融合PE38的抗CD70纳米抗体免疫毒素的制备及其对肾透明细胞癌786-O细胞的杀伤作用

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作者 徐新兰 刘畅 +2 位作者 张鑫 胡倩倩 李江伟 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期665-671,共7页

目的:构建靶向CD70分子的重组免疫毒素,通过表达、纯化制备PE38与抗CD70纳米抗体重组蛋白,体外抗肿瘤实验探究重组蛋白是否对高表达CD70分子的阳性肿瘤细胞具有杀伤活性。方法:通过基因工程手段,将CD70纳米抗体Nb 2B3基因片段通过一个... 目的:构建靶向CD70分子的重组免疫毒素,通过表达、纯化制备PE38与抗CD70纳米抗体重组蛋白,体外抗肿瘤实验探究重组蛋白是否对高表达CD70分子的阳性肿瘤细胞具有杀伤活性。方法:通过基因工程手段,将CD70纳米抗体Nb 2B3基因片段通过一个连接子与pET21a-PE38基因片段相连,获得重组表达载体pET21a-Nb 2B3-PE38并转入BL21(DE3)感受态细胞中进行表达、纯化与鉴定。用间接ELISA及FACS法检测Nb 2B3-PE38与CD70分子的结合活性,MTT法检测Nb 2B3-PE38对高表达CD70分子的肾透明细胞癌786-O细胞的体外杀伤活性,AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测Nb 2B3-PE38对786-O细胞凋亡的影响。结果:成功构建抗CD70纳米抗体重组免疫毒素Nb 2B3-PE38,纯化获得纯度>90%的重组蛋白,SDS-PAGE及WB检测结果表明目的蛋白正确表达,分子量为56000。纯化后的Nb 2B3-PE38能与重组CD70抗原及786-O细胞表面的CD70分子特异性结合;25μg/mL Nb 2B3-PE38即对786-O细胞产生极显著的杀伤作用(P<0.001),并且促进786-O细胞的细胞凋亡(P<0.01),其杀伤效应强于阳性对照顺铂(P<0.01)。结论:成功制备了特异性靶向CD70分子的免疫毒素Nb 2B3-PE38,其能够有效杀伤786-O细胞并诱导细胞凋亡且效果强于顺铂。 展开更多

关键词 CD70 铜绿假单胞杆菌外毒素 纳米抗体 PE38 重组免疫毒素 肾透明细胞癌 786-O细胞 细胞毒性 靶向治疗

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抗EpCAM免疫毒素制备与体外活性研究

2

作者 刘玉萍 邓昌平 +3 位作者 马兴元 刘秋丽 鲍雯 郑文云 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期10-19,共10页

目的:上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)在正常细胞中的表达局限于上皮基底外侧细胞,且具有隐蔽性,而在包括膀胱癌在内的多种上皮性癌症中过表达且处于易结合的状态,是抗肿瘤治疗的特异性有效靶标之一;以EpCA... 目的:上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)在正常细胞中的表达局限于上皮基底外侧细胞,且具有隐蔽性,而在包括膀胱癌在内的多种上皮性癌症中过表达且处于易结合的状态,是抗肿瘤治疗的特异性有效靶标之一;以EpCAM作为膀胱癌靶向治疗的靶点,探索高效、安全的膀胱癌新型治疗方法。方法:在分子水平利用柔性肽GGGGS将EpCAM单链抗体4D5MOCB与毒素PE38KDEL连接设计制备免疫毒素,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,并研究其与膀胱癌细胞的结合和对癌细胞生长的抑制作用。结果:4D5MOCB介导的免疫毒素具有良好的选择性,与EpCAM高表达的膀胱癌细胞5637结合良好,其结合率约为阴性细胞结合率的169倍,并能有效抑制癌细胞生长,IC50最低可达0.5 pmol/L,同时能够抑制细胞克隆形成和细胞迁移,诱导细胞凋亡;免疫毒素与EpCAM阴性细胞HeLa不结合,也不具有抑制细胞活性的作用。结论:制备的基因工程免疫毒素具有较好的选择性,能够有效抑制阳性癌细胞的增殖和转移,且比相同抗原的抗体药物偶联物(antibody-drug conjugates,ADC)的制备更简单,均一性更好,为免疫毒素应用于实体瘤的治疗提供了实验基础。 展开更多

