为建立H3亚型犬流感病毒(CIV)荧光定量PCR检测方法,本研究根据H3亚型CIV HA基因的保守区序列,设计合成一对特异性引物和Taq Man MGB探针,经条件优化后初步建立了H3亚型CIV荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,构建的重组质粒标准品在109拷...为建立H3亚型犬流感病毒(CIV)荧光定量PCR检测方法,本研究根据H3亚型CIV HA基因的保守区序列,设计合成一对特异性引物和Taq Man MGB探针,经条件优化后初步建立了H3亚型CIV荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,构建的重组质粒标准品在109拷贝/μL~10^(2)拷贝/μL浓度范围内有良好的线性关系,标准曲线的相关系数为0.999。该方法仅能特异性扩增H3N2亚型CIV核酸,与H3N2亚型禽流感病毒、人流感病毒和猪流感病毒及H9N2亚型CIV、H1N1亚型猪流感病毒、犬腺病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬冠状病毒等病毒核酸均无交叉反应。该方法最低可检测到的质粒标准品浓度为19拷贝/μL,敏感性高于普通PCR方法。组内与组间重复性试验的变异系数均小于1%。利用该方法对83份临床样品的核酸进行检测,检测结果与病毒分离结果总符合率为97.59%。本研究建立的荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好、操作简便,为临床H3亚型CIV的快速检测提供可靠方法。展开更多
目的对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行适用性验证及应用。方法对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行特异性、灵敏度、精密性、准确性验证,并应用该方法检测3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液...目的对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行适用性验证及应用。方法对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行特异性、灵敏度、精密性、准确性验证,并应用该方法检测3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液、纯化液和原液中Vero细胞残余DNA含量,计算Vero细胞残余DNA去除率。结果 Taq Man MGB探针实时定量PCR能够特异性扩增Vero细胞基因组DNA长串连重复序列;DNA浓度在10-1~10-6 ng/μl范围内标准曲线线性良好,相关系数为0.996,扩增效率为93.54%;检测灵敏度为10-6 ng/μl,高于斑点杂交法;检测高（10-2 ng/μl）、中（10-4 ng/μl）、低（10-6 ng/μl）浓度阳性对照DNA模板的试验内变异系数（CV）为0.145%~3.110%,试验间CV为0.624%~2.359%;检测不同浓度阳性对照DNA的回收率在101.5%~109.4%之间,均在定量方法可接受的回收率范围内;在斑点杂交检测灵敏度范围内,同一样品采用Taq Man MGB探针实时定量PCR法与斑点杂交法半定量检测的结果吻合。3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液纯化后可有效去除Vero细胞残余DNA,总去除率约为100%。结论 Taq Man探针实时定量PCR法特异性、精密性、准确性良好,灵敏度高,可作为斑点杂交法的替代方法,用于实验室内部的质量控制。展开更多
文摘为建立H3亚型犬流感病毒(CIV)荧光定量PCR检测方法,本研究根据H3亚型CIV HA基因的保守区序列,设计合成一对特异性引物和Taq Man MGB探针,经条件优化后初步建立了H3亚型CIV荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,构建的重组质粒标准品在109拷贝/μL~10^(2)拷贝/μL浓度范围内有良好的线性关系,标准曲线的相关系数为0.999。该方法仅能特异性扩增H3N2亚型CIV核酸,与H3N2亚型禽流感病毒、人流感病毒和猪流感病毒及H9N2亚型CIV、H1N1亚型猪流感病毒、犬腺病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬冠状病毒等病毒核酸均无交叉反应。该方法最低可检测到的质粒标准品浓度为19拷贝/μL,敏感性高于普通PCR方法。组内与组间重复性试验的变异系数均小于1%。利用该方法对83份临床样品的核酸进行检测,检测结果与病毒分离结果总符合率为97.59%。本研究建立的荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好、操作简便,为临床H3亚型CIV的快速检测提供可靠方法。
文摘目的对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行适用性验证及应用。方法对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行特异性、灵敏度、精密性、准确性验证,并应用该方法检测3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液、纯化液和原液中Vero细胞残余DNA含量,计算Vero细胞残余DNA去除率。结果 Taq Man MGB探针实时定量PCR能够特异性扩增Vero细胞基因组DNA长串连重复序列;DNA浓度在10-1~10-6 ng/μl范围内标准曲线线性良好,相关系数为0.996,扩增效率为93.54%;检测灵敏度为10-6 ng/μl,高于斑点杂交法;检测高（10-2 ng/μl）、中（10-4 ng/μl）、低（10-6 ng/μl）浓度阳性对照DNA模板的试验内变异系数（CV）为0.145%~3.110%,试验间CV为0.624%~2.359%;检测不同浓度阳性对照DNA的回收率在101.5%~109.4%之间,均在定量方法可接受的回收率范围内;在斑点杂交检测灵敏度范围内,同一样品采用Taq Man MGB探针实时定量PCR法与斑点杂交法半定量检测的结果吻合。3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液纯化后可有效去除Vero细胞残余DNA,总去除率约为100%。结论 Taq Man探针实时定量PCR法特异性、精密性、准确性良好,灵敏度高,可作为斑点杂交法的替代方法,用于实验室内部的质量控制。
