刚地弓形虫ROP18基因的克隆及生物信息学分析 被引量：21

1

作者 郭玲玲 张晓磊 +5 位作者 张进顺 贾晓晖 姜文静 王春苗 刘楠 朱晓波 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2015年第5期414-419,共6页

目的对刚地弓形虫RH株的棒状体蛋白18(TgROP18)基因进行克隆,同时采用生物信息学分析TgROP18蛋白序列。方法提取刚地弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgROP18基因(GenBank登陆号为AM075204)的开放阅读框设计引物,采用逆转录PCR(RT-PCR)扩增RO... 目的对刚地弓形虫RH株的棒状体蛋白18(TgROP18)基因进行克隆,同时采用生物信息学分析TgROP18蛋白序列。方法提取刚地弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgROP18基因(GenBank登陆号为AM075204)的开放阅读框设计引物,采用逆转录PCR(RT-PCR)扩增ROP18基因,并对其产物进行测序;采用在线生物软件预测TgROP18蛋白的结构与功能。结果 TgROP18基因RT-PCR扩增产物与预期一致,大小为1 665bp;测序分析显示,ROP18基因序列与GenBank上已发表的序列完全一致。TgROP18蛋白含有554个氨基酸,分子式为C2753H4405N801O811S20,分子质量单位为62.34ku,理论等电点为9.34;在TgROP18蛋白的二级结构中,α-螺旋、β-折、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为41.52%、19.13%、7.76%和31.59%;TgROP18蛋白含有10个亲水性较高的区域(临界值为2.0),28个表面可及性较高的区域(临界值为1.9),10个保守结构区域,7个翻译后修饰位点,21个B细胞抗原表位,21个CTL抗原表位及26个Th抗原表位有。结论生物信息学分析表明,TgROP18蛋白具有良好的免疫原性,这将为弓形虫疫苗的研究提供基础资料。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 ROP18 克隆 真核表达质粒 生物信息学分析

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刚地弓形虫ROP12蛋白的生物信息学分析 被引量：11

2

作者 郭玲玲 王春苗 +4 位作者 张进顺 张晓磊 贾晓晖 姜文静 刘楠 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2015年第6期531-535,共5页

目的通过在线生物程序分析刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白12(ROP12)的生物信息学特性。方法通过在线ProtParam、SOSUI、SOPMA、TMHMM、MotifScan及SYFPEITHI等程序,同时结合DNASTAR、DNAMAN生物信息学软件,分析TgROP12蛋白的... 目的通过在线生物程序分析刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白12(ROP12)的生物信息学特性。方法通过在线ProtParam、SOSUI、SOPMA、TMHMM、MotifScan及SYFPEITHI等程序,同时结合DNASTAR、DNAMAN生物信息学软件,分析TgROP12蛋白的生物学特性,如理化性质、二级结构、结构域及抗原表位等。结果TgROP12蛋白含有236个氨基酸,其为分子式C1125H1786N308O360S3,其分子质量和理论等电点分别为25.48ku和4.53。TgROP12蛋白具有信号肽序列和跨膜结构区域,其二级结构中β-转角和无规则卷曲分别占7.20%和44.92%;TgROP12蛋白含有8个亲水性较高(临界值为2.0)的区域,10个表面可及性较高(临界值为1.9)的区域;TgROP12蛋白含有保守结构区域和翻译后修饰位点各6个,并含有9个B细胞抗原表位和6个T细胞抗原表位。结论生物信息学分析显示TgROP12蛋白的免疫原性较好,可作为弓形虫病疫苗候选分子。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 棒状体蛋白12 生物信息学 分析

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刚地弓形虫ROP16-ROP18复合基因真核表达载体的构建 被引量：8

3

作者 刘楠 张晓磊 +3 位作者 郭玲玲 张进顺 贾晓晖 刘荣荣 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2017年第1期57-61,共5页