关键词 重组免疫毒素 EPCAM 绿脓杆菌外毒素A 单链抗体 靶向治疗

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抗胶质瘤重组免疫毒素SZ39-PE40的原核表达、纯化及复性研究 被引量：3

3

作者 罗良生 王爱东 黄强 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期355-358,共4页

目的　构建抗胶质瘤重组免疫毒素SZ39 PE4 0基因并在大肠杆菌中表达。对主要以包涵体形式表达的产物进行变性和复性研究。方法　从质粒pVC85中克隆PE4 0基因 ,与抗胶质瘤的单链抗体 (ScFv) SZ39基因进行拼接 ,构建重组免疫毒素SZ39 PE... 目的　构建抗胶质瘤重组免疫毒素SZ39 PE4 0基因并在大肠杆菌中表达。对主要以包涵体形式表达的产物进行变性和复性研究。方法　从质粒pVC85中克隆PE4 0基因 ,与抗胶质瘤的单链抗体 (ScFv) SZ39基因进行拼接 ,构建重组免疫毒素SZ39 PE4 0基因 ,并在大肠杆菌中表达。对表达产物 (包涵体 )进行分离、纯化、变性及复性处理后 ,以ELISA及免疫荧光技术 ,检查其对胶质瘤细胞的结合活性。结果　SDS PAGE及Westernblot分析显示 ,表达产物的相对分子质量 (Mr)为 6 80 0 0左右 ,与SZ39 PE4 0融合蛋白的理论推算值相符。凝胶灰度扫描显示 ,其表达量占菌体总蛋白的 2 0 %。ELISA及免疫荧光技术均证实 ,经复性的SZ39 PE4 0融合蛋白具有结合胶质瘤细胞SHG 4的活性。结论成功地构建并在原核细胞中表达SZ39 PE4 0融合蛋白基因 ,复性的表达产物具有特异性识别胶质瘤细胞的活性 。 展开更多

关键词 胶质瘤 重组免疫毒素 变性 复性

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PE重组免疫毒素在肿瘤导向治疗中的应用 被引量：3

4

作者 张小平 杜冰 钱旻 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第z1期52-55,共4页

绿脓杆菌外毒素A(PE)经过修饰后失去了与细胞结合的能力,将单克隆抗体的Fv段或细胞因子作为导向分子与修饰后的PE通过DNA重组技术融合,获得重组的免疫毒素,这种免疫毒素通过导向分子将毒素带到靶细胞,并杀伤靶细胞,因而被广泛运用于肿... 绿脓杆菌外毒素A(PE)经过修饰后失去了与细胞结合的能力,将单克隆抗体的Fv段或细胞因子作为导向分子与修饰后的PE通过DNA重组技术融合,获得重组的免疫毒素,这种免疫毒素通过导向分子将毒素带到靶细胞,并杀伤靶细胞,因而被广泛运用于肿瘤的导向治疗。 展开更多

关键词 PE衍生物 导向分子 重组免疫毒素 导向治疗

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二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体与人嗜酸性细胞神经毒素重组免疫毒素融合基因的构建及表达 被引量：2

5

作者 付勇 刘彦仿 +3 位作者 赵君 杨守京 孙志伟 刘军 《西北国防医学杂志》 CAS 2004年第5期325-328,共4页

目的 :构建二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体 (hdsFv)与人嗜酸性细胞神经毒素 (hEDN)融合基因原核表达载体 ,并在大肠杆菌中表达。方法 :利用RCR的方法扩增hEDN基因 ,克隆入含抗肝癌hdsFv基因的TIH原核表达载体 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3... 目的 :构建二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体 (hdsFv)与人嗜酸性细胞神经毒素 (hEDN)融合基因原核表达载体 ,并在大肠杆菌中表达。方法 :利用RCR的方法扩增hEDN基因 ,克隆入含抗肝癌hdsFv基因的TIH原核表达载体 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)plyS后 ,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS -PAGE及Westen -blot分析及鉴定。结果 :成功构建了抗肝癌hdsFv -hEDN融合基因原核表达载体 ;SDS -PAGE和Westen -blot分析显示 ,诱导表达产物出现一条Mr约为 4 5 .0KD的新生蛋白带 ,表达量占菌体总蛋白量的 2 2 % ,主要以包涵体形式存在。结论 :抗肝癌hdsFv -hEDN重组免疫毒素融合基因的成功构建及表达 。 展开更多

