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Prokaryotic Expression of Rubber Elongation Factor Gene and Preparation of Its Polyclonal Antibody 被引量:8
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作者 陈章权 吴坤鑫 +2 位作者 梁晓东 黄震 陆田田 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2008年第4期29-33,共5页
[Objective] The aim of this study was to prepare the recombination protein of rubber elongation factor and its polyclonal antibodies.[Method] The encoding gene of rubber elongation factor(REF)was amplified by RT-PCR,a... [Objective] The aim of this study was to prepare the recombination protein of rubber elongation factor and its polyclonal antibodies.[Method] The encoding gene of rubber elongation factor(REF)was amplified by RT-PCR,and cloned into the prokaryotic expression vector pDEST17 to transform into Escherichia coil BI2I-AI.The recombinant protein induced by L-Arabinose was purified by the affinity chromatography.As the immunogen,the recombination protein was used to immunize mice for preparing polyclonal antibodies,while ELISA and Western blot hybridization were used to detect the titers and specificity.[Result] The purified recombination protein of REF with high expression was used to immunize house mice for preparing polyclonal antibodies with high titer and specificity.The western blot hybridization showed that the antibody could recognize the natural REF from latex.[Conclusion] The recombination protein of REF was successfully obtained and the mouse anti REF antibody with high titer and specificity was prepared,which lays a basis for further studies on biological functions of rubber elongation factor and other membrane proteins in rubber particles. 展开更多
关键词 rubber elongation factor Gene Expression ANTIBODY PREPARATION
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橡胶树延伸因子cDNA及其5′端启动子区域序列的分离与分析 被引量:5
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作者 邓晓东 费小雯 +1 位作者 黄俊生 郑学勤 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期528-532,共5页
