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应用RNA干扰技术创造低脂肪氧化酶活性大豆新种质 被引量:13
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作者 马建 张君 +3 位作者 曲静 王云鹏 魏益凡 王丕武 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期3804-3811,共8页
【目的】通过RNA干扰技术抑制大豆籽粒中脂肪氧化酶基因表达,改良大豆品质,创造优良大豆新种质,探索大豆品质育种新途径。【方法】采用RT-PCR技术克隆大豆籽粒脂肪氧化酶基因(Lx1、Lx2、Lx3)核心保守序列357bp片段,通过重组PCR构建大豆... 【目的】通过RNA干扰技术抑制大豆籽粒中脂肪氧化酶基因表达,改良大豆品质,创造优良大豆新种质,探索大豆品质育种新途径。【方法】采用RT-PCR技术克隆大豆籽粒脂肪氧化酶基因(Lx1、Lx2、Lx3)核心保守序列357bp片段,通过重组PCR构建大豆脂肪氧化酶基因RNA干扰表达载体,利用花粉管通道法转化大豆品种吉农18。【结果】获得了12个转基因株系,其中10个株系发生明显变化,SDS-PAGE电泳和脂肪氧化酶活性测定表明转基因植株籽粒中脂肪氧化酶活性明显降低,平均减低64.2%;经近红外谷物分析仪测定,转基因植株脂肪含量平均提高0.8%~1.5%,总蛋白含量降低1.2%~3.0%;RT-PCR结果表明转基因株系中脂肪氧化酶mRNA积累受到明显抑制。转基因植株2代及3代检测结果表明,转基因植株脂肪氧化酶活性均明显降低,脂肪含量均有所提高。【结论】应用RNA干扰技术可有效的抑制大豆籽粒中脂肪氧化酶基因表达,降低脂肪氧化酶活性,提高大豆油份含量,改良大豆品质,创造优良大豆种质。 展开更多
关键词 大豆 种质资源 脂肪氧化酶 RNA干扰 重组pcr
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应用重组PCR技术构建人单链白细胞介素12融合基因 被引量:11
2
作者 张梅 司履生 王一理 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第1期22-26,共5页
目的构建人单链白细胞介素 12 (hsc IL- 12 )融合基因并在真核细胞中进行表达 ,为进一步研究 hsc IL- 12融合蛋白的生物学活性奠定基础。方法应用重组 PCR技术将 h IL - 12 p40和 p35亚单位两段编码序列的 c DNA通过一疏水性多肽接头 (G... 目的构建人单链白细胞介素 12 (hsc IL- 12 )融合基因并在真核细胞中进行表达 ,为进一步研究 hsc IL- 12融合蛋白的生物学活性奠定基础。方法应用重组 PCR技术将 h IL - 12 p40和 p35亚单位两段编码序列的 c DNA通过一疏水性多肽接头 (Gly4Ser) 3碱基序列进行前后拼接 (IL- 12 p40 -多肽接头 - p35 ) ,构建 hsc IL- 12融合基因 ,并进行核苷酸序列测定 ,进一步将 hsc IL - 12融合基因插入 pc DNA3.1真核表达载体中 ,转染 COS- 7细胞表达 hsc IL - 12融合蛋白 ,并行 Western blot分析。结果该融合基因经 DNA序列分析表明 :p40、p35、linker的连接顺序、方向及序列完全正确 ,融合基因可在 COS- 7细胞中表达hsc IL- 12融合蛋白。Western blot显示该融合蛋白分子量为 70 0 0 0 u,可与鼠抗人 IL- 12 p40 /p70单克隆抗体特异性结合。结论重组 PCR技术是十分有效。 展开更多
关键词 重组pcr 人白细胞介素12 人单链白细胞介素 融合基因
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应用重组PCR技术构建大豆脂肪氧化酶基因RNA干扰表达载体 被引量:10
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作者 马建 厉志 +1 位作者 刘艺苓 王丕武 《大豆科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期564-568,共5页