目的构建刚地弓形虫棒状体蛋白16(TgROP16)、棒状体蛋白18(TgROP18)复合基因真核表达重组质粒,并验证其在真核细胞中的表达情况。方法重组质粒pVAX1-ROP16与pVAX1-ROP18分别经EcoRⅠ和NotⅠ、NheⅠ和AflⅡ双酶切,将ROP16与ROP18基因先... 目的构建刚地弓形虫棒状体蛋白16(TgROP16)、棒状体蛋白18(TgROP18)复合基因真核表达重组质粒,并验证其在真核细胞中的表达情况。方法重组质粒pVAX1-ROP16与pVAX1-ROP18分别经EcoRⅠ和NotⅠ、NheⅠ和AflⅡ双酶切,将ROP16与ROP18基因先后克隆至双启动子真核表达载体质粒pVAXD的多克隆位点中,构建pVAXD-ROP16-ROP18重组质粒。分别用双酶切和PCR验证正确的重组质粒及对照组质粒转染Hela细胞,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,以此为模板进行ROP16基因、ROP18基因与管家基因β肌动蛋白基因的RT-PCR扩增,采用间接免疫荧光法检测各自基因的表达。结果重组质粒pVAXD-ROP16-ROP18经PCR及双酶切鉴定构建正确。转染后经RT-PCR检测,实验组与对照组β-肌动蛋白基因扩增产物均与预期大小相符,实验组ROP16基因、ROP18基因扩增产物分别为1 700bp和2 100bp,与预期大小相符,而对照组均未扩增出ROP16及ROP18基因。间接免疫荧光法检测显示,重组质粒pVAXD-ROP16、pVAXD-ROP18转染组细胞可见绿色荧光,空质粒及对照组无绿色荧光。结论成功构建了重组质粒pVAXD-ROP16-ROP18,该质粒可在真核细胞中表达。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 棒状体蛋白16 棒状体蛋白18 复合重组质粒 真核表达

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弓形虫棒状体蛋白ROP18的原核表达及其免疫保护性研究 被引量：6

4

作者 许越 张莹光 +4 位作者 徐丹 曹利利 王巍 魏峰 刘全 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2013年第8期708-711,共4页

目的克隆弓形虫ROP18基因并构建该基因的原核表达系统。方法根据GenBank发表的弓形虫ROP18序列设计合成1对特异性引物,PCR扩增ROP18抗原基因,并亚克隆到pET-28a原核表达载体,重组质粒转入大肠埃希菌BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达,重组... 目的克隆弓形虫ROP18基因并构建该基因的原核表达系统。方法根据GenBank发表的弓形虫ROP18序列设计合成1对特异性引物,PCR扩增ROP18抗原基因,并亚克隆到pET-28a原核表达载体,重组质粒转入大肠埃希菌BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达,重组蛋白用SDS-PAGE及Western blot鉴定。重组蛋白经纯化后免疫小鼠,ELISA法检测血清抗弓形虫IgG,并通过攻虫试验观察重组蛋白的免疫保护作用。结果成功构建了ROP18基因原核表达质粒pET-28a-ROP18,表达重组蛋白的分子质量单位约为55ku,该蛋白可被鼠抗弓形虫多抗血清识别;经ELISA检测,重组蛋白免疫小鼠产生了较高水平的血清抗体;攻虫试验中,重组蛋白免疫小鼠生存时间较对照组小鼠显著延长(P<0.05)。结论成功构建了ROP18基因原核表达质粒,表达的重组蛋白具有一定的免疫保护作用。 展开更多

关键词 弓形虫 ROP18 原核表达

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弓形虫棒状体蛋白18的原核表达及鉴定 被引量：5

5

作者 鞠爱萍 吴亮 +3 位作者 沈进 李礼 姜旭淦 陈盛霞 《江苏大学学报（医学版）》 CAS 2013年第3期207-211,共5页

目的:原核表达刚地弓形虫RH株棒状体蛋白(rhoptry proteins,ROPs)18,建立检测和定位虫体ROP18蛋白的方法。方法:运用PCR技术扩增弓形虫RH株速殖子ROP18基因,克隆至pET-28a(+)载体,转化至大肠埃希菌Rosetta中诱导表达,经KCl染色切胶纯化... 目的:原核表达刚地弓形虫RH株棒状体蛋白(rhoptry proteins,ROPs)18,建立检测和定位虫体ROP18蛋白的方法。方法:运用PCR技术扩增弓形虫RH株速殖子ROP18基因,克隆至pET-28a(+)载体,转化至大肠埃希菌Rosetta中诱导表达,经KCl染色切胶纯化重组ROP18蛋白,并制备其兔多克隆抗体。采用蛋白质印迹技术和间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测和定位ROP18在弓形虫速殖子体内的表达。结果:成功表达重组ROP18蛋白,并获得其多克隆抗体。经蛋白质印迹技术检测出虫体ROP18特异性条带,IFA技术检测出ROP18分布于虫体棒状体。结论:通过制备多克隆抗体,利用蛋白质印迹技术和IFA技术能检测和定位ROP18蛋白在弓形虫体内表达。 展开更多