橡胶延伸因子 REF(Rubber Elongation Factor)是橡胶生物合成中最重要的酶之一 ,是胶乳中主要的蛋白质。作者利用已发表的 REF c DNA序列设计并合成引物。通过提取胶乳总 RNA用 RT法合成 c DNA后 ,通过 PCR技术扩增并克隆了 REF c DNA... 橡胶延伸因子 REF(Rubber Elongation Factor)是橡胶生物合成中最重要的酶之一 ,是胶乳中主要的蛋白质。作者利用已发表的 REF c DNA序列设计并合成引物。通过提取胶乳总 RNA用 RT法合成 c DNA后 ,通过 PCR技术扩增并克隆了 REF c DNA序列。序列测定结果表明 ,所克隆的 REF c DNA编码区序列全长 4 14个碱基 ,编码 138个氨基酸 ,3′端非编码区长 112 bp。与 Goyvaerts E等人发表的序列比较 :REF c DNA编码区序列同源率为 10 0 % ,3′端非编码区有 2 bp的差异 ,同源率为 98%。在此基础上 ,通过步移法分离 5′端启动子区域 2 6 0 bp的序列 ,其中 ,含典型的TATA盒和 CAAT盒。为证实该基因为乳管特异表达 ,我们通过 Northern blot对橡胶延伸因子基因在胶乳和叶片中的表达做分析。初步结果表明 ,橡胶延伸因子基因主要在胶乳中表达。 展开更多
关键词 橡胶树 延伸因子 CDNA 5′端启动子区域 分离 序列分析
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杠柳橡胶合成关键基因CPT、SRPP和REF启动子克隆与表达特性分析 被引量:2
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作者 崔帅 陈任 曲乐庆 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期2794-2805,共12页
巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)是天然橡胶的主要来源。受热带气候条件限制,我国巴西橡胶树种植面积有限,天然橡胶自给率低。杠柳(Periploca sepium)可以合成顺式-1,4-聚异戊二烯(天然橡胶的主要成分),是一种天然橡胶的新型替代植物,... 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)是天然橡胶的主要来源。受热带气候条件限制,我国巴西橡胶树种植面积有限,天然橡胶自给率低。杠柳(Periploca sepium)可以合成顺式-1,4-聚异戊二烯(天然橡胶的主要成分),是一种天然橡胶的新型替代植物,但其合成调控机理尚不明确。本研究利用染色体步移方法,克隆获得了杠柳顺式-1,4-聚异戊二烯合成关键酶顺式-异戊烯基转移酶(cis-prenyltransferase,CPT)、小橡胶粒子蛋白(small rubber particle protein,SRPP)和橡胶延长因子(rubber elongation factor,REF)基因的启动子序列。以β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因为报告基因,利用农杆菌(Agrobacterium)介导稳定遗传转化法解析了这3个启动子的组织表达特性。结果显示,这三者在杠柳的叶片和茎中均有表达,特别是在叶脉和维管束位置共同表达,提示在这些部位REF和SRPP与CPT可能相互作用,共同完成天然橡胶的主要成分顺式-1,4-聚异戊二烯的聚合。本研究为解析杠柳中天然橡胶的生物合成机制以及培育高产天然橡胶新品种提供了理论基础。 展开更多
关键词 杠柳 天然橡胶 顺式-异戊烯基转移酶 小橡胶粒子蛋白 橡胶延长因子 启动子
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橡胶延伸因子基因及3-端非编码区的克隆与序列分析 被引量:3
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作者 费小雯 邓晓东 +1 位作者 胡新文 郑学勤 《生命科学研究》 CAS CSCD 1999年第4期339-343,共5页
橡胶延伸因子REF(Rubber Elongation Factor)是橡胶生物合成中最重要的酶之一.作者利用REF基因序列设计并合成引物. 通过提取胶乳总RNA 用RT法合成cDNA 后,通过PCR技术扩增并克隆了RE... 橡胶延伸因子REF(Rubber Elongation Factor)是橡胶生物合成中最重要的酶之一.作者利用REF基因序列设计并合成引物. 通过提取胶乳总RNA 用RT法合成cDNA 后,通过PCR技术扩增并克隆了REF基因和3端非编码区. 序列测定结果表明,REF基因全长414 个碱基,编码138 个氨基酸,3端非编码区长112 bp. 与Goyvaerts E 等人发表的序列比较:REF基因同源率为100% ,3端非编码区有2 bp 的差异,同源率为98% . 将所克隆的REF基因及3非编码区进行地高辛标记, 对胶乳和叶片总RNA 进行点杂交分析,结果表明,胶乳总RNA 呈阳性反应,叶片总RNA 则呈阴性反应. 展开更多