关键词 肝细胞肝癌 核糖核酸酶 重组免疫毒素 单链抗体: 表达

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抗CEA免疫毒素的表达、纯化、复性与生物学活性的研究

6

作者 杨慧 何丹 +3 位作者 晁开 林晴 游松 黄华樑 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期348-351,共4页

以抗癌胚抗原 (Carcinoembryonicantigen ,CEA)单链抗体与假单胞菌外毒素 (PseudomonasexotoxinA ,PEA)的截短和修饰形式PE38 KDEL构建重组免疫毒素CEA PE38 KDEL ,并在大肠杆菌菌株BL2 1(DE3)_star中表达。采用镍离子螯合层析法纯化变... 以抗癌胚抗原 (Carcinoembryonicantigen ,CEA)单链抗体与假单胞菌外毒素 (PseudomonasexotoxinA ,PEA)的截短和修饰形式PE38 KDEL构建重组免疫毒素CEA PE38 KDEL ,并在大肠杆菌菌株BL2 1(DE3)_star中表达。采用镍离子螯合层析法纯化变性的包涵体样品 ,并用连续梯度透析的方法对纯化后的包涵体进行复性。采用流式细胞术鉴定复性产物与靶细胞的结合活性 ,结果表明免疫毒素CEA PE38 KDEL具有与靶细胞特异性结合的活性。以MTT法检测免疫毒素对肿瘤细胞的体外杀伤活性 ,结果表明该免疫毒素对SW1116和CNE_2细胞具有特异性杀伤活性。证明了经包涵体复性的抗CEA免疫毒素CEA PE38 KDEL对表达CEA抗原的肿瘤细胞具有良好的结合和杀伤活性。 展开更多

关键词 CEA 重组免疫毒素 亲和层析 蛋白复性 体外杀伤活性

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抗CML单链免疫毒素载体的构建、表达及活性鉴定 被引量：2

7

作者 朱小影 陶崑 +5 位作者 李身锋 张利军 李亚娟 王东 钟梁 冯文莉(指导) 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第12期1306-1311,共6页

目的:构建单链免疫毒素hscFv-ETA'的原核表达载体,经表达后鉴定其对CML细胞的特异性杀伤作用。方法:采用亚克隆技术,首先将hscFv与截短的假单胞菌外毒素基因ETA'通过酶切及连接反应,在载体pWW20上构建hscFvETA'单链免疫毒... 目的:构建单链免疫毒素hscFv-ETA'的原核表达载体,经表达后鉴定其对CML细胞的特异性杀伤作用。方法:采用亚克隆技术,首先将hscFv与截短的假单胞菌外毒素基因ETA'通过酶切及连接反应,在载体pWW20上构建hscFvETA'单链免疫毒素基因;再将其亚克隆入pET32a(+)原核表达载体中,转化BL21(DH3)宿主菌,IPTG诱导表达;SDS-PAGE观察其表达水平并建立目的蛋白的纯化方法,Western blot鉴定纯化的目的蛋白,FCM鉴定融合蛋白hscFv-ETA'与细胞结合的活性以及诱导细胞凋亡的能力。结果:限制性酶切图谱和序列分析证实,在pET32a(+)原核表达载体上成功地构建了hscFvETA'单链免疫毒素载体;该基因在pET32a(+)载体中获得高效表达,表达产物的相对分子质量与预期值相符;经Western blot鉴定证实纯化后的重组免疫毒素hscFv-ETA'融合蛋白是正确的;经FCM证实hscFv-ETA'蛋白能特异性结合CML细胞并诱导细胞凋亡。结论:已成功构建并原核表达单链免疫毒素hscFv-ETA',证明该蛋白能发挥特异性结合并诱导CML细胞凋亡。 展开更多

关键词 慢性粒细胞白血病 重组免疫毒素 克隆 原核表达 凋亡

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抗B7-H4-scFv/PE38KDEL重组免疫毒素的表达和功能性检测 被引量：2