RNA干扰是近年来生物技术领域新兴的研究热点之一。在作物的研究中,RNA干扰被认为在作物品质改良中具有重要的应用价值,并已在水稻、小麦、玉米等作物中得到成功应用,但在大豆的研究中尚鲜有报道。在研究植物RNA干扰的实验中,构建相应的... RNA干扰是近年来生物技术领域新兴的研究热点之一。在作物的研究中,RNA干扰被认为在作物品质改良中具有重要的应用价值,并已在水稻、小麦、玉米等作物中得到成功应用,但在大豆的研究中尚鲜有报道。在研究植物RNA干扰的实验中,构建相应的RNA干扰表达载体是常用手段,但传统构建方法较费时费力。重组PCR是一种利用重叠延伸的方法进行高效和快速的体外基因片段拼接的PCR技术。研究将重组PCR技术应用于构建大豆脂肪氧化酶基因ihpRNA干扰表达载体,一方面探索一条更简便、快捷、适应范围更广泛的大豆基因RNA干扰表达载体构建方法,另一方面所构建的载体为进一步研究RNA干扰在大豆脂肪氧化酶改良中的应用奠定了基础。结果显示应用重组PCR技术构建大豆脂肪氧化酶基因RNA干扰表达载体是可行的,相比与常规方法此方法更简便、快捷、效率更高。 展开更多
关键词 重组pcr RNA干扰 脂肪氧化酶 表达载体
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转基因作物筛查用阳性质粒分子的构建及应用研究 被引量:9
4
作者 胡尚杰 吴刚 +2 位作者 武玉花 曹应龙 卢长明 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期173-179,共7页
通过分析全球商业化种植的转基因作物分子特征,选取常用的调控元件启动子CaMV35S、FMV35S和nos,终止子NOS、T-35S、g73′和E93′,标记基因bar、NPTII、hptII、pmi作为筛查靶标序列,通过重组PCR技术将这些元件克隆到双元载体pBI121上,构... 通过分析全球商业化种植的转基因作物分子特征,选取常用的调控元件启动子CaMV35S、FMV35S和nos,终止子NOS、T-35S、g73′和E93′,标记基因bar、NPTII、hptII、pmi作为筛查靶标序列,通过重组PCR技术将这些元件克隆到双元载体pBI121上,构建成包含11个转基因元件的通用阳性质粒分子pBI121-ELEMENTS。质粒序列信息已提交至GenBank并获得序列号HM047294。该质粒分子对目前国内外批准的5类主要转基因作物(大豆、油菜、玉米、棉花和水稻)理论筛查覆盖率达到91.5%,对我国批准进口的27种转基因作物的理论筛查覆盖率达100%。以pBI121-ELEMENTS为阳性对照,筛查7个转基因品系,结果显示该分子能够有效用于转基因作物定性筛查。 展开更多
关键词 转基因植物 筛查检测 阳性对照质粒 重组pcr
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应用体外重组PCR技术构建鸡单链抗体基因的研究 被引量:4
5
作者 陈红兵 许杨 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期175-178,共4页
用异硫氰酸胍与β_巯基乙醇联合变性的方法 ,从罗曼鸡脾脏中提取总RNA ,RNA样品经紫外检测后 ,A2 3 0=0 .0 715 ,A2 60 =0 .15 18,A2 80 =0 .0 793;根据莱航鸡免疫球蛋白的轻、重链可变区基因的骨架区 1和骨架区 4的序列 ,分别设计一对... 用异硫氰酸胍与β_巯基乙醇联合变性的方法 ,从罗曼鸡脾脏中提取总RNA ,RNA样品经紫外检测后 ,A2 3 0=0 .0 715 ,A2 60 =0 .15 18,A2 80 =0 .0 793;根据莱航鸡免疫球蛋白的轻、重链可变区基因的骨架区 1和骨架区 4的序列 ,分别设计一对引物 ,通过反转录_PCR方法 ,分别扩增出了罗曼鸡的轻、重链可变区基因 ,1.5 %的琼脂糖凝胶电泳图谱显示其大小分别约为 36 0bp和 4 2 0bp ;以VL 和VH 为模板 ,借助重组PCR手段 ,构建了VL_Linker_VH 形式的鸡单链抗体 ,1.5 %的琼脂糖凝胶电泳图谱显示出一条约 780bp区带。为进一步构建鸡的噬菌体抗体库和筛选特异性的鸡单链抗体打下了基础。 展开更多