关键词 橡胶 橡胶延伸因子 克隆 点杂交
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酵母双杂交系统筛选新橡胶延长因子HbREF3互作蛋白 被引量:5
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作者 孙丽娜 康桂娟 +1 位作者 黎瑜 曾日中 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期358-365,共8页
橡胶延长因子(rubber elongation factor,REF)等橡胶粒子蛋白可能通过相互作用形成蛋白复合体在橡胶生物合成发挥作用。为鉴定REF家族中一新成员Hb REF3的互作蛋白,以橡胶树Hb REF3基因的c DNA序列为基础,分别构建了筛选Hb REF3相互作... 橡胶延长因子(rubber elongation factor,REF)等橡胶粒子蛋白可能通过相互作用形成蛋白复合体在橡胶生物合成发挥作用。为鉴定REF家族中一新成员Hb REF3的互作蛋白,以橡胶树Hb REF3基因的c DNA序列为基础,分别构建了筛选Hb REF3相互作用蛋白的3种诱饵载体p GBKT7-Hb REF3-F(含全长ORF序列)及p GBKT7-Hb REF3-N(含N端序列)和p GBKT7-Hb REF3-C(含C端序列),并分别转化到Y2H Gold酵母菌株中,进行诱饵表达载体的自激活性与毒性检测。实验证明,3种诱饵载体转化的酵母菌能在SD/-Trp平板上正常生长,而在SD/-Trp/-His/-Ade平板上不能生长,因此,诱饵载体本身没有自激活性,它们的表达产物也没有毒性,不影响转化酵母菌Y2H的生长,满足作为诱饵质粒的条件,并用于橡胶树胶乳c DNA酵母表达文库的筛选。结果表明,用Hb REF3基因的全长ORF编码产物作诱饵,没有筛选到任何候选互作蛋白,而用Hb REF3的N端和C端区域分别作诱饵,均筛选到了可能与Hb REF3具有相互作用的候选蛋白,其中包括REF家族的其他成员和膜联蛋白D4等。 展开更多
关键词 橡胶树 橡胶延伸因子 酵母双杂交 诱饵载体 互作蛋白
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杜仲EuREF1基因表达水平与橡胶积累的关系 被引量:5
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作者 冉昕 赵德刚 《林业科学研究》 CSCD 北大核心 2020年第4期35-41,共7页
[目的]为了探明EuREF1与胶分子量和含胶率的关系,深入探究杜仲胶合成机制。[方法]在杜仲新枝和叶片生长较快的4月中旬到6月中旬,利用RT-PCR技术分析杜仲EuREF1基因在雌雄株叶片和茎皮中的表达水平,以索氏提取法和GPC/SEC分别检测叶片和... [目的]为了探明EuREF1与胶分子量和含胶率的关系,深入探究杜仲胶合成机制。[方法]在杜仲新枝和叶片生长较快的4月中旬到6月中旬,利用RT-PCR技术分析杜仲EuREF1基因在雌雄株叶片和茎皮中的表达水平,以索氏提取法和GPC/SEC分别检测叶片和树皮中橡胶的含量和分子量。[结果]在4月至6月期间,雌雄株叶片、茎皮EuREF1表达水平分别与这些器官中胶含量及胶分子量呈显著或极显著正相关(R=0.8982~0.9880)。在雌株叶片、茎皮、果皮和雄株叶片、茎皮中,分子量在1.0×10^6~5.0×10^6 Da所占比例最多,即长度在1.5×10^4~7.4×10^4个异戊二烯单体的橡胶最多。[结论]结果推测EuREF1基因产物与杜仲胶积累程度有紧密的关系,可能在橡胶链的延伸中发挥重要作用。 展开更多
关键词 杜仲 橡胶 橡胶延长因子 基因
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桑树橡胶延伸因子基因的克隆与表达分析 被引量:3
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作者 潘刚 韩舒睿 +5 位作者 沈智超 邸柄荣 孙银苹 赵卫国 楼程富 潘一乐 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期718-721,共4页
