抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备及单链抗体基因的构建 被引量：3

1

作者 胡春华 龙桂友 +4 位作者 戴素明 马先锋 谢玉明 李娜 邓子牛 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期884-890,共7页

【目的】制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体并构建其单链抗体(single chain variable fragment,ScFv)基因,为从PthA角度进一步研究柑橘溃疡病致病机理创造条件,并为构建单链抗体基因植物表达载体,尝试利用转基因和植物抗体技术创制抗溃疡病... 【目的】制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体并构建其单链抗体(single chain variable fragment,ScFv)基因,为从PthA角度进一步研究柑橘溃疡病致病机理创造条件,并为构建单链抗体基因植物表达载体,尝试利用转基因和植物抗体技术创制抗溃疡病柑橘新种质奠定基础。【方法】利用PthA-NLS重组多肽免疫Balb/c小鼠,制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体,从分泌抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR和重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)法构建其单链抗体基因,并克隆到pGEM-T载体和原核表达载体pET32a(+)中,重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。【结果】获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株1C8H1、2D12B6、3D8A10。成功构建了单链抗体基因ScFv,获得的ScFv基因大小约750bp,其中重链可变区(VH)基因有360bp,轻链可变区(VL)基因有342bp,中间连接肽基因45bp,经过IPTG诱导ScFv原核表达,获得了大小为44.5kD的ScFv重组蛋白。【结论】试验获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株,成功构建了ScFv基因,并实现了原核表达,为进一步探索PthA的致病机理和下一步利用抗体技术获得抗溃疡病柑橘种质[0]的研究打下了基础。 展开更多

关键词 柑橘溃疡病 单克隆抗体 单链抗体 pthA基因

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重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的构建、表达及其活性鉴定 被引量：2

2

作者 任君琳 王涛 +5 位作者 许彦鸣 孟艳玲 温伟红 张瑞 张巍 杨安钢 《第四军医大学学报》 北大核心 2007年第3期193-196,共4页

目的:构建重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的表达载体,转染SGC7901胃癌细胞后观察其促凋亡作用.方法:采用重组PCR法,将抗HER2的单链抗体(e23sFv)通过白喉毒素的Furin识别位点的编码序列(FDT)与人重构型caspase-6(RC6)基因重组,构建... 目的:构建重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的表达载体,转染SGC7901胃癌细胞后观察其促凋亡作用.方法:采用重组PCR法,将抗HER2的单链抗体(e23sFv)通过白喉毒素的Furin识别位点的编码序列(FDT)与人重构型caspase-6(RC6)基因重组,构建融合蛋白表达基因e23sFv-FDT-RC6.将所获得的重组基因克隆入真核表达载体pCMV,以脂质体法瞬时转染HER2阳性的SGC7901细胞和HER2阴性的HeLa细胞.MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况.间接免疫荧光染色观察目的基因的表达对SGC7901细胞的促凋亡作用.结果:把e23sFv-RC6,e23sFv-FDT-RC6基因克隆入真核表达载体pCMV,酶切鉴定和基因测序证明目的基因序列正确.转染SGC7901和HeLa细胞后,Western Blot检测到目的蛋白的表达.MTT实验观察到转染pCMV-e23sFv-FDT-RC6的SGC7901细胞的增殖被明显抑制,间接免疫荧光染色可以观察到表达e23sFv-FDT-RC6融合蛋白的SGC7901细胞形态发生改变,部分细胞呈现典型凋亡特征.结论:重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的表达可促进HER2阳性SGC7901胃癌细胞的凋亡. 展开更多

关键词 scfv抗体 caspase-6基因 细胞凋亡

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利用噬菌体展示技术淘选草鱼呼肠孤病毒的单链抗体 被引量：3

3

作者 张凤 李周全 +6 位作者 闫利明 罗绍祥 钟利桥 张晓华 袁丽 方勤 戴和平 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期430-437,共8页