关键词 弓形虫 棒状体蛋白18 原核表达 KCl染色

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刚地弓形虫ROP10-ROP18真核表达载体的构建与鉴定 被引量：3

6

作者 刘荣荣 张晓磊 +2 位作者 张进顺 贾晓晖 刘楠 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第6期612-616,共5页

目的构建刚地弓形虫棒状体蛋白10(ROP10)、棒状体蛋白18(ROP18)复合基因真核表达载体pVAXDROP10-ROP18,并在HeLa细胞内表达目的蛋白。方法设计ROP10、ROP18基因特异引物,采用RT-PCR扩增ROP10、ROP18基因并测序,将ROP10和ROP18基因分别... 目的构建刚地弓形虫棒状体蛋白10(ROP10)、棒状体蛋白18(ROP18)复合基因真核表达载体pVAXDROP10-ROP18,并在HeLa细胞内表达目的蛋白。方法设计ROP10、ROP18基因特异引物,采用RT-PCR扩增ROP10、ROP18基因并测序,将ROP10和ROP18基因分别定向插入双启动子真核表达载体pVAXD的多克隆位点中,构建单价质粒pVAXD-ROP10和pVAXD-ROP18,然后将ROP18基因插入pVAXD-ROP10中构建双启动子真核表达载体pVAXD-ROP10-ROP18。经PCR和双酶切验证后将pVAXD-ROP10-ROP18转染至HeLa细胞内,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,以此为模板分别进行ROP10基因和ROP18基因的RT-PCR鉴定;采用间接免疫荧光试验(IFA)检验ROP10和ROP18蛋白表达情况。结果成功克隆ROP10、ROP18基因片段并构建了重组质粒pVAXDROP10-ROP18,测序、双酶切和PCR验证重组质粒构建正确。分别将3种重组质粒转染至HeLa细胞后经RT-PCR鉴定,pVAXD-ROP10-ROP18组可同时扩增出1 761bp(ROP10基因)和1 665bp(ROP18基因)2个片段,而pVAXDROP10组和pVAXD-ROP18组分别扩增出1 761bp和1 665bp的目的片段;IFA显示pVAXD-ROP10组和pVAXDROP18组均有绿色荧光,即分别表达ROP10和ROP18蛋白。结论成功构建重组质粒pVAXD-ROP10-ROP18、pVAXD-ROP10和pVAXD-ROP18质粒可在真核细胞中分别表达ROP10和ROP18两种蛋白。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 棒状体蛋白10 棒状体蛋白18 重组质粒 真核表达载体

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弓形虫棒状体蛋白18的原核表达及免疫分析 被引量：4

7

作者 王素凡 齐辰 +2 位作者 陈滨 吴焜 陈晓光 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期211-215,共5页

目的克隆刚地弓形虫ROP18基因,进行原核表达及重组蛋白的免疫分析。方法提取弓形虫RH株基因组DNA,经PCR获得ROP18基因片段,经双酶切分别连入原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+),构建重组表达载体pET28a-ROP18和pET32a-ROP18,并转化大... 目的克隆刚地弓形虫ROP18基因,进行原核表达及重组蛋白的免疫分析。方法提取弓形虫RH株基因组DNA,经PCR获得ROP18基因片段,经双酶切分别连入原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+),构建重组表达载体pET28a-ROP18和pET32a-ROP18,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。IPTG诱导表达后,收集菌体进行SDS-PAGE电泳及Western-blot检测。结果 PCR得到约1 665bp目的基因片段,单、双酶切及PCR鉴定结果显示成功构建重组表达载体pET28a-ROP18和pET32a-ROP18;经IPTG诱导后,ROP18基因在大肠杆菌中高效表达;SDS-PAGE电泳及Western-blot分析显示,pET28a-ROP18在相对分子质量约60kD的位置出现目的蛋白条带,pET32a-ROP18在相对分子质量约83kD的位置出现目的蛋白条带,均与理论值相符;Western-blot结果显示重组蛋白与弓形虫慢性感染小鼠血清具有特异免疫反应性。结论成功克隆和表达了ROP18基因,所表达的重组蛋白具有免疫效应,为其功能研究奠定基础。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 棒状体蛋白18 基因克隆 原核表达 免疫分析