桑树乳汁在桑树的生长和防御过程中起重要作用,乳汁中的糖苷酶抑制剂还是治疗糖尿病的有效成分。通过桑树cDNA文库中的序列比对,发现一段与乳汁合成相关的基因片段,采用RACE方法获得该基因的全长序列,基因cDNA全长1 145 bp,编码区759 bp... 桑树乳汁在桑树的生长和防御过程中起重要作用,乳汁中的糖苷酶抑制剂还是治疗糖尿病的有效成分。通过桑树cDNA文库中的序列比对,发现一段与乳汁合成相关的基因片段,采用RACE方法获得该基因的全长序列,基因cDNA全长1 145 bp,编码区759 bp,编码252个氨基酸残基,将该基因命名为桑树橡胶延伸因子基因(GenBank登录号:GQ466080)。为探究该基因的功能,通过RT-PCR的方法分析该基因在桑树不同组织器官的表达,结果表明该基因在桑树幼叶中的表达量最高,其次是茎和芽,在根中的表达量最低。对桑树叶片进行细胞分裂素处理,发现细胞分裂素处理后该基因表达量有减少的趋势,在细胞分裂素处理的叶片中,正在伸展的幼叶中该基因的表达量要高于刚出现的幼叶和成熟叶。与桑树中已知的其它功能基因相比,桑树橡胶延伸因子在桑树正常生长中的表达量远高于桑树Na+/H+逆向转运蛋白基因MaNHX和桑树抗冻蛋白基因WAP27的表达量。从以上结果初步推测桑树橡胶延伸因子基因在桑树的生长发育中起重要作用。 展开更多
关键词 桑树 橡胶延伸因子 基因克隆 基因表达
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杜仲胶合成相关基因EuREF 1的克隆及分析 被引量:4
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作者 王宇 董旋 赵德刚 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期917-925,共9页
根据本实验室已建立的杜仲转录组数据库提供的序列信息设计引物,以杜仲含胶组织叶和皮为材料提取总m RNA,采用RACE技术克隆了5'端700 bp和3'端600 bp c DNA片段,连接至p GEM-T载体,经测序拼接后获得全长1 075 bp的杜仲橡胶延长... 根据本实验室已建立的杜仲转录组数据库提供的序列信息设计引物,以杜仲含胶组织叶和皮为材料提取总m RNA,采用RACE技术克隆了5'端700 bp和3'端600 bp c DNA片段,连接至p GEM-T载体,经测序拼接后获得全长1 075 bp的杜仲橡胶延长因子基因(Eucommia ulmoides rubber elongation factor 1,Eu REF 1)c DNA序列,其中开放阅读框678 bp,共编码225个氨基酸残基。在NCBI中blastp比对,Eu REF 1与葡萄、蓖麻REF序列同源性分别为42%和41%;预测的蛋白质Eu REF 1氨基酸序列经blastp比对,显示该预测蛋白质序列属于REF超家族。本研究首次克隆杜仲的橡胶延长因子基因c DNA序列,构建了表达载体p SH-35S-Eu REF 1,通过农杆菌介导法对烟草长脖黄进行遗传转化,经PCR检测和GUS组织染色,获得转基因烟草43株,移栽生长四个月的转基因烟草在表型上与野生型在叶片长宽比上有明显差异。 展开更多
关键词 杜仲 橡胶延长因子 基因克隆
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橡胶延长因子基因的原核表达及其多克隆抗体的制备 被引量:2
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作者 陈章权 吴坤鑫 +2 位作者 梁晓东 黄震 陆田田 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第29期12619-12621,共3页
[目的]制备橡胶延长因子重组蛋白及其多克隆抗体。[方法]用RT-PCR法扩增橡胶延长因子(rubber elongation factor,REF)编码区基因,将其克隆到原核表达载体pDEST17中,转化大肠杆菌BL21-AI,用L-阿拉伯糖诱导重组蛋白的表达,并采用亲和层析... [目的]制备橡胶延长因子重组蛋白及其多克隆抗体。[方法]用RT-PCR法扩增橡胶延长因子(rubber elongation factor,REF)编码区基因,将其克隆到原核表达载体pDEST17中,转化大肠杆菌BL21-AI,用L-阿拉伯糖诱导重组蛋白的表达,并采用亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA和W estern blot对抗体效价和特异性进行鉴定。[结果]高效表达和纯化了橡胶延长因子重组蛋白,用其免疫家小鼠,获得了高效价的特异性多克隆抗体,W estern blot检测显示该抗体可识别胶乳中的天然橡胶延长因子。[结论]成功获得橡胶延长因子重组蛋白,制备了效价高、特异性好的鼠抗橡胶延长因子抗体,为进一步橡胶延长因子及其他橡胶粒子膜蛋白的生物学功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 橡胶延长因子 基因 表达 抗体 制备
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巴西橡胶树HbSIP2互作蛋白的筛选和鉴定 被引量:1
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作者 朱家红 徐靖 +3 位作者 郭冬 李辉亮 王颖 彭世清 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期681-686,共6页