草鱼呼肠孤病毒(GCRV)是引起我国大面积草鱼幼鱼出血病暴发的主要病原,其外衣壳蛋白VP5和VP7在病毒入侵宿主细胞过程中起着至关重要的作用。研究以原核表达的VP7、全长VP5、VP5的N端片段及C端片段为靶蛋白,利用已构建的噬菌体展示单链... 草鱼呼肠孤病毒(GCRV)是引起我国大面积草鱼幼鱼出血病暴发的主要病原,其外衣壳蛋白VP5和VP7在病毒入侵宿主细胞过程中起着至关重要的作用。研究以原核表达的VP7、全长VP5、VP5的N端片段及C端片段为靶蛋白,利用已构建的噬菌体展示单链抗体文库进行淘选。经过3轮淘选后,共获得7个针对VP7、VP5、VP5N和VP5C的单链抗体。经过验证,识别原核表达的VP7的两个单链抗体能够成功识别天然GCRV病毒。此结果对于进一步研究GCRV与宿主细胞的相互作用机理奠定了基础。 展开更多

关键词 草鱼呼肠孤病毒 VP5 VP7 噬菌体展示 单链抗体

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高通量表达系统在EV71单链抗体表达中的应用 被引量：1

4

作者 余秋凡 陶焱炀 +3 位作者 李靖欣 王圆媛 张黎 朱凤才 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2019年第6期641-645,共5页

目的 建立从PCR产物直接表达ScFv抗体的方法,将该方法用于噬菌体抗体库淘选后ScFv抗体的高通量表达。方法 PCR扩增CMV启动子、ScFv和BGH Poly A尾基因片段,使用重叠PCR(overlapping PCR)将上述3个片段依次连接成1个线性的抗体表达盒。... 目的 建立从PCR产物直接表达ScFv抗体的方法,将该方法用于噬菌体抗体库淘选后ScFv抗体的高通量表达。方法 PCR扩增CMV启动子、ScFv和BGH Poly A尾基因片段,使用重叠PCR(overlapping PCR)将上述3个片段依次连接成1个线性的抗体表达盒。瞬时转染293T细胞,并用Western blot、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和间接免疫荧光抗体试验(indirect immunofluorescent antibody,IFA)检测抗体表达盒中ScFv的表达和抗体的活性。从噬菌体库淘选出的阳性克隆中挑取96个抗体,用该表达盒进行高通量表达,并对表达效果进行评价。结果 成功扩增出3个基因片段,并将3个片段连接成1个线性的表达盒。线性表达盒可直接在293T细胞中瞬时表达,表达上清经Western blot检测可见约相对分子质量为38×103的条带;ELISA和IFA结果均显示表达出来的ScFv抗体能与其对应的抗原特异性结合。同时该系统可以用于噬菌体抗体库中抗体基因的高通量表达。结论 成功构建了ScFv的线型表达盒,并实现了抗体的快速高通量表达。 展开更多

关键词 scfv抗体 抗体表达盒 重叠PCR 高通量表达

原文传递

从人源大容量天然抗体库中筛选到抗禽流感病毒H5N1单链抗体 被引量：2

5

作者 孙丽娜 于礼 +3 位作者 张黎 李川 李德新 梁米芳 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期86-90,共5页

目的从人源大容量天然抗体库中筛选到抗禽流感病毒H5N1单链抗体。方法运用噬菌体表面呈现技术,用纯化的H5N1禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/2005)对人源大容量天然抗体库进行富集筛选,对获得的阳性克隆进行序列分析,并将其克隆入携带人... 目的从人源大容量天然抗体库中筛选到抗禽流感病毒H5N1单链抗体。方法运用噬菌体表面呈现技术,用纯化的H5N1禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/2005)对人源大容量天然抗体库进行富集筛选,对获得的阳性克隆进行序列分析,并将其克隆入携带人源Fc段的表达载体,实现scFv-Fc融合抗体的分泌型表达。用ELISA、IFA对所获人源单抗的功能特性进行鉴定。结果经过3轮富集筛选,共获得了82株特异性结合H5N1禽流感病毒HA的人源scFv单链抗体,分别属于5个不同的抗体序列,ELISA、IFA表明从抗体库筛选获得的5株人源单抗与禽流感病毒H5N1及其HA具有较好的特异性,而与甲1型和甲3型人流感病毒无交叉反应。结论从人源大容量天然抗体库中利用高通量的筛选策略在短时间内获得抗禽流感病毒H5N1人源单抗,对于禽流感的紧急预防和治疗具有重要意义。 展开更多

