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利用Site-Finding PCR克隆琼胶酶基因 被引量：4
1
作者 刘丹 邢培川 +1 位作者 于文功 路新枝 《现代生物医学进展》 CAS 2013年第1期5-10,共6页
目的:新型琼胶酶基因的筛选。方法:根据α-琼胶酶基因序列的同源性,设计了兼并引物,利用兼并PCR对所筛选到的琼胶酶产生菌株进行筛选,阳性菌株进行16s rDNA序列测定并构建了进化树。利用染色体步移技术Site-finding PCR获得目的基因的... 目的:新型琼胶酶基因的筛选。方法:根据α-琼胶酶基因序列的同源性,设计了兼并引物,利用兼并PCR对所筛选到的琼胶酶产生菌株进行筛选,阳性菌株进行16s rDNA序列测定并构建了进化树。利用染色体步移技术Site-finding PCR获得目的基因的上下游序列,经过拼接获得全长的目的基因序列,并利用Blast对其进行分析。将目的基因插入pET 24a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),利用平板水解圈初步鉴定了重组酶的性质,并利用DNS法检测了重组酶发酵上清液的酶活。结果:获得了一株疑似α-琼胶酶产生菌株,16s rDNA序列鉴定显示为Thalassomonas sp.,命名为Thalassomonas sp.LD5。获得了一个新的基因,命名为agaD。agaD开放阅读框长4401 bp,编码1466个氨基酸,理论分子量为158.8kDa。序列分析表明,agaD编码的蛋白AgaD与已有的两种α-琼胶酶的相似性分别为89%和77%。重组AgaD经诱导后可以直接降解琼胶平板产生水解圈,其发酵上清液酶活为0.2 U.ml-1,说明该蛋白为琼胶酶。结论:采用分子克隆技术分离出新的琼胶酶基因,该基因的发现为活性寡糖的制备提供了新的工具。 展开更多
关键词 α-琼胶酶 单胞菌Thalassomonas sitefinding pcr 兼并pcr
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1型鸭疫里默氏杆菌铁依赖抑制子RaDtxR全长基因的扩增及生物信息学分析 被引量：2
2
作者 向蓉 岳磊 +4 位作者 李林林 孙敏华 董嘉文 胡奇林 袁建丰 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第23期133-137,共5页
为了扩增1型鸭疫里默氏杆菌铁依赖抑制子基因(RaDtxR)全长序列,对SiteFing-PCR技术做了改良。改良后的SiteFinding-PCR技术更加简单、方便且省时。SiteFinding-PCR结果显示,获得的目的片段大小为937 bp,向前延伸了710 bp。RaDtxR全长基... 为了扩增1型鸭疫里默氏杆菌铁依赖抑制子基因(RaDtxR)全长序列,对SiteFing-PCR技术做了改良。改良后的SiteFinding-PCR技术更加简单、方便且省时。SiteFinding-PCR结果显示,获得的目的片段大小为937 bp,向前延伸了710 bp。RaDtxR全长基因序列为654个核苷酸,编码217个氨基酸。生物信息学表明,RaDtxR包含完整的铁离子依赖抑制子超家族保守结构域,在进化分类上更接近于白喉棒状杆菌毒素抑制子DtxR。同源建模表明,RaDtxR氨基酸序列含有典型的FUR/DtxR抑制子的HTH结构。 展开更多
关键词 1型鸭疫里默氏杆菌 铁依赖抑制子 sitefinding—pcr 生物信息学分析
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