可溶性无机焦磷酸酶在天然橡胶生物合成中具有重要的调控作用,HbSIP2是胶乳中关键的可溶性无机焦磷酸酶基因。为了深入了解HbSIP2调控橡胶生物合成的机理,本研究对HbSIP2互作蛋白进行了筛选和鉴定。结果表明:诱饵载体p GBKT7-Hb SIP2无... 可溶性无机焦磷酸酶在天然橡胶生物合成中具有重要的调控作用,HbSIP2是胶乳中关键的可溶性无机焦磷酸酶基因。为了深入了解HbSIP2调控橡胶生物合成的机理,本研究对HbSIP2互作蛋白进行了筛选和鉴定。结果表明:诱饵载体p GBKT7-Hb SIP2无自激活活性,且对酵母无毒性作用,可以用于酵母文库筛选。将诱饵载体与橡胶树胶乳cDNA文库进行杂交,初步筛选获得20个与HbSIP2互作的蛋白。进一步通过双分子荧光互补实验证实,Hb SIP2能够与橡胶延伸因子发生蛋白互作。本研究结果为HbSIP2调控橡胶生物合成的机理研究提供了重要的理论依据。 展开更多
关键词 巴西橡胶树 HbSIP2 蛋白互作 橡胶延伸因子
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橡胶延伸因子REF基因的克隆、转化及功能分析 被引量:7
11
作者 赵丽娟 袁彬青 +3 位作者 王秀珍 罗成华 闫洁 祝建波 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期144-150,共7页
取巴西橡胶树新鲜橡胶胶乳,利用改良CTAB法提取胶乳总RNA,反转录合成cDNA。根据GenBank中REF基因序列的报道,设计特异性引物,Taq酶扩增,获得REF基因并构建DHN pBin 438-REF植物表达载体。利用叶盘转化法侵染橡胶草无菌幼嫩叶片,通过RT-... 取巴西橡胶树新鲜橡胶胶乳,利用改良CTAB法提取胶乳总RNA,反转录合成cDNA。根据GenBank中REF基因序列的报道,设计特异性引物,Taq酶扩增,获得REF基因并构建DHN pBin 438-REF植物表达载体。利用叶盘转化法侵染橡胶草无菌幼嫩叶片,通过RT-PCR方法鉴定阳性植株,对其可溶性糖、胶乳和蛋白质含量等进行检测。结果表明,转基因橡胶草可溶性糖质量浓度为0.053 8g/L,约是野生型橡胶草的2倍;橡胶是野生型植株橡胶的1~3倍;而转基因橡胶草中REF基因在蛋白质水平高效表达,其中根和花梗中REF基因高效表达。本研究通过农杆菌介导的遗传转化,获得5株阳性转基因橡胶草植株,分子生物学结果表明,REF基因可在橡胶草中稳定表达,并显著地提高橡胶草中合成天然橡胶的生物量。 展开更多
关键词 橡胶草 REF基因 克隆 橡胶
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橡胶树HbREF3基因的克隆及功能初步分析
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作者 录亿隆 刘星 +2 位作者 张宇豪 刘开业 唐朝荣 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2022年第3期491-498,共8页
橡胶延伸因子(REFs)是橡胶粒子上的一种主要膜蛋白,在橡胶生物合成途径中具有延伸橡胶烃和稳定橡胶粒子等重要作用。对橡胶树不同组织的转录组测序发现,HbREF3在胶乳中具有特异性的高表达,且其在HbREFs基因家族中表达水平也相对较高,仅... 橡胶延伸因子(REFs)是橡胶粒子上的一种主要膜蛋白,在橡胶生物合成途径中具有延伸橡胶烃和稳定橡胶粒子等重要作用。对橡胶树不同组织的转录组测序发现,HbREF3在胶乳中具有特异性的高表达,且其在HbREFs基因家族中表达水平也相对较高,仅次于表达丰度最高的HbREF1。HbREF3的开放阅读框为528 bp,编码175个氨基酸,对应的蛋白相对分子质量为19.62 kDa,理论等电点(pI)为5.28。系统进化树分析表明,HbREF3与橡胶树其他HbREFs虽均属于分组Ⅰ,但与HbREF1明显属于不同分支。HbREFs均含有REF保守结构域,但在保守motif的分布上,不同HbREFs蛋白含有保守motif数量不等,HbREF3比HbREF1多了一个motif。生信预测分析表明,该蛋白属于亲水性蛋白,无跨膜结构域,具有14个磷酸化位点。亚细胞定位分析发现HbREF3蛋白定位在内质网上,推测其可能参与橡胶粒子的形成和胶乳的再生。本研究结果为进一步阐明HbREF3基因在橡胶树胶乳再生中的作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 橡胶树 橡胶延伸因子HbREF3 生物信息学分析 亚细胞定位
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