关键词 禽流感病毒 噬菌体表面呈现 人源大容量天然抗体库 单链抗体

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全人源抗前列腺癌ScFv抗体的筛选及生物学特性研究 被引量：1

6

作者 郑桂喜 王传新 +4 位作者 张欣 李伟 杜鲁涛 李娟 刘慧 《山东大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2012年第11期34-38,共5页

目的从已成功建立的前列腺癌噬菌体抗体库中筛选抗人前列腺癌单链抗体(ScFv),并分析其生物学特性。方法以良性前列腺增生(BPH)细胞与噬菌体抗体库共孵育,去除抗体库中能够与BPH细胞结合的噬菌体抗体,再以前列腺癌细胞系DU145与去除非特... 目的从已成功建立的前列腺癌噬菌体抗体库中筛选抗人前列腺癌单链抗体(ScFv),并分析其生物学特性。方法以良性前列腺增生(BPH)细胞与噬菌体抗体库共孵育,去除抗体库中能够与BPH细胞结合的噬菌体抗体,再以前列腺癌细胞系DU145与去除非特异性结合后的噬菌体抗体库共孵育,通过"吸附-洗脱-扩增"对前列腺癌的噬菌体抗体库进行3轮的富集。采用流式细胞术筛选出对人前列腺癌细胞系DU145高亲合力的阳性克隆。阳性噬菌体克隆经亚克隆并转染大肠杆菌TG1,表达出可溶性ScFv抗体。采用流式细胞术、免疫荧光法分析其生物学特性。结果以前列腺癌细胞系DU145为抗原,筛选出19个噬菌体抗体,经测定C11与DU145细胞亲合力最高,亚克隆至原核表达载体表达纯化为C11 ScFv抗体。流式细胞术和免疫荧光法检测结果均显示,C11ScFv抗体与前列腺癌细胞DU145和PC3结合,与BPH细胞不结合。结论通过噬菌体展示技术筛选到前列腺癌细胞系高亲合力的可溶性ScFv抗体,为进一步研究抗体的靶向性治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 噬菌体展示技术 前列腺肿瘤 scfv抗体 BPH细胞 DU145细胞 PC3细胞

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重组抗HER2 ScFv/tbid基因的表达及其对乳腺癌SKBr-3细胞的促凋亡作用 被引量：1

7

作者 王芳 裘秀春 +7 位作者 王立锋 许彦鸣 赵晶 孟艳玲 贾林涛 王成济 范清宇 杨安钢 《第四军医大学学报》 北大核心 2006年第12期1057-1059,共3页

目的:观察构建的重组抗HER2ScFv/tbid基因在SKBr-3细胞中的表达及其对转染的SKBr-3细胞的作用.方法:用限制性内切酶双酶切已构建的pcDNA-bid质粒,获得带有PE转膜结构域和tbid的重组基因,将所获基因插入到真核表达载体pCMV单链抗体基因Sc... 目的:观察构建的重组抗HER2ScFv/tbid基因在SKBr-3细胞中的表达及其对转染的SKBr-3细胞的作用.方法:用限制性内切酶双酶切已构建的pcDNA-bid质粒,获得带有PE转膜结构域和tbid的重组基因,将所获基因插入到真核表达载体pCMV单链抗体基因ScFv23e的下游,转染SKBr-3细胞.间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达,MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况.结果:转染SKBr-3细胞后,检测出目的蛋白的表达.MTT实验发现细胞的增殖被明显抑制.间接免疫荧光双标记染色检测tBid的表达,并可观察到Cytc在细胞质中存在,SKBr-3细胞出现凋亡.结论:重组抗HER2ScFv/tBid分子可以在转染的SKBr-3细胞中表达,并且可抑制转染细胞的生长,诱导细胞发生凋亡. 展开更多

关键词 BID 乳腺肿瘤 细胞凋亡 scfv抗体

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PCV2 Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建及淘选 被引量：1

8

作者 周景明 张秋丽 +5 位作者 张改平 刘红亮 祁艳华 宋瑞雪 耿玥 王爱萍 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第12期1754-1760,共7页