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刚地弓形虫RH株ROP18-ROP12复合基因真核表达载体的构建 被引量：2

8

作者 郭玲玲 张晓磊 +5 位作者 张进顺 贾晓晖 王春苗 姜文静 朱晓波 贾天军 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期161-166,共6页

目的构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白18(ROP18)与ROP12的复合基因真核表达重组质粒,并检验其在真核细胞中的表达情况。方法重组质粒p VAX1-ROP18和p VAX1-ROP12分别经Bam HⅠ和XbaⅠ双酶切,将ROP12基因克隆至p VAX1-ROP18... 目的构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白18(ROP18)与ROP12的复合基因真核表达重组质粒,并检验其在真核细胞中的表达情况。方法重组质粒p VAX1-ROP18和p VAX1-ROP12分别经Bam HⅠ和XbaⅠ双酶切,将ROP12基因克隆至p VAX1-ROP18重组质粒。经菌落PCR、酶切及测序鉴定正确的重组表达质粒p VAX1-ROP18-ROP12转染至He La细胞。同时设空质粒组、p VAX1-ROP18转染组和p VAX1-ROP12转染组。提取各组He La细胞的总RNA并逆转录为c DNA,分别进行管家基因β-肌动蛋白和ROP18-ROP12复合基因的RT-PCR鉴定;同时,采用间接荧光免疫法和蛋白质印迹(Western blotting)法检测重组质粒p VAX1-ROP18-ROP12瞬时转染He La细胞后蛋白的表达情况。结果重组质粒p VAX1-ROP18-ROP12的菌落PCR电泳显示在约2 373 bp处出现特异性扩增片段,与预期大小相符。提取重组质粒经HindⅢ、Bam HⅠ和XbaⅠ单酶切、双酶切及三酶切鉴定均正确。测序结果显示,p VAX1-ROP18-ROP12重组质粒与已发表的弓形虫RH株ROP18基因(登录号为AM075204.1)序列一致性为100%,与弓形虫RH株ROP12基因(登录号为DQ096559.1)序列一致性为99%。脂质体转染后各组β-肌动蛋白的RT-PCR扩增产物均为613 bp,与预期大小相符。p VAX1-ROP18-ROP12转染组的ROP18-ROP12复合基因扩增产物大小为2 373 bp,而其他组未见条带。间接荧光法检测显示,在重组质粒转染的He La细胞胞浆中观察到黄绿色荧光,而对照组无黄绿色荧光。Western blotting法检测显示,融合蛋白ROP18-ROP12相对分子质量(Mr)约为85 000。结论构建了重组质粒p VAX1-ROP18-ROP12,该质粒能在真核细胞中表达。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 棒状体蛋白18 棒状体蛋白12 复合重组质粒 真核表达

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弓形虫ROP18重组腺病毒载体的构建及其对神经干细胞C17.2凋亡的影响 被引量：3

9

作者 张贤 甘小凤 +4 位作者 程正阳 都建 罗庆礼 沈继龙 余莉 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期234-239,共6页

目的构建弓形虫棒状体蛋白ROP18重组腺病毒载体,研究其对神经干细胞C17.2凋亡的影响。方法将弓形虫ROP18从PEGFP-G2-ROP18重组质粒上亚克隆至腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP,重组腺病毒载体pHBAd-MCMVGFP-ROP18经PCR、测序鉴定正确后,与骨架... 目的构建弓形虫棒状体蛋白ROP18重组腺病毒载体,研究其对神经干细胞C17.2凋亡的影响。方法将弓形虫ROP18从PEGFP-G2-ROP18重组质粒上亚克隆至腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP,重组腺病毒载体pHBAd-MCMVGFP-ROP18经PCR、测序鉴定正确后,与骨架质粒pHBAd-BHG共转染HEK293细胞进行包装,收获、扩增重组腺病毒并对其滴度进行测定。以MOI=70的重组腺病毒感染神经干细胞C17.2,转染不同时间荧光显微镜观察基因的表达情况。转染48h用CCK-8法检测C17.2的增殖情况;转染24h采用Annexin V-APC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot法检测半胱天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的蛋白水平。结果重组ROP18过表达腺病毒在C17.2神经干细胞内能有效表达。转染48h,与空载体对照组相比,C17.2细胞增殖活性明显降低(P<0.05);转染24h,流式细胞术检测结果显示,ROP18基因转染组C17.2细胞凋亡率明显增加(P<0.001);Western blot检测显示caspase-3活性片段的表达明显增加(P<0.05)。结论成功构建了弓形虫ROP18重组腺病毒并在神经干细胞C17.2中表达,ROP18重组腺病毒能诱导C17.2神经干细胞凋亡。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 棒状体蛋白18 神经干细胞C17.2 重组腺病毒 细胞凋亡