关键词 重组pcr 单链抗体
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Gateway技术快速构建百合双价抗病毒RNAi表达载体 被引量:5
6
作者 徐品三 白建芳 +1 位作者 刘纪文 李焕改 《中国农学通报》 CSCD 北大核心 2011年第4期144-147,共4页
为获得适合转化百合的双价RNAi表达载体,以感病百合叶片的总RNA为模板,分别扩增400bp左右的LSV和LMoVCP基因。通过重叠延伸PCR技术获得长约800bp的LSV-LMoV融合基因。利用Gateway技术,通过BP反应及LR反应将LSV-LMoV融合基因克隆到双元载... 为获得适合转化百合的双价RNAi表达载体,以感病百合叶片的总RNA为模板,分别扩增400bp左右的LSV和LMoVCP基因。通过重叠延伸PCR技术获得长约800bp的LSV-LMoV融合基因。利用Gateway技术,通过BP反应及LR反应将LSV-LMoV融合基因克隆到双元载体pH7GWIWG2(Ⅱ),成功构建了含2种病毒基因的RNAi表达载体pH7GWIWG2(Ⅱ)-LSV-LMoV。将构建好的双价表达载体导入农杆菌EHA105,PCR和测序表明所构建的载体及获得的工程菌与预期的完全一致。 展开更多
关键词 百合无症病毒 百合斑驳病毒 RNAI载体 重叠延伸pcr GATEWAY技术
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抗水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的双价RNA沉默载体的构建 被引量:4
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作者 徐秋芳 张金凤 +2 位作者 张晓霞 熊如意 周益军 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2012年第2期290-295,共6页
为利用RNAi技术获取抗水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)植株,分别针对两种病毒的S6和S10基因构建RNA沉默载体。采用重组PCR方法将RBSDV S6基因片段(R6)和SRBSDVS6基因片段(SR6)进行融合,获得600 bp的R6-SR6融合基... 为利用RNAi技术获取抗水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)植株,分别针对两种病毒的S6和S10基因构建RNA沉默载体。采用重组PCR方法将RBSDV S6基因片段(R6)和SRBSDVS6基因片段(SR6)进行融合,获得600 bp的R6-SR6融合基因;将RBSDV S10基因片段(R10)和SRBSDV S10基因片段(SR10)进行融合,获得600 bp的R10-SR10融合基因。融合基因以反向重复的方式连入pBS载体,并定向插入到pCAMBIA1301载体上,获取了含有发夹结构的植物表达载体pCAMBIA1301-hp(R6-SR6)和pCAMBIA1301-hp(R10-SR10)。抗RBSDV和SRBSDV RNA沉默载体的构建为利用RNA沉默进行植物抗病毒研究奠定了基础。 展开更多
关键词 水稻黑条矮缩病毒 南方水稻黑条矮缩病毒 重组pcr 融合基因 RNA沉默载体
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玉米陈化关键酶基因Zmlox-2的RNA干扰载体的构建% 被引量:3
8
作者 韩颖 赵寿经 +2 位作者 杨瑜 孙尧 王乐 《华南理工大学学报(自然科学版)》 EI CAS CSCD 北大核心 2016年第3期136-141,共6页
脂肪酸氧化酶(LOX)催化不饱和脂肪酸过氧化反应,导致玉米(Zea mays L.)种子储藏品质的下降.为抑制玉米陈化关键酶基因Zmlox-2的表达,依据RNA干扰原理,针对玉米Zmlox-2基因进行克隆,采用重组PCR及酶切连接技术成功构建了Zmlox-2基因的RN... 脂肪酸氧化酶(LOX)催化不饱和脂肪酸过氧化反应,导致玉米(Zea mays L.)种子储藏品质的下降.为抑制玉米陈化关键酶基因Zmlox-2的表达,依据RNA干扰原理,针对玉米Zmlox-2基因进行克隆,采用重组PCR及酶切连接技术成功构建了Zmlox-2基因的RNA干扰植物表达载体,并将重组载体pRI101-on-Zmlox-2-RNAi通过热激转化法转化到根癌农杆菌中.实验结果表明Zmlox-2基因的RNA干扰表达载体构建正确,这为下一步诱导遗传转化、探索陈化酶基因的干扰表达效果奠定了理论和实验基础. 展开更多