用重组的PCV2Cap蛋白免疫Balb/c小鼠,从免疫小鼠脾细胞中提取总RNA,经反转录后,扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,利用Overlap PCR方法将VH基因和VL基因组装成单链抗体(ScFv)基因,将ScFv基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB-5E中,... 用重组的PCV2Cap蛋白免疫Balb/c小鼠,从免疫小鼠脾细胞中提取总RNA,经反转录后,扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,利用Overlap PCR方法将VH基因和VL基因组装成单链抗体(ScFv)基因,将ScFv基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB-5E中,并将重组载体转化至感受态大肠杆菌TG1中,获得PCV2Cap蛋白的单链抗体文库,经测定抗体库库容为3.58×106。通过辅助噬菌体M13K07拯救,构建鼠源PCV2Cap蛋白的噬菌体单链抗体库。4轮生物淘选后,经ELISA方法检测,最终获得3株能与Cap蛋白特异性结合的噬菌体克隆。 展开更多

关键词 PCV2 CAP蛋白 单链抗体 噬菌体单链抗体库

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与A549细胞相关的旋毛虫抗原蛋白7TR单链抗体的筛选 被引量：2

9

作者 王金鹏 张国利 +4 位作者 张海英 鹿香云 宫鹏涛 李建华 张西臣 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第5期488-493,共6页

目的筛选可与A549细胞相互作用的抗旋毛虫7TR单链抗体。方法 PCR法克隆旋毛虫7TR基因,连接至表达载体p ET-32a,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导后,将表达的7TR蛋白进行复性及亲合层析纯化;以纯化后的旋毛虫7TR蛋白为抗原,筛选Tomlinson(I... 目的筛选可与A549细胞相互作用的抗旋毛虫7TR单链抗体。方法 PCR法克隆旋毛虫7TR基因,连接至表达载体p ET-32a,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导后,将表达的7TR蛋白进行复性及亲合层析纯化;以纯化后的旋毛虫7TR蛋白为抗原,筛选Tomlinson(I+J)人源噬菌体单链抗体库,筛选并纯化阳性抗体,免疫荧光试验检测抗体与A549细胞的结合活性。结果重组表达质粒p ET-32a-7TR经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的旋毛虫7TR蛋白相对分子质量约50 000。共获得2株稳定分泌抗旋毛虫7TR蛋白单链抗体的E.coli HB2151菌株,命名为4C7和8G5;8G5可与重组7TR蛋白发生特异性结合,具有良好的反应原性,也可与A549细胞发生特异性结合。结论筛选出了与A549细胞具有结合活性的抗7TR单链抗体,为后续的临床应用奠定了基础。 展开更多

关键词 旋毛虫 7TR蛋白 A549细胞 单链抗体

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抗DR5单链抗体的构建与表达 被引量：1

10

作者 赵昆朋 柴立辉 马远方 《河南大学学报（医学版）》 CAS 2010年第1期37-39,共3页

目的:构建抗DR5单链抗体的真核表达载体,以实现真核表达。方法:RT-PCR法从分泌抗DR5抗体的杂交瘤细胞中合成第一链cDNA,用通用引物钓取单克隆抗体的轻、重链可变区基因。经测序和BLAST比对,证实为一株新的鼠源性抗体基因。利用overlappi... 目的:构建抗DR5单链抗体的真核表达载体,以实现真核表达。方法:RT-PCR法从分泌抗DR5抗体的杂交瘤细胞中合成第一链cDNA,用通用引物钓取单克隆抗体的轻、重链可变区基因。经测序和BLAST比对,证实为一株新的鼠源性抗体基因。利用overlapping PCR方法构建单链抗体真核表达载体pCMV-express-scFv,Lipofectamine2000法转染宿主细胞293T,72 h后ELISA法检测细胞培养上清,检测抗体表达。结果:经序列鉴定和BLAST比对证实克隆的抗体轻、重链可变区基因为新鼠源抗体基因。ELISA实验结果显示抗体有效表达在细胞培养上清中。结论:成功得到抗体轻、重链可变区基因,实现了抗DR5单链抗体的真核表达,为进一步的研究和开发奠定了基础。 展开更多

关键词 抗DR5单克隆抗体 单链抗体 真核表达

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抗人结肠癌单抗MC5的功能性ScFv在大肠杆菌中的可溶性表达(英文)

11

作者 何凤田 郑英如 +5 位作者 高会广 陈姗 李蓉芬 江渝 彭家和 钟小林 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期1-6,共6页

