初步分析。结果最终确定2号培养基作为后续优化的基础培养基;6种物质可作为培养基添加物,按照影响作用大小依次为次黄嘌呤、牛磺酸、乙醇胺、卵磷脂、柠檬酸铁和天冬氨酸。细胞表达量最优拟合值为238.22 mg/L。扩大培养后所得抗体效价为500 IU/mg,亲和常数为1.33×10^(-9)/M。结论建立了一种可促进CHO-K1-G2细胞株生长及抗体表达的"个性化培养基",为最终建立经济高效的抗体药物生产工艺奠定了基础。
文摘目的探讨不同培养基对抗破伤风毒素人源单抗工程细胞株生长状态及抗体关键质量属性的影响,筛选出适应抗破伤风毒素人源单抗工程细胞株的培养基。方法选取Growth A、Dynamis、T543种商用培养基,采用Fed-batch培养模式培养,观察活细胞密度及细胞活率;并通过SEC-HPLC和CE-SDS分析抗体纯度、cIEF法分析pI及电荷异构体。结果Growth A medium培养的细胞活细胞密度最高,细胞活率在Dynamis medium和T54 medium之间;Growth A medium培养的细胞抗体纯度最高;3种培养基培养的细胞抗体pI差异不明显;Growth A medium培养的细胞抗体电荷变异体酸性峰数量和占比均少于其他两种培养基,主峰占比在其他两种培养基之间。结论Growth A medium较适合抗破伤风毒素人源单抗工程细胞株的培养。
文摘目的 优化重组破伤风毒素重链片段C (recombinant tetanus toxin heavy chain fragment C,rTTHc)蛋白的原核表达条件。方法 将密码子优化后的rTTHc基因片段分别插入原核表达载体pET30a、低温表达载体pColdⅡ和高温诱导表达载体pBV220中,构建重组表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以表达量及可溶性为检测指标,比较不同温度条件下rTTHC蛋白的表达情况。结果 42℃诱导4 h pBV220-rTTHc表达量较低,蛋白可溶性较差;37℃诱导4h pET30a-rTTHc表达量与15℃诱导8 h pCold-rTTHc表达量相当,但可溶性表达略低于pCold-rTTHc。28℃诱导4 h,pET30a-rTTHc可获得高表达量和高可溶性表达,且表达周期短。结论 pET30a-rTTHc在28℃经2mg/mL IPTG诱导可高效表达rTTHc蛋白。
文摘目的用离子交换+疏水层析法代替传统的盐析沉淀技术制备高纯度精制破伤风毒素。方法破伤风毒素浓缩液经Q Sepharose Fast Flow(QFF)离子交换层析去除杂蛋白,将收集到目标蛋白破伤风毒素经2.0 mol/L硫酸铵-磷酸盐缓冲液等量稀释后,再用Phenyl Sepharose^(TM)6 Fast Flow(high sub)疏水层析去除大部分杂质及色素制得纯度较高的精制破伤风毒素。结果用离子交换+疏水层析法纯化破伤风毒素实验重复3次,精制破伤风毒素絮状单位平均值达到3600 Lf/mL,纯度平均值为100%,精制破伤风毒素的特异蛋白条带相对分子质量分别在148000~153000、98000~103000、53000~57000范围内。与盐析法相比,离子交换+疏水层析法各项指标均有较大提高。结论离子交换+疏水层析法能有效、稳定地制备符合要求的精制破伤风毒素。在破伤风毒素的纯化中,离子交换+疏水层析法可取代传统的盐析沉淀技术。