关键词 生物工程 陈化 RNA干扰表达载体 重组pcr 脂肪酸氧化酶
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重组PCR技术的应用及优化 被引量:2
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作者 赵旵军 朱咸艳 +2 位作者 刘祥 阚显照 朱国萍 《激光生物学报》 CAS CSCD 2008年第3期355-362,共8页
重组PCR是通过DNA重叠序列的衔接作用,使多个DNA分子融合在一起的体外扩增技术。它使基因全序列的拼接、基因融合、基因破坏及启动子交换等DNA操作变得简单易行。如今重组PCR已成为DNA分析的有效利器。本研究通过重组PCR在分子进化、基... 重组PCR是通过DNA重叠序列的衔接作用,使多个DNA分子融合在一起的体外扩增技术。它使基因全序列的拼接、基因融合、基因破坏及启动子交换等DNA操作变得简单易行。如今重组PCR已成为DNA分析的有效利器。本研究通过重组PCR在分子进化、基因敲除及基因敲入、启动子研究和转基因植物转化载体的构建等方面的实际应用,分析了该技术的影响因素,并针对引物设计、DNA碱基重叠长度、温度参数等重要反应条件提出了优化方案。 展开更多
关键词 重组pcr 重叠序列 基因敲除 基因敲入 优化
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人巨细胞病毒重组基因表达质粒的构建 被引量:3
10
作者 郑育声 谢琪璇 +2 位作者 潘善培 芦春斌 肖銮娟 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期716-718,共3页
目的 用基因工程技术克隆人巨细胞病毒 (Humancytomegalovirus ,HCMV)中抗原性较强的蛋白片段—gp5 2C末端和pp15 0C末端的DNA序列 ,插入pPIC9K质粒 ,构建适于酵母表达系统的重组表达质粒。方法 根据人巨细胞病毒糖蛋白gp5 2和磷酸蛋... 目的 用基因工程技术克隆人巨细胞病毒 (Humancytomegalovirus ,HCMV)中抗原性较强的蛋白片段—gp5 2C末端和pp15 0C末端的DNA序列 ,插入pPIC9K质粒 ,构建适于酵母表达系统的重组表达质粒。方法 根据人巨细胞病毒糖蛋白gp5 2和磷酸蛋白pp15 0C末端的cDNA序列 ,设计出 2对引物。利用PCR的方法 ,以病毒培养液上清为模板 ,进行二轮PCR扩增 ,把两个目的基因串联在一起 ,将所得的DNA片段经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后用T4连接酶与pPIC9K质粒进行连接 ,然后导入大肠杆菌DH5α ,筛选出阳性转化子 ,并用PCR和双酶切鉴定阳性重组子。结果 从人巨细胞病毒培养液上清中扩增出目的基因 ,PCR反应和双酶切鉴定结果与预期相符。 展开更多
关键词 基因表达 人巨细胞病毒 重组pcr 质粒pPIC9K
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内置式佐剂LTB对空肠弯曲菌重组蛋白疫苗免疫增强作用的研究 被引量:3
11
作者 王法权 刘琳琳 《山东医学高等专科学校学报》 2012年第1期12-14,共3页