8

作者 纪洪帅 郭锦瑞 +1 位作者 杨颖 毛伟平 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第3期354-361,366,共9页

目的:构建基于抗B7-H4单链抗体(sc Fv)的重组毒素anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,检测毒素蛋白的抗肿瘤作用。方法:通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术将anti-B7-H4-scFv基因和毒素PE38KDEL基因进行连接,重组基因克隆到原核表达载体pET28a(+)中表... 目的:构建基于抗B7-H4单链抗体(sc Fv)的重组毒素anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,检测毒素蛋白的抗肿瘤作用。方法:通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术将anti-B7-H4-scFv基因和毒素PE38KDEL基因进行连接,重组基因克隆到原核表达载体pET28a(+)中表达,蛋白经变复性和镍柱亲和层析(Ni-NTA)纯化后进行Western blot鉴定;间接ELISA和流式分析技术进行特异性鉴定。利用MTT法和皮下移植瘤模型实验,检测毒素对体外、内肿瘤细胞的抑制作用,并对肿瘤组织进行HE染色和免疫组化分析。结果:酶联后得到重组表达载体pET28a-anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,纯化后的毒素蛋白对肿瘤细胞具有一定杀伤力,并且在肿瘤模型实验中能抑制体内肿瘤的生长。结论:成功构建了基于抗B7-H4单链抗体的重组毒素表达体系,经鉴定重组毒素蛋白有良好的生物学功能活性和抗肿瘤活性。 展开更多

关键词 B7-H4 单链抗体 绿脓杆菌外毒素PE38KDEL 重组免疫毒素 靶向治疗

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去唾液酸糖蛋白受体单链抗体靶向蜂毒肽的体外抑瘤效应研究 被引量：1

9

作者 曹利民 赵晓蓉 +7 位作者 叶庆 雷萍 吴砂 代维 朱慧芬 朱荫昌 司进 沈关心 《医药导报》 CAS 2006年第7期639-641,共3页

目的探讨抗去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)单链抗体C1与蜂毒肽(Melittin)重组蛋白C1M靶向抑制肝癌细胞的效果。方法将含C1M/pGC的XL1-Blue转化菌通过IPTG诱导表达。表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,免疫组织化学技术分析重组蛋白C1M的抗原结... 目的探讨抗去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)单链抗体C1与蜂毒肽(Melittin)重组蛋白C1M靶向抑制肝癌细胞的效果。方法将含C1M/pGC的XL1-Blue转化菌通过IPTG诱导表达。表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,免疫组织化学技术分析重组蛋白C1M的抗原结合能力,四氮唑盐(MTT)法检测C1M对肝癌细胞株HepG2的增殖抑制作用。结果原核表达质粒C1M/pGC在XL1-Blue中获得有效表达;表达产物以可溶性形式存在;纯化的C1M相对分子量为29.4×103;免疫组化结果表明C1M能有效识别去唾液酸糖蛋白受体,与HepG2(C1M)共培养3d,细胞生长抑制率达92.0%。结论在大肠埃希菌中成功表达C1M,位于C端的Melittin蜂毒肽能有效抑制肿瘤细胞的生长,为体内研究Melittin的靶向抗肝癌效果奠定了基础。 展开更多

关键词 蜂毒肽 重组免疫毒素 单链抗体 肝癌细胞

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抗堆型艾美耳球虫子孢子ScFv-PE40重组毒素活性的测定 被引量：1

10

作者 王建永 赵月兰 秦建华 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期1208-1212,共5页

将诱导获得的可溶性表达产物抗堆型艾美耳球虫子孢子ScFv-PE40重组毒素,加入含有脱囊后的子孢子的1640培养液中,观察14h内活动的子孢子数目和活动性的变化,结果与对照组相比,加入重组毒素组的活动子孢子数目明显减少(P<0.05),活动性... 将诱导获得的可溶性表达产物抗堆型艾美耳球虫子孢子ScFv-PE40重组毒素,加入含有脱囊后的子孢子的1640培养液中,观察14h内活动的子孢子数目和活动性的变化,结果与对照组相比,加入重组毒素组的活动子孢子数目明显减少(P<0.05),活动性明显降低,提示重组毒素对鸡堆型艾美耳球虫子孢子具有较强的杀灭作用。从而为鸡堆型艾美耳球虫病的免疫控制研究提供技术手段和理论依据。 展开更多