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刚地弓形虫RH株ROP18基因真核表达载体的构建 被引量：3

10

作者 郭玲玲 张晓磊 +4 位作者 张进顺 贾晓晖 姜文静 王春苗 刘楠 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2015年第11期994-998,共5页

目的 PCR扩增刚地弓形虫(Toxplasma gondii)棒状体蛋白18(ROP18)基因,构建真核表达载体pVAX1-ROP18,并检验其在真核细胞中的表达。方法 ROP18基因和质粒pVAX1分别经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,在T4连接酶作用下连接过夜,将连接产物转化至大... 目的 PCR扩增刚地弓形虫(Toxplasma gondii)棒状体蛋白18(ROP18)基因,构建真核表达载体pVAX1-ROP18,并检验其在真核细胞中的表达。方法 ROP18基因和质粒pVAX1分别经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,在T4连接酶作用下连接过夜,将连接产物转化至大肠埃希菌E.coil XL1-Blue感受态细胞,经菌落PCR、双酶切及测序正确的重组质粒pVAX1-ROP18转染至HeLa细胞内。试验设空白对照组和pVAX1空质粒对照。提取各组HeLa细胞的总RNA并将其逆转录成cDNA,分别进行管家基因β-actin和ROP18基因的RT-PCR扩增;采用Western blot法检测转染后各组细胞ROP18蛋白的表达情况。结果经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测,ROP18基因的RT-PCR扩增片段大小为1 665bp,与预期值相符;ROP18基因重组质粒转化菌菌落PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定,大小为1 665bp,与预期值相符;双酶切重组质粒得到预期酶切片段;重组质粒的目的基因序列与弓形虫RH株ROP18基因(登录号AM075204.1)序列比对完全一致。脂质体转染后各组β-actin的RT-PCR扩增目的片段均为613bp,与预期值相符;pVAX1-ROP18重组质粒转染组的ROP18的RT-PCR扩增目的片段大小为1 665bp,而其他组无该目的基因条带。Western blot检测重组质粒pVAX1-ROP18能够在HeLa细胞内表达ROP18蛋白。结论成功构建了真核表达载体pVAX1-ROP18,且该重组质粒能够在真核细胞内表达ROP18蛋白。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 棒状体蛋白18 重组质粒 真核表达

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弓形虫重组质粒pBudCE4.1-AMA1-ROP18的构建及鉴定 被引量：2

11

作者 石娜 何深一 +5 位作者 陈琳 周怀瑜 丛华 白杨 赵广会 赵群力 《山东大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2012年第10期56-60,67,共6页

目的构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18 DNA重组质粒,并对其进行克隆及鉴定。方法采用PCR法对目的基因进行扩增,构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18重组质粒,转染至人包皮成纤维细胞(HFF)进行表达并用SDS-PAGE和β-actin进行鉴定。结果经测序、双酶切和PC... 目的构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18 DNA重组质粒,并对其进行克隆及鉴定。方法采用PCR法对目的基因进行扩增,构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18重组质粒,转染至人包皮成纤维细胞(HFF)进行表达并用SDS-PAGE和β-actin进行鉴定。结果经测序、双酶切和PCR鉴定,重组质粒pBudCE4.1-AMA1-ROP18构建正确;经RT-PCR和SDS-PAGE鉴定,AMA1、ROP18基因均在哺乳动物细胞中正确转录与表达。结论成功构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18重组质粒,并可在HFF细胞中稳定表达。 展开更多

关键词 弓形虫属 质粒 细胞转染 弓形虫顶端膜抗原1 棒状体蛋白18

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弓形虫棒状体蛋白ROP18表位肽抗体的制备与初步应用 被引量：1

