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CX26/CX32缝隙连接蛋白的Tet-onHeLa细胞模型的建立及鉴定 被引量：3
1
作者 杨燕 吴穷 +4 位作者 郑荣生 汪子书 王俊斌 汪蕊 陶亮 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2013年第9期1079-1084,共6页
目的体外建立一种特异性快速有效观察药物对细胞缝隙连接(GJ)作用的特异性细胞模型,为发现作用于GJ的药物以及GJ的特异性研究提供一种有力的技术手段。方法构建同时双向表达2种不同连接蛋白(CXs)的质粒;用表达CX26/CX32的质粒转染Tet-on... 目的体外建立一种特异性快速有效观察药物对细胞缝隙连接(GJ)作用的特异性细胞模型,为发现作用于GJ的药物以及GJ的特异性研究提供一种有力的技术手段。方法构建同时双向表达2种不同连接蛋白(CXs)的质粒;用表达CX26/CX32的质粒转染Tet-on HeLa细胞,建立稳定表达CX26/CX32并形成异质性GJ的HeLa细胞模型。设置多西环素(Dox)(1μg/mL)处理组和未处理组,分别用RT-PCR和Western blot法检测细胞CX26 mRNA和蛋白质表达;细胞接种荧光示踪法检测细胞GJ功能;丽丝胺罗丹明B(SRB)法检测细胞的增殖。在上述细胞模型上,用GJ抑制剂2-氨基乙酯二苯基硼酸(2-APB)和GJ激活剂维甲酸(RA)干预。结果 HeLa细胞无内源性CX的表达,Dox可诱导Tet-on HeLa细胞CX26 mRNA和蛋白质表达,并且被诱导表达的CX可形成有效的GJ。2-APB(50μmol/L)减少稳定表达CX26/CX32的HeLa细胞间的荧光传递数目,GJ抑制率为51.3%(P<0.01);RA(10μmol/L)增多细胞间的荧光传递数目,GJ增强率为60.3%(P<0.01)。结论成功建立Dox调控的、稳定表达CX26/CX32的Tet-on HeLa细胞模型,为寻找可调节GJ功能的药物、观察药物对GJ的特异性作用提供了有力的实验手段。 展开更多
关键词 细胞缝隙连接 CX26 CX32 tet—on调控系统 HELA细胞 诱导表达
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四环素调控的WT1基因表达系统在U937中的建立
2
作者 周箭 陈蓉 魏琴 《四川省卫生管理干部学院学报》 2004年第2期83-84,共2页
目的 :在白血病细胞系U937中建立四环素诱导的WT1基因表达系统。方法 :运用脂质体将质粒pRevTet On、pRevTRE -Luc和pRevTRE WT1分别转染逆转录病毒的包装细胞PT6 7以产生逆转录病毒。将逆转录病毒RevTet On感染U937细胞 ,经G4 18筛选 ... 目的 :在白血病细胞系U937中建立四环素诱导的WT1基因表达系统。方法 :运用脂质体将质粒pRevTet On、pRevTRE -Luc和pRevTRE WT1分别转染逆转录病毒的包装细胞PT6 7以产生逆转录病毒。将逆转录病毒RevTet On感染U937细胞 ,经G4 18筛选 ,产生抗性细胞 ,用有限稀释法将U937/Tet On抗性细胞单克隆化。 14天后 ,克隆逐步形成 ,在显微镜下标记并移出。再将逆转录病毒RevTRE Luc瞬时感染这些克隆 ,培养基中加入强力酶素 (Dox) 2mg/L或不加Dox ,应用荧光素酶报告基因分析试剂盒检测荧光素酶的活性。挑选一株低背景和高诱导倍数的U937/Tet On克隆 ,最后将逆转录病毒RevTRE WT1感染这株克隆。结果 :在U937中建立四环素调控的WT1基因表达系统。结论 :建立逆转录病毒整合的U937细胞株 ,可用四环素及其衍生物精确调控WT1基因的表达 。 展开更多
关键词 四环素调控 基因表达 建立
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可控表达pGH基因转基因小鼠模型的建立与分析
3
作者 张建斌 刘颖 +2 位作者 白立景 牟玉莲 韩俊文 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期1145-1153,共9页
旨在构建整合型可控表达猪生长激素(porcine growth hormone,pGH)基因转基因小鼠模型,通过控制GH的表达时间和表达量来减少GH过早表达产生的副作用,对于培育高饲料转化率大家畜具有重要研究意义。利用本课题组前期成功构建并在PK15细胞... 旨在构建整合型可控表达猪生长激素(porcine growth hormone,pGH)基因转基因小鼠模型,通过控制GH的表达时间和表达量来减少GH过早表达产生的副作用,对于培育高饲料转化率大家畜具有重要研究意义。利用本课题组前期成功构建并在PK15细胞系中验证的整合型诱导表达pGH四环素(Tet-on)载体,通过原核显微注射方法制备转基因小鼠。以Southern blot鉴定为阳性的Founder鼠为基础扩繁培育,对转基因后代鼠3~10周龄通过饮水中添加诱导底物强力霉素(DOX)进行诱导试验;利用RT-qPCR技术检测外源基因表达水平;利用放射性免疫检测方法对小鼠血液中猪生长激素水平进行定量检测,同时称重,评估转入基因对小鼠机体表型的影响。结果表明,转基因小鼠诱导组的体重与转基因小鼠非诱导组和同窝非转基因组小鼠相比显著增大(P<0.05),血清中pGH水平显著上升(P<0.05),说明外源GH有效表达并且调节动物机体的生长。结果提示,该模型的建立有助于深入研究GH对机体发育的影响以及机体中影响GH分泌的分子机制和信号通路,促进GH在家畜生产中的应用,也为制备安全、高效的GH转基因大家畜奠定理论基础。 展开更多
关键词 四环素可控表达系统 pGH基因 转基因小鼠
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