关键词 堆型艾美耳球虫 PE40 重组免疫毒素 表达

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重组人白介素2-穿孔蛋白免疫毒素的制备及功能活性 被引量：1

11

作者 王一理 司履生 +3 位作者 耿宜萍 司华新 申文红 毕红 《西安医科大学学报》 CSCD 1997年第3期317-320,共4页

以人白细胞介素2为载体，人Perforin为毒素，利用基因工程技术构建成pBV221／IL2－Perforom表达质粒，在大肠杆菌中成功地表达出IL2－Perforin重组毒素，SDS－PAGE获得分子量的20KD的蛋白条带，细胞毒测定对活化的人T淋巴细胞和IL2依赖... 以人白细胞介素2为载体，人Perforin为毒素，利用基因工程技术构建成pBV221／IL2－Perforom表达质粒，在大肠杆菌中成功地表达出IL2－Perforin重组毒素，SDS－PAGE获得分子量的20KD的蛋白条带，细胞毒测定对活化的人T淋巴细胞和IL2依赖株CTLL2有明显的杀伤作用，并且明显抑制同种混合淋巴细胞反应，这是一种性质全新的重组毒素，其杀伤机制不同于以往所用的毒素（PE，DT等）。这种新的重组毒素不仅有益于器官移植，也可能对自身免疫病的治疗带来新的方法。 展开更多

关键词 重组毒素 IL2-Perforin 器官移植 免疫毒素

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大鼠IP-10-PE38KDEL重组免疫毒素原核表达载体的构建及表达 被引量：1

12

作者 林媛 祁志荣 +4 位作者 孙岚 李明远 蒋忠华 张林 李虹 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期5-8,共4页

目的构建大鼠γ干扰素诱导蛋白10(IP-10)基因和绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL基因的原核融合表达载体,并对其表达进行鉴定。方法通过PCR获得本实验所需要的IP-10基因片段,通过酶切含有PE38KDEL的质粒PRKL459K获得绿脓杆菌外毒素衍生物PE... 目的构建大鼠γ干扰素诱导蛋白10(IP-10)基因和绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL基因的原核融合表达载体,并对其表达进行鉴定。方法通过PCR获得本实验所需要的IP-10基因片段,通过酶切含有PE38KDEL的质粒PRKL459K获得绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建IP-10与PE38KDEL融合基因的原核表达载体pET-32a(+)-IP-10-PE38KDEL,重组质粒经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定证实构建成功后,转化感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western-blotting分析证实其相对分子质量和特异性。结果酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,IP-10-PE38KDEL融合基因被成功克隆入原核表达载体pET-32a(+),并在大肠杆菌中稳定表达,表达产物的相对分子质量与预期值相符,且所表达蛋白可被抗PE的特异性抗体识别。结论成功构建了原核表达载体pET-32a(+)-IP-10-PE38KDEL,其融合基因在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究其功能奠定了基础。 展开更多

关键词 IP-10 绿脓杆菌外毒素 重组免疫毒素 原核表达

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大鼠IP-10-PE38 KDEL重组免疫毒素真核表达载体的构建及表达 被引量：1

13

作者 孙岚 祁志荣 +5 位作者 张琴 林媛 李明远 张林 蒋忠华 李虹 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期482-485,共4页

目的构建大鼠干扰素诱导蛋白10(rIP-10)基因和铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)基因的真核融合表达载体,并研究其在NIH3T3细胞中的表达情况。方法通过PCR获得本实验需要的rIP-10基因片段,通过酶切原核表达载体PRKL459K-IL-4-PE38KDE... 目的构建大鼠干扰素诱导蛋白10(rIP-10)基因和铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)基因的真核融合表达载体,并研究其在NIH3T3细胞中的表达情况。方法通过PCR获得本实验需要的rIP-10基因片段,通过酶切原核表达载体PRKL459K-IL-4-PE38KDEL获得铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38KDEL基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建rIP-10与PE38KDEL融合基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rIP-10-PE38KDEL。重组质粒经限制性性内切酶,PCR及DNA序列测定证实构建成功后,用PolyFect脂质体转染NIH3T3细胞,然后用免疫荧光技术检测rIP-10-PE38KDEL融合蛋白在NIH3T3细胞的表达。结果酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,rIP-10-PE38KDEL融合基因被成功克隆入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+),免疫荧光技术检测证实重组基因可在NIH3T3细胞表达。结论rIP-10-PE38KDEL融合基因可在NIH3T3细胞中表达,为进一步研究其对自身免疫病的Th1细胞靶向毒性及临床应用奠定基础。 展开更多