12

作者 朱进进 程正阳 余莉 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第1期48-54,共7页

设计并制备兔抗弓形虫棒状体蛋白ROP18的特异性表位肽抗体,并对其进行鉴定及初步应用。运用在线蛋白质分析软件Bepi Pred 1.0 Server预测和分析ROP18的抗原表位,人工合成选定的两段优势表位肽,与载体蛋白BSA偶联后分别免疫新西兰兔制备... 设计并制备兔抗弓形虫棒状体蛋白ROP18的特异性表位肽抗体,并对其进行鉴定及初步应用。运用在线蛋白质分析软件Bepi Pred 1.0 Server预测和分析ROP18的抗原表位,人工合成选定的两段优势表位肽,与载体蛋白BSA偶联后分别免疫新西兰兔制备抗ROP18血清,通过ELISA鉴定其效价,Western blot鉴定其特异性,并将这两种抗体应用于免疫荧光和免疫共沉淀技术。间接ELISA结果显示两种抗体效价分别为1∶16 000、1∶64 000;Western blot结果显示,两种抗体均能够特异性识别弓形虫速殖子中的内源性天然ROP18蛋白和外源重组ROP18蛋白;免疫荧光检测到ROP18定位于弓形虫速殖子顶端及感染细胞的纳虫泡膜上;免疫共沉淀未能成功下拉目标蛋白。成功获得ROP18的两种表位肽多克隆抗体,效价高且特异性强,并成功应用于免疫荧光定位,为进一步探究ROP18在弓形虫中的功能和作用奠定了基础。 展开更多

关键词 弓形虫 ROP18 免疫荧光 免疫共沉淀

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弓形虫SAG1、ROP18真核表达载体的构建及在诱导小鼠保护性免疫中的作用研究

13

作者 吴腊梅 彭天丽 +2 位作者 何雁鸿 董成林 杨慧健 《国际检验医学杂志》 CAS 2023年第19期2365-2369,共5页

目的观察弓形虫速殖子表面抗原1(SAG1)、棒状体蛋白18(ROP18)真核表达载体单独及联合使用诱导BALB/c小鼠的保护性免疫作用。方法制备重组真核表达质粒p3×FLAG-Myc-CMV TM-24-SAG1,p3×FLAG-Myc-CMV TM-24-ROP18及空质粒p3×... 目的观察弓形虫速殖子表面抗原1(SAG1)、棒状体蛋白18(ROP18)真核表达载体单独及联合使用诱导BALB/c小鼠的保护性免疫作用。方法制备重组真核表达质粒p3×FLAG-Myc-CMV TM-24-SAG1,p3×FLAG-Myc-CMV TM-24-ROP18及空质粒p3×FLAG-Myc-CMV TM-24(空载体),以磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至1μg/μL。将102只BALB/c小鼠随机分成6组,每组17只,前4组分别注射PBS(PBS对照组)、空载体(空载体对照组)、SAG1载体(SAG1组)、ROP18载体(ROP18组)各100μL,其余两组均注射SAG1与ROP18对半混合载体,分别注射量为200μL(全量混合组)、100μL(半量混合组),每组间隔2周免疫1次,共免疫3次。末次免疫4周后,各组随机取7只小鼠,无菌条件下取脾,流式细胞术检测小鼠脾脏CD4^(+)、CD8^(+)T细胞亚群分布,荧光定量PCR分析各组小鼠脾细胞中细胞因子白细胞介素(IL)-4、IL-12、干扰素γ(IFN-γ)的表达;每组其余10只小鼠腹腔接种1×103个弓形虫速殖子,观察各组小鼠的生存时间。结果各组小鼠脾脏CD4^(+)T细胞比例差异无统计学意义(P>0.05);与PBS对照组比较,SAG1组、ROP18组、全量混合组、半量混合组、空载体对照组CD8^(+)T细胞比例明显升高(P<0.01),半量混合组较其他组更高(P<0.05)。半量混合组、全量混合组CD4^(+)/CD8^(+)较两对照组(PBS对照组和空载体对照组)降低,差异有统计学意义(P<0.05)。全量混合组、半量混合组小鼠脾细胞中IL-12、IFN-γ相对表达水平与两对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),且半量混合组IFN-γ相对表达水平与ROP18组比较,差异有统计学意义(P<0.05),但各组间IL-4相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。弓形虫速殖子攻击感染小鼠试验中两单基因疫苗组(SAG1组和ROP18组)、全量混合组、半量混合组均较两对照组生存时间延长(P<0.05),且半量混合组较全量混合组生存时间也显著延长(P<0.01),但全量混合组与两单基因疫苗组差异无统计学意义(P>0.05) 展开更多