目的构建空肠弯曲菌(CJ)外膜蛋白(PEB1)及大肠埃希菌LTB融合疫苗并研究其免疫原性。方法应用重组PCR技术将PEB1和LTB序列连接,构建PEB1-LTB融合基因,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化入大肠埃希菌BL21,SDS-PAGE电泳表达,Western印迹... 目的构建空肠弯曲菌(CJ)外膜蛋白(PEB1)及大肠埃希菌LTB融合疫苗并研究其免疫原性。方法应用重组PCR技术将PEB1和LTB序列连接,构建PEB1-LTB融合基因,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化入大肠埃希菌BL21,SDS-PAGE电泳表达,Western印迹检测表达蛋白的抗原性。肌注方式免疫小鼠,末次免疫2周后,测定小鼠血清中IgG、IgA及黏膜冲洗液中sIgA抗体水平。结果 PCR扩增分别获得约787、372bp产物,二者融合后获得一约1180bp目的基因;该重组蛋白可具有良好的免疫原性,肌注小鼠后其血清IgG、IgA及黏膜冲洗液中sIgA含量均显著增高(P<0.01)。结论构建PEB1-LTB融合蛋白可有效增强小鼠免疫应答水平。 展开更多
关键词 重组pcr 空肠弯曲菌 大肠埃希菌 不耐热肠毒素 融合基因
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抗菌肽MagaininⅡ单链抗体基因的构建及其表达 被引量:2
12
作者 胡泰山 陈海旭 +4 位作者 杨运桂 钱友存 陈登鸿 屈贤铭 杨胜利 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 2000年第4期317-320,共4页
目的将克隆的抗体轻重链可变区基因拼接成单链抗体基因并将其在大肠杆菌中表达。方法通过RT—PCR从两株抗MagaininⅡ杂交瘤细胞株 (2D1 ,3F8)中克隆出VH 和VL 基因 ,然后利用重组PCR技术 ,将VH 和VL 基因通过柔性肽段(GLY4Ser)3 的Linke... 目的将克隆的抗体轻重链可变区基因拼接成单链抗体基因并将其在大肠杆菌中表达。方法通过RT—PCR从两株抗MagaininⅡ杂交瘤细胞株 (2D1 ,3F8)中克隆出VH 和VL 基因 ,然后利用重组PCR技术 ,将VH 和VL 基因通过柔性肽段(GLY4Ser)3 的Linker拼接成单链抗体基因(ScFv) ,将ScFv克隆到表达载体 pCANTAB5E上并将其分别在大肠杆菌E.coliHB2151及TG1 中进行表达。结果SDS PAGE和Western blot分析表明 ,ScFv在大肠杆菌E.coliHB2151中得到了分泌表达。间接ELISA结果显示可溶性ScFv及其表面展示噬菌体均具有抗原结合活性。结论成功地获得了ScFv 2D1和ScFv 3F8基因并在大肠杆菌中得到了功能性表达 ,为新型抗菌肽的设计打下了基础。 展开更多
关键词 MagaininⅡ 重组pcr 单链抗体 分泌表达 抗菌肽
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白蚁纤维素酶结构域重组研究 被引量:2
13
作者 刘慧琳 曹以诚 +2 位作者 杨磊 黄昱阳 曾炳佳 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期152-154,共3页
对来源于白蚁Nasutitermes takasagoensis的纤维素酶NtEG和来源于Thermomonospora fusca的耐热性纤维素酶E4进行同源建模和序列比较,利用重组PCR技术将E4的结合域与NtEG的催化域进行结构域重组,形成重组纤维素酶。并将得到的重组体置于... 对来源于白蚁Nasutitermes takasagoensis的纤维素酶NtEG和来源于Thermomonospora fusca的耐热性纤维素酶E4进行同源建模和序列比较,利用重组PCR技术将E4的结合域与NtEG的催化域进行结构域重组,形成重组纤维素酶。并将得到的重组体置于毕氏酵母X33中表达并检测其催化效率。结果表明:重组纤维素酶的相对分子质量约为59 ku;用羧甲基纤维素法、滤纸法、微晶纤维素测得重组纤维素酶的活性分别为17.1、5.4、4.6 U/mL;重组纤维素酶可在毕赤酵母中成功表达。 展开更多
关键词 重组纤维素酶 催化域 结合域 重组pcr
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应用PCR重组技术构建大肠杆菌分泌型表达载体 被引量:1
14
作者 黄仪秀 陈杰鹏 +3 位作者 毕群 李斯明 张磊 朱圣庚 《生物化学杂志》 CSCD 1995年第6期642-645,共4页
应用PCR重组技术,对大肠杆菌分泌型表达载体pIN-ⅢompA进