关键词 rIP-10 PE38KDEL 重组免疫毒素 NIH 313细胞 真核表达

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抗柔嫩艾美耳球虫ScFv-PE40重组毒素的活性测定 被引量：1

14

作者 郝景锋 吴斌 +1 位作者 蔡华东 赵权 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2013年第3期27-29,共3页

本试验采用ScFv-PE40重组免疫毒素(构建重组毒素时使用的是pET28a(+)表达载体,因其表达的蛋白产物N末端包含His-Tag,因此采用金属Ni2+亲和层析柱方法纯化该目的蛋白)来免疫健康无球虫海蓝小公雏,免疫后通过盲肠病变记分,克盲肠内容物卵... 本试验采用ScFv-PE40重组免疫毒素(构建重组毒素时使用的是pET28a(+)表达载体,因其表达的蛋白产物N末端包含His-Tag,因此采用金属Ni2+亲和层析柱方法纯化该目的蛋白)来免疫健康无球虫海蓝小公雏,免疫后通过盲肠病变记分,克盲肠内容物卵囊数(OPG)、结合抗球虫指数(ACI)、增重等感染指标的测定,对重组免疫毒素对海蓝小公雏感染柔嫩艾美耳球虫的保护效果进行观察评价,为临床上控制鸡球虫病提供科学的依据。 展开更多

关键词 抗柔嫩艾美耳球虫 重组免疫毒素 活性测定

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堆型艾美耳球虫单链抗体-PE40重组免疫毒素的构建 被引量：1

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作者 顾小龙 秦建华 +4 位作者 赵月兰 左玉柱 康桂英 包永占 刘红彬 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期779-782,共4页

用HindⅢ对已构建的质粒pT-PE40和原核表达载体pET22-ScFv进行单酶切,回收纯化1 101 bp的PE40基因片段并将其亚克隆至pET22-ScFv载体中,构建重组免疫毒素表达质粒pET22-ScFv-PE40。将该质粒转化入感受态大肠杆菌J M109中增殖,提取质粒后... 用HindⅢ对已构建的质粒pT-PE40和原核表达载体pET22-ScFv进行单酶切,回收纯化1 101 bp的PE40基因片段并将其亚克隆至pET22-ScFv载体中,构建重组免疫毒素表达质粒pET22-ScFv-PE40。将该质粒转化入感受态大肠杆菌J M109中增殖,提取质粒后用SalⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定,得到了1 114 bp和6 181 bp目的基因片段。测序鉴定PE40的插入方向,选取以PE40基因5′端与ScFv基因3′端连接的重组质粒,构建了抗堆型艾美耳球虫重组免疫毒素质粒pET22-ScFv-PE40。抗堆型艾美耳球虫重组质粒pET22-ScFv-PE40经1 mmol/LIPTG诱导,在大肠杆菌中表达约68 000的目的蛋白。使用抗PE多克隆抗体对目的蛋白进行蛋白印迹分析,结果表达产物与抗PE多克隆抗体发生抗原抗体反应,证明融合基因得到表达。 展开更多

关键词 堆型艾美耳球虫 单链抗体 PE40 重组免疫毒素

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重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1对大鼠肾移植存活时间的影响 被引量：1

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作者 王儒鹏 何威 +3 位作者 刘树雷 贺伟峰 张小容 吴军 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期1014-1017,共4页