关键词 刚地弓形虫 速殖子表面抗原1 棒状体蛋白18 DNA疫苗

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弓形虫棒状体蛋白ROP18的优化表达 被引量：1

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作者 程正阳 苏蕊 +3 位作者 张贤 李叶林 朱万博 余莉 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2017年第4期345-349,共5页

目的构建弓形虫棒状体蛋白ROP18原核表达载体,并通过密码子优化等方法优化其表达。方法运用RT-PCR扩增ROP18基因,将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体,构建pGEX-ROP18重组质粒;运用OptigeneTM密码子优化分析平台对弓形虫ROP18编码基因进行... 目的构建弓形虫棒状体蛋白ROP18原核表达载体,并通过密码子优化等方法优化其表达。方法运用RT-PCR扩增ROP18基因,将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体,构建pGEX-ROP18重组质粒;运用OptigeneTM密码子优化分析平台对弓形虫ROP18编码基因进行优化,合成优化后的全长基因(ROP18u)并将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体,构建pGEX-ROP18u重组质粒;以优化后的ROP18u基因为模板,PCR扩增去除N端信号肽和前功能区序列的截短ROP18片段(ROP18uc),将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体,构建pGEX-ROP18uc重组质粒。所有重组质粒经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组蛋白,并进行Western blot鉴定。结果 pGEX-ROP18、pGEX-ROP18u和pGEX-ROP18uc于30℃诱导培养4h-6h,分别检测到分子质量约为88ku和77ku的重组蛋白,该蛋白能被GST单克隆抗体和ROP18多克隆抗体识别。结论成功构建了pGEX-ROP18、pGEX-ROP18u和pGEX-ROP18uc原核表达载体,密码子优化未能显著提高ROP18重组蛋白的表达量,但提高了可溶性蛋白的含量。 展开更多

关键词 弓形虫 ROP18 原核表达

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刚地弓形虫棒状体蛋白18和膜表面抗原30复合核酸疫苗对小鼠的免疫保护作用

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作者 姜文静 孟雅莉 +2 位作者 赵利娜 王春苗 张晓磊 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CSCD 北大核心 2023年第5期532-538,共7页

目的研究刚地弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)和膜表面抗原30(P30)复合核酸疫苗的免疫保护作用。方法PCR扩增弓形虫p30和rop18基因,构建pVAX1⁃p30、pVAX1⁃rop18⁃p30质粒并进行PCR鉴定、酶切鉴定、测序鉴定。用LipofectamineTM 3000转染试剂将... 目的研究刚地弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)和膜表面抗原30(P30)复合核酸疫苗的免疫保护作用。方法PCR扩增弓形虫p30和rop18基因,构建pVAX1⁃p30、pVAX1⁃rop18⁃p30质粒并进行PCR鉴定、酶切鉴定、测序鉴定。用LipofectamineTM 3000转染试剂将pVAX1(2μg)和pVAX1⁃rop18⁃p30质粒转染至HeLa细胞内,24 h后间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达情况。75只雌性BALB/c小鼠随机分为pVAX1⁃rop18⁃p30组、pVAX1⁃rop18组、pVAX1⁃p30组、pVAX1组和PBS组,每组15只,分别于股四头肌注射100μg(100μl)的pVAX1⁃rop18⁃p30、pVAX1⁃rop18(本实验室保存)、pVAX1⁃p30、pVAX1质粒或PBS(100μl),共免疫3次,间隔2周,末次免疫时质粒剂量为200μg。每次免疫前和末次免疫后2周采集小鼠血样,ELISA检测血清IgG抗体水平。末次免疫后2周每组取3只小鼠,无菌取脾细胞,培养后ELISA检测培养上清中γ干扰素(IFN⁃γ)和白细胞介素2(IL⁃2)、IL⁃4、IL⁃10、IL⁃12的水平。末次免疫后2周,每组取12只小鼠,每鼠腹腔注射1000个弓形虫RH株速殖子进行急性感染,记录小鼠存活时间,评价免疫保护性。组间比较采用单因素方差分析。结果弓形虫p30和rop18基因PCR扩增片段分别为789、1665 bp。pVAX1⁃rop18⁃p30质粒经PCR、酶切鉴定均获得预期大小的条带,测序鉴定结果正确。pVAX1⁃rop18⁃p30转染HeLa细胞后,胞质内可见黄绿色荧光,pVAX1转染的HeLa细胞内无黄绿色荧光。ELISA检测结果显示,末次免疫后2周,pVAX1⁃rop18⁃p30组吸光度(A450值)为0.788±0.025,高于pVAX1⁃rop18组(0.512±0.027)、pVAX1⁃p30组(0.498±0.027)、pVAX1组(0.122±0.014)和PBS组(0.109±0.011)(F=77.6,P<0.05),pVAX1⁃rop18组和pVAX1⁃p30组之间A450值差异无统计学意义(F=67.80,P>0.05);小鼠血清IgG抗体水平随着免疫次数的增加和时间延长而升高。末次免疫后2周,pVAX1⁃rop18⁃p30组小鼠脾细胞培养上清中IFN⁃γ、IL⁃2、IL⁃4、IL⁃10和IL⁃12的水平分� 展开更多

