目的 克隆人腺病毒 3型 (Ad3)六邻体 - L 1(Hexon- L 1)、六邻体 - L 2 (Hexon- L 2 )区基因 ,构建含有该基因的重组质粒 ,并进行测序鉴定 ,为进一步构建表达载体 ,制备基因工程疫苗打下基础。方法 从 Ad3感染的 He L a细胞中提取 Ad3...目的 克隆人腺病毒 3型 (Ad3)六邻体 - L 1(Hexon- L 1)、六邻体 - L 2 (Hexon- L 2 )区基因 ,构建含有该基因的重组质粒 ,并进行测序鉴定 ,为进一步构建表达载体 ,制备基因工程疫苗打下基础。方法 从 Ad3感染的 He L a细胞中提取 Ad3DNA,用 PCR方法扩增 Hexon- L 1、Hexon- L 2基因 ,将得到的片段定向克隆到克隆载体 p U C19质粒中 ,对克隆片段进行 DNA测序鉴定。结果 构建了重组质粒 p UC19Hexon,测序结果与 Genebank中该序列进行同源性比较证明克隆的片段为 Ad3六邻体序列。结论 成功克隆了 Ad3的 Hexon- L 1、Hexon- L 2区基因。展开更多
建立一种简单的重组质粒构建方法——二步PCR,不需要限制性内切酶对基因和载体进行酶切.第一步常规PCR中,用正向引物(IF)和反向杂合引物(IR)扩增黑曲霉木聚糖酶Xyn基因,IF与基因特异性匹配,IR引物3’端与基因序列匹配、5’端含有19 bp p...建立一种简单的重组质粒构建方法——二步PCR,不需要限制性内切酶对基因和载体进行酶切.第一步常规PCR中,用正向引物(IF)和反向杂合引物(IR)扩增黑曲霉木聚糖酶Xyn基因,IF与基因特异性匹配,IR引物3’端与基因序列匹配、5’端含有19 bp p ET20b一端正链序列;第二步反向PCR中,以扩增的Xyn基因作为正向引物,其3’端含有19 bp与环状p ET20b模板退火、并在高保真Q5 DNA聚合酶作用下延伸,与模板另一端互补的反向引物VR协同作用,重组质粒通过PCR扩增出来.反向PCR产物经T4 DNA连接酶环化,并经Dpn I限制性内切酶消解处理,可以直接转化BL21(DE3)感受态细胞.用这种方法将622、639、1125、1209 bp大小的基因重组p ET20b中,显示出有较广泛的普适性.展开更多
文摘目的 克隆人腺病毒 3型 (Ad3)六邻体 - L 1(Hexon- L 1)、六邻体 - L 2 (Hexon- L 2 )区基因 ,构建含有该基因的重组质粒 ,并进行测序鉴定 ,为进一步构建表达载体 ,制备基因工程疫苗打下基础。方法 从 Ad3感染的 He L a细胞中提取 Ad3DNA,用 PCR方法扩增 Hexon- L 1、Hexon- L 2基因 ,将得到的片段定向克隆到克隆载体 p U C19质粒中 ,对克隆片段进行 DNA测序鉴定。结果 构建了重组质粒 p UC19Hexon,测序结果与 Genebank中该序列进行同源性比较证明克隆的片段为 Ad3六邻体序列。结论 成功克隆了 Ad3的 Hexon- L 1、Hexon- L 2区基因。