目的以人IL-2片段与植物毒素Luffin P1重组获得的免疫毒素hIL-2-Luffin P1,观察它对大鼠肾移植排斥反应的抑制作用。方法采用同种异体大鼠肾移植模型,观察hIL-2-Luffin P1对移植物存活的影响,以及移植物的组织病理学观察。结果hIL-2-Luf... 目的以人IL-2片段与植物毒素Luffin P1重组获得的免疫毒素hIL-2-Luffin P1,观察它对大鼠肾移植排斥反应的抑制作用。方法采用同种异体大鼠肾移植模型,观察hIL-2-Luffin P1对移植物存活的影响,以及移植物的组织病理学观察。结果hIL-2-Luffin P1组大鼠存活时间延长(13.86±2.11)d,与对照组比较相差显著(P<0.01);而Luffin P1处理组与对照组相比无明显差异。同时,病理结果显示对照组移植肾单位结构破坏,淋巴细胞浸润明显,而在同一时间hIL-2-Luffin P1处理组大鼠的移植肾脏病理变化较轻;T淋巴细胞亚群检测显示经hIL-2-Luffin P1处理后,受体外周血T细胞的活化程度降低。结论hIL-2-Luffin P1能够抑制免疫排斥反应,延长移植物存活时间。 展开更多

关键词 重组免疫毒素 肾移植 hIL-2-Luffin P1

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抗日本血吸虫单链抗体免疫毒素的构建 表达及生物学活性鉴定 被引量：1

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作者 李红 朱晓娟 +8 位作者 顾春艳 任勇亚 许静 王忠灿 李玉华 仇镇宁 朱进 冯振卿 管晓虹 《中国血吸虫病防治杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期117-121,共5页

目的构建抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4单链抗体和绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL的原核融合表达载体,并对其表达产物进行生物学活性鉴定。方法应用PCR方法体外扩增NP11-4VH、VL、scFv和PE38KDEL基因,经测序后将scFv及PE38KDEL基因通过... 目的构建抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4单链抗体和绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL的原核融合表达载体,并对其表达产物进行生物学活性鉴定。方法应用PCR方法体外扩增NP11-4VH、VL、scFv和PE38KDEL基因,经测序后将scFv及PE38KDEL基因通过限制性内切酶双酶切及连接反应,构建原核表达载体pBAD/gIIIA-scFv-PE38KDEL,转化E.coliTop10F′,L-阿拉伯糖诱导表达,表达产物经Western blot及ELISA鉴定其活性。结果构建了重组免疫毒素表达载体pBAD/gIIIA-scFv-PE38KDEL,诱导表达产物主要以包涵体形式存在,分子量约为70kD;经变性、复性后的重组免疫毒素与血吸虫可溶性虫卵抗原有较好的结合活性。结论构建及表达了抗日本血吸虫单链抗体免疫毒素,为血吸虫病治疗提供了一条新思路。 展开更多

关键词 日本血吸虫 SCFV PE38KDEL 重组免疫毒素

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一种新型重组免疫毒素DT390-Rantes真核表达质粒的构建及功能

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作者 贾怡 李虹 +4 位作者 陈文捷 吕梅励 李明远 蒋忠华 张林 《第一军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第11期1344-1347,共4页

目的构建一种新型重组免疫毒素DT390-Rantes的真核表达质粒,并对这种免疫毒素的功能进行初步研究。方法通过RT-PCR的方法,从小鼠肝脏中获得Rantes基因;将Rantes基因插入到含有DT390片段的真核质粒SRα中,构建成重组质粒;重组质粒转入大... 目的构建一种新型重组免疫毒素DT390-Rantes的真核表达质粒,并对这种免疫毒素的功能进行初步研究。方法通过RT-PCR的方法,从小鼠肝脏中获得Rantes基因;将Rantes基因插入到含有DT390片段的真核质粒SRα中,构建成重组质粒;重组质粒转入大肠杆菌JM109,筛选出含有正确插入片段的克隆;限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒,并进行DNA序列分析;用脂质体介导法转染NIH3T3细胞,免疫荧光检测重组质粒的表达情况;MTT法测定DT390-Rantes的表达活性。结果经过酶切分析及DNA测序证实,Rantes基因正确插入到真核表达质粒SRα中,并在NIH3T3细胞中表达;MTT法证实,重组免疫毒素DT390-Rantes能在体外杀伤活化的T细胞。结论成功地构建了一种新型重组免疫毒素真核表达质粒DT390-Rantes-SRα,该质粒可在真核细胞中瞬时表达,其转染上清对活化的T细胞具有杀伤作用。 展开更多