关键词 刚地弓形虫 棒状体蛋白18 膜表面抗原30 核酸疫苗 免疫保护

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弓形虫ROP18蛋白激酶在酵母中的表达纯化及激酶活性鉴定 被引量：1

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作者 侯永恒 郝桃方 +4 位作者 廖婉琴 杨兆收 潘爱华 吴忠道 周兴旺 《热带医学杂志》 CAS 2016年第6期687-690,共4页

目的建立利用酵母表达系统获得有较高激酶活性的弓形虫棒状体蛋白（ROP18）激酶的表达纯化方法。方法利用PCR技术从弓形虫基因组DNA扩增弓形虫ROP18基因,通过Gateway系统将ROP18基因克隆到酵母表达载体pEGH-A中。将表达载体pEGH-A-ROP1... 目的建立利用酵母表达系统获得有较高激酶活性的弓形虫棒状体蛋白（ROP18）激酶的表达纯化方法。方法利用PCR技术从弓形虫基因组DNA扩增弓形虫ROP18基因,通过Gateway系统将ROP18基因克隆到酵母表达载体pEGH-A中。将表达载体pEGH-A-ROP18转化至Y258酵母菌株中并诱导表达,表达产物纯化后通过SDS-PAGE进行纯度鉴定;最后通过激酶活性实验对纯化的重组蛋白进行激酶活性鉴定。结果构建了弓形虫ROP18激酶重组表达质粒pEGH-A-ROP18和pEGH-A-ROP18-KD,并成功在酵母表达系统表达弓形虫ROP18重组蛋白,其分子量约为8.2×10 4 Mr,SDS-PAGE蛋白电泳显示为单一条带,并具有较高的激酶活性。结论利用酵母细胞表达系统成功表达并纯化了有激酶活性的弓形虫ROP18蛋白激酶。 展开更多

关键词 弓形虫 ROP18 酵母表达 纯化 激酶活性

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刚地弓形虫强毒株棒状蛋白ROP18的克隆、表达和免疫反应性分析 被引量：10

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作者 张颖 张进顺 +3 位作者 贾晓辉 贾天军 卢致民 周芳 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期446-449,共4页

目的克隆、表达刚地弓形虫棒状体蛋白ROP18基因(TgROP18),并分析其免疫反应性。方法提取刚地弓形虫RH株基因组DNA,PCR扩增TgROP18基因。扩增产物经双酶切后连接入原核表达载体pET30a(+),重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),阳性菌落加入... 目的克隆、表达刚地弓形虫棒状体蛋白ROP18基因(TgROP18),并分析其免疫反应性。方法提取刚地弓形虫RH株基因组DNA,PCR扩增TgROP18基因。扩增产物经双酶切后连接入原核表达载体pET30a(+),重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),阳性菌落加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白TgROP18的表达情况。以鼠抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blot-ting)分析该重组蛋白的免疫反应性。结果 PCR扩增获得TgROP18基因,长约1 665 bp,编码554个氨基酸,其中前47个氨基酸构成信号肽序列。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET30a(+)-TgROP18构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)为59 800的可溶性重组蛋白TgROP18。Western blotting分析结果显示,该重组蛋白可被鼠抗刚地弓形虫的血清识别。结论重组蛋白TgROP18具有一定的免疫反应性。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 ROP18 原核表达

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