目的　制备抗人结肠癌单抗MC5的具功能活性的可溶性单链可变区片段 (ScFv)。方法　从分泌MC5的杂交瘤细胞分离mRNA ,RT PCR分别扩增抗体质量、轻链可变区基因 (VH和VLDNA) ,经linkerDNA连接形成ScFvDNA。将ScFvDNA与噬粒载体pCANTAB5E... 目的　制备抗人结肠癌单抗MC5的具功能活性的可溶性单链可变区片段 (ScFv)。方法　从分泌MC5的杂交瘤细胞分离mRNA ,RT PCR分别扩增抗体质量、轻链可变区基因 (VH和VLDNA) ,经linkerDNA连接形成ScFvDNA。将ScFvDNA与噬粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,转化菌经辅助噬菌体M13KO7感染后 ,获得重组噬菌体。以高表达MC5结合抗原的人结肠癌细胞系SW4 80对重组噬菌体进行 2轮筛选后 ,经ELISA筛选呈现抗体ScFv片段的噬菌体单克隆。取 2个强阳性克隆的噬菌体感染大肠杆菌HB2 15 1,用于表达可溶性ScFv。经点印迹和Western印迹对可溶性ScFv进行鉴定 ,经ELISA检测可溶性ScFv的抗原结合活性。结果　所获得的VH、VL和ScFvDNA分别约为 340、32 0和 75 0bp。对重组噬菌体经 2轮亲和筛选后 ,经ELISA从 2 5个克隆中筛检出 10个抗原阳性克隆。源于 2个强阳性克隆的可溶性ScFv的分子质量为32 0 0 0u ,且浓集于细菌周质腔中 ,可溶性ScFv具有抗原结合活性 ,其结合位点与亲本单抗MC5相同。结论　针对MC5的具功能活性的可溶性ScFv的成功制备 ,为人结肠癌的体外 (乃至体内 ) 展开更多

关键词 大肠杆菌 可溶性表达 scfv抗体 结肠癌 噬菌体呈现 原核表达

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病毒性出血性败血症病毒单链抗体的原核表达及其功能鉴定 被引量：1

12

作者 王宏华 侯竹美 +4 位作者 张全启 于海洋 王志刚 齐洁 王旭波 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期128-134,共7页

为制备病毒性出血性败血症病毒(VHSV)单链抗体(single chain variable fragment antibody,ScFv)并鉴定其生物学功能,本研究提取抗VHSV单抗1G5的杂交瘤细胞株总RNA并反转录获得cDNA模板,通过PCR扩增VHSV抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区... 为制备病毒性出血性败血症病毒(VHSV)单链抗体(single chain variable fragment antibody,ScFv)并鉴定其生物学功能,本研究提取抗VHSV单抗1G5的杂交瘤细胞株总RNA并反转录获得cDNA模板,通过PCR扩增VHSV抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)编码序列,将其拼接成单链抗体Sc Fv基因后插入载体pET28a中,构建原核表达重组质粒并在大肠杆菌中诱导表达。结果表明,单链抗体主要以可溶性形式表达,分子量约28 ku,能特异性识别VHSV病毒的G蛋白并对VHSV病毒具有体外中和活性,其对VHSV病毒的G蛋白亲和力(KD)达到1.4×10^(–8) M。单链抗体ScFv的制备为进一步研究VHSV的治疗性抗体、快速诊断试剂奠定了基础。 展开更多

关键词 鱼 病毒性出血性败血症病毒 单链抗体

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抗表皮生长因子受体单抗基因治疗胰腺癌的实验研究 被引量：1