关键词 免疫毒素 RANTES DT390 真核表达

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mMIP-1α-DT390核酸制剂治疗实验性变态反应性脑脊髓炎的研究

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作者 吕梅励 李虹 +5 位作者 梁伟波 陈文捷 贾怡 李明远 蒋忠华 张林 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期775-778,共4页

目的新型重组免疫毒素mMIP-1α-DT390核酸制剂对实验性变态反应性脑脊髓炎治疗的效果研究。方法用MBP免疫C57BL/6小鼠诱发EAE,建立人多发性硬化症的动物模型。将构建的真核质粒SRα-mMIP-1α-DT390直接导入EAE模型小鼠C57BL/6肌肉,使重... 目的新型重组免疫毒素mMIP-1α-DT390核酸制剂对实验性变态反应性脑脊髓炎治疗的效果研究。方法用MBP免疫C57BL/6小鼠诱发EAE,建立人多发性硬化症的动物模型。将构建的真核质粒SRα-mMIP-1α-DT390直接导入EAE模型小鼠C57BL/6肌肉,使重组免疫毒素在其骨骼肌内高效表达。通过对模型小鼠的临床症状的评分、病理切片所显示的中枢神经系统炎症细胞浸润的情况及流式细胞技术检测的外周T细胞的动态变化等指标对核酸制剂的疗效进行评估。结果新型免疫毒素mMIP-1α-DT390核酸制剂治疗EAE模型小鼠,使小鼠临床症状得到改善:发病延迟、平均临床评分下降、症状严重程度降低;神经系统的病理切片显示治疗后小鼠的脑部活化的淋巴细胞浸润减轻;流式细胞仪检测结果显示治疗后小鼠外周血T细胞数量下降,而B淋巴细胞基本维持正常水平。结论所有检测指标均提示该免疫毒素mMIP-1α-DT390核酸制剂可有效的治疗自身免疫性疾病。 展开更多

关键词 实验性变态性脑脊髓炎 MIP-1Α DT 重组免疫毒素 T细胞

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抗肝癌单链免疫毒素hdsFv-RC-RNase的导向治疗作用

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作者 付勇 苏雪梅 +4 位作者 刘彦仿 赵君 杨守京 李锴男 邹赛英 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2006年第5期362-366,共5页

目的观察抗肝癌重组单链免疫毒素hdsFv-RC-RNase对荷人肝癌裸鼠移植瘤的导向治疗作用,并探讨其临床应用价值。方法将原核表达载体TIG-hdsFv-RC-RNase转化E.coliBL21(DE3)plys中,利用IPTG大量诱导表达抗肝癌hdsFv-RC-RNase重组单链免疫... 目的观察抗肝癌重组单链免疫毒素hdsFv-RC-RNase对荷人肝癌裸鼠移植瘤的导向治疗作用,并探讨其临床应用价值。方法将原核表达载体TIG-hdsFv-RC-RNase转化E.coliBL21(DE3)plys中,利用IPTG大量诱导表达抗肝癌hdsFv-RC-RNase重组单链免疫毒素。表达产物在非变性条件下经Ni-NTAAgarose亲合层析法纯化并体外复性,利用细胞ELISA法检测其特异性结合体外培养的人肝癌细胞的免疫活性。建立荷人肝癌裸鼠移植瘤动物模型,初步评估其对荷人肝癌裸鼠移植瘤的导向治疗作用。结果工程菌经IPTG诱导后,出现一条相对分子质量约为41000的新生蛋白带,且主要以可溶性形式表达。纯化后表达产物的纯度达到基本均一。细胞ELISA检测结果显示,纯化产物复性后能够与体外培养的人肝癌细胞特异性结合,而对正常肝细胞的结合能力非常弱,两者具有非常显著的差异(P<0.01)。导向治疗结果表明,其对荷人肝癌裸鼠移植瘤治疗有效率为100%,与生理盐水组相比具有非常显著的差异(P<0.01),抑瘤率达到79.38%。结论成功获得了特异性强的有活性的抗肝癌重组单链免疫毒素hdsFv-RC-RNase,其对荷人肝癌裸鼠移植瘤具有一定的导向治疗作用,可能成为抗肝癌导向治疗药物。 展开更多

关键词 肝细胞癌 重组免疫毒素 核糖核酸酶 导向治疗

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