13

作者 张太平 杜辉 +3 位作者 赵玉沛 陈革 郑连芳 李方 《中华肝胆外科杂志》 CAS CSCD 2007年第12期847-850,共4页

目的EGFR靶向治疗和AAV介导的基因治疗在胰腺癌治疗方面具有广泛前景。本实验将上述两种手段相结合,构建表达人抗EGFR单链可变区抗体的rAAV载体,并筛选出对抗EGFR治疗敏感的胰腺癌细胞株。方法以包含人IX因子基因的rAAV载体中的FIX基因... 目的EGFR靶向治疗和AAV介导的基因治疗在胰腺癌治疗方面具有广泛前景。本实验将上述两种手段相结合,构建表达人抗EGFR单链可变区抗体的rAAV载体,并筛选出对抗EGFR治疗敏感的胰腺癌细胞株。方法以包含人IX因子基因的rAAV载体中的FIX基因替换成目的基因,转染293细胞,Western Blot法检测目的蛋白:同时将C225作用于六株胰腺癌细胞,通过CCK-8法测定生长曲线,P1染色法及Annexin V-FITC试剂盒检测细胞凋亡。结果Western Blot法检测到目的条带;生长曲线显示C225仅对AsPC-1的生长有明显的抑制作用(P<0.01),Annexin V-FITC试剂盒可检测C225引起AsPC-1细胞的早期凋亡(P<0.05)。结论rAAV载体构建成功,并在293细胞中获得表达;AsPC-1对C225的敏感性明显高于其它五株胰腺癌细胞。 展开更多

关键词 胰腺肿瘤 表皮生长因子受体 单链可变区抗体 重组腺相关病毒载体 载体表达

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抗人胃癌单链抗体的分离纯化及其活性测定

14

作者 张淑梅 李晶 +3 位作者 赵晓祥 张云湖 李荣萍 杨志兴 《生物技术》 CAS CSCD 1999年第4期9-11,共3页

用已经构建的工程菌高效表达抗人胃癌单链抗体，并使用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００柱层板分离纯化抗体蛋白。同时用免疫竞争抑制实验。

关键词 胃癌 单链抗体 分离纯化 免疫竞争抑制

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一种特异性识别斑马鱼卵黄蛋白原的噬菌体展示单链抗体的可溶性表达方案

15

作者 饶瑜 钟利桥 +2 位作者 张凤 张晓华 戴和平 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1637-1644,共8页

为了实现特异性识别斑马鱼卵黄蛋白原的噬菌体展示单链抗体的可溶性表达,将不能以可溶性蛋白形式表达的、只能以噬菌体展示形式特异性识别斑马鱼卵黄蛋白原的单链抗体F5的基因,克隆到pET 32a载体并转化入大肠杆菌ori DE3中。结果表明,... 为了实现特异性识别斑马鱼卵黄蛋白原的噬菌体展示单链抗体的可溶性表达,将不能以可溶性蛋白形式表达的、只能以噬菌体展示形式特异性识别斑马鱼卵黄蛋白原的单链抗体F5的基因,克隆到pET 32a载体并转化入大肠杆菌ori DE3中。结果表明,通过诱导表达,可获得可溶性的并且仍特异性识别斑马鱼卵黄蛋白原的单链抗体32a-F5。噬菌体展示单链抗体不能可溶性表达是噬菌体展示技术应用中常见的问题,该方法提供了一种表达可溶性单链抗体的可行性方案。 展开更多

关键词 噬菌体展示技术 单链抗体 可溶性表达 大肠杆菌 斑马鱼卵黄蛋白原

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人源抗狂犬病毒免疫型抗体库的构建及特异性抗体筛选与鉴定 被引量：8

16

作者 李琛 林红 +5 位作者 刘新建 王忠灿 周镇先 陈乐如 管晓虹 朱进 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期575-578,616,共5页

目的:利用噬菌体展示技术,构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,筛选特异性的抗狂犬病毒糖蛋白人源单链抗体(scFv)并对其进行初步鉴定。方法:从接种狂犬疫苗的志愿者外周血中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为s... 目的:利用噬菌体展示技术,构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,筛选特异性的抗狂犬病毒糖蛋白人源单链抗体(scFv)并对其进行初步鉴定。方法:从接种狂犬疫苗的志愿者外周血中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv。将纯化后的scFv克隆至噬菌体载体pComb3XSS构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,以狂犬病毒糖蛋白(RABVG)为抗原,从抗体库中筛选抗RABVG的scFv。通过phage-ELISA验证噬菌体单链抗体的结合特异性,将阳性克隆转化E.coliTOP10F′进行表达。结果:构建了人源抗狂犬病毒抗体库,抗体库的库容为3.29×109。经过5轮筛选,获得43株与RABVG特异结合的噬菌体单链抗体,其中15个A450值较高的克隆序列分析结果显示,有3个正确的单链抗体基因。单链抗体基因转化TOP10F′构建工程菌,表达纯化后的单链抗体,经ELISA检测能够与RABVG特异性结合。结论:从构建的人源免疫型抗狂犬病毒单链抗体库筛选出的能与RABVG特异性结合的scFv,为进一步制备抗RABVG的治疗性人源化抗体奠定了基础。 展开更多

关键词 噬菌体展示 狂犬病毒 人源scfv抗体库

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抗弓形虫靶向抗菌肽的构建及其效应的初步评价 被引量：7

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作者 司进 朱荫昌 +3 位作者 曹利民 王晓婷 梁幼生 管晓虹 《中国血吸虫病防治杂志》 CAS CSCD 2005年第5期356-361,共6页

目的构建弓形虫主要表面抗原1单链抗体S1与爪蟾抗菌肽(magainin)的融合基因,在大肠杆菌中诱导表达,观察纯化的靶向抗菌蛋白抗弓形虫感染的效果。方法根据弓形虫主要表面抗原1单链抗体S1的编码序列设计引物从噬菌粒S1/pIT-2中扩增到S1基... 目的构建弓形虫主要表面抗原1单链抗体S1与爪蟾抗菌肽(magainin)的融合基因,在大肠杆菌中诱导表达,观察纯化的靶向抗菌蛋白抗弓形虫感染的效果。方法根据弓形虫主要表面抗原1单链抗体S1的编码序列设计引物从噬菌粒S1/pIT-2中扩增到S1基因;以其为模板,加入接头抗菌肽序列,采用重叠PCR法扩增得到S1基因与爪蟾抗菌肽的融合基因(S1M),将其克隆到原核表达载体pET-32c中,构建成S1与爪蟾抗菌肽基因的重组表达质粒S1M/pET-32c;测序验证后转化E.coliBL21,以IPTG诱导表达,用Ni2+螯合柱亲和纯化融合蛋白S1M,SDS-PAGE检测融合基因的表达和纯化的融合蛋白S1M;分别采用体内和体外试验观察纯化的靶向抗菌蛋白抗弓形虫感染效果。结果测序结果表明,成功地将弓形虫主要表面抗原1单链抗体S1与爪蟾抗菌肽的融合基因构建到原核表达载体pET-32c中;SDS-PAGE显示IPTG诱导表达的融合蛋白S1M大小约为43kDa,与预期的大小相一致,以包涵体的形式存在;通过变性条件下Ni2+亲和柱纯化获得S1M重组融合蛋白;体内和体外试验证实,经靶向抗菌蛋白处理过的弓形虫对小鼠的致病能力下降,应用靶向抗菌蛋白的弓形虫感染小鼠的存活时间与对照组相比有明显的提高。结论以抗弓形虫速殖子人源单链抗体作为靶向分子,以爪蟾抗菌肽作为效应分子,构建成功的靶向抗菌蛋白通过体内、外试验证实,具有一定的抗弓形虫感染的作用,虽然还不能完全杀灭弓形虫,但是在弓形虫生物治疗药物的研制方面进行了有益的探索,为弓形虫病的生物治疗提供了新的思路。 展开更多

关键词 弓形虫 单链抗体 抗菌肽 靶向

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从大容量噬菌体抗体库中筛选抗DNA-PKcs人源单链抗体 被引量：5

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作者 杜丽 周丽君 +7 位作者 潘秀颉 王豫 王欲晓 杨陟华 徐勤枝 张士猛 朱茂祥 周平坤 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期20-26,共7页

目的:从单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗DNA-PKcs的人源抗体,用于肿瘤治疗或诊断目的。方法:经抗原性分析及BLAST比对,选定人DNA-PKcs蛋白中抗原性高且与其他蛋白没有同源性的片段,进行原核表达及纯化后将其固定在抗原管上,通过... 目的:从单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗DNA-PKcs的人源抗体,用于肿瘤治疗或诊断目的。方法:经抗原性分析及BLAST比对,选定人DNA-PKcs蛋白中抗原性高且与其他蛋白没有同源性的片段,进行原核表达及纯化后将其固定在抗原管上,通过4轮"吸附-洗脱-扩增"过程从大容量抗体库中筛选特异性抗体,转化HB2151菌,制备抗DNA-PKcs的可溶性单链抗体;ELISA检测抗原-抗体结合活性。结果:经生物信息学分析,确定抗原性高且与其他蛋白没有同源性的DNA-PKcs片段DPK3(250个AA)、DPK4(257个AA)。经过4轮筛选,获得26个特异性结合DPK3及31个特异结合DPK4的克隆,指纹分析分别有5种和21种不同的可变区片段;成功制备了可溶性抗体。并做了抗原结合活性鉴定。结论:利用单链大容量抗体库获得抗DNA-PKcs的噬菌体抗体基因并且成功制备成可溶性抗体,为今后的研究和应用奠定了基础。 展开更多

关键词 大容量噬菌体抗体库 DNA依赖蛋白激酶催化亚单位 单链抗体

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荧光素标记噬菌体抗体的制备及其应用 被引量：4

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作者 乔媛媛 张达矜 +2 位作者 王珊珊 熊鸣 赵晓航 《现代肿瘤医学》 CAS 2015年第2期166-170,共5页

目的:通过直接荧光素标记方法制备荧光标记的噬菌体单链抗体,并且对于肿瘤细胞的免疫学活性进行检测。方法:用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)和四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothio cyanate,TRITC)... 目的:通过直接荧光素标记方法制备荧光标记的噬菌体单链抗体,并且对于肿瘤细胞的免疫学活性进行检测。方法:用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)和四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothio cyanate,TRITC)标记的单链噬菌体抗体对肿瘤细胞进行直接染色,通过荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜检测观察单链抗体与肿瘤细胞及白细胞的荧光显色情况。结果:荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜检测证实标记荧光素FITC、TRITC的噬菌体抗体与肿瘤细胞有较好的特异性结合,主要结合在细胞膜的表面。比较荧光的强度,与白细胞结合活性有差异。结论:用荧光素标记的噬菌体单链抗体能够作为检测试剂用于细胞、组织的检测,具备应用于免疫检测分析的价值,进一步证实所筛选的抗肿瘤细胞噬菌体抗体具有较好的免疫生物学活性。 展开更多

关键词 荧光素 噬菌体单链抗体 免疫荧光 肿瘤细胞

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基于流式细胞术的scFv抗体库筛选技术的建立 被引量：2

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作者 徐黎明 任桂萍 +2 位作者 尹杰超 田辉 李德山 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期65-68,共4页

目的利用NlpA前导肽诱导抗体锚定细菌内膜建立筛选scFv抗体库的展示技术,为高亲和力抗体的筛选奠定基础。方法从pNAD质粒中克隆出NlpA前导肽基因序列,酶切后将该序列克隆进pHEN1表达载体中。以PEAI质粒为模板,利用PCR的方法克隆得到抗-h... 目的利用NlpA前导肽诱导抗体锚定细菌内膜建立筛选scFv抗体库的展示技术,为高亲和力抗体的筛选奠定基础。方法从pNAD质粒中克隆出NlpA前导肽基因序列,酶切后将该序列克隆进pHEN1表达载体中。以PEAI质粒为模板,利用PCR的方法克隆得到抗-hIL-1β抗体的重链可变区和轻链可变区基因,然后利用重叠PCR的方法构建得到抗-hIL-1βscFv抗体。将scFv抗体插入到NlpA leader-pHEN1表达载体中构建成展示scFv的重组质粒pBSD-scFv。将pBSD-scFv转入到E.coli DH5α中诱导表达,原生质球制备后,采用梯度浓度的抗原进行孵育,最后经流式细胞术(FCM)检测抗体展示情况并且分选阳性群体,利用质粒提取的方法来替代PCR方法拯救阳性基因,转化E.coli DH5α,利用FCM再次检测该群体展示的抗体与抗原结合情况。结果所展示的抗-hIL-1βscFv抗体依次与抗原和FITC标记的抗原特异性抗体孵育后,用FCM实时检测,结果显示出很强的荧光信号并且表现出抗原浓度依赖性。拯救出的pBSD-scFv-原生质球的FCM检测结果与首次展示的FCM结果一致,该系统能够稳定的展示抗体。结论经过该细菌展示系统展示的scFv抗体能够有效的折叠,与相应的抗原具有很好的特异结合能力。 展开更多

关键词 细菌展示 流式细胞仪筛选 scfv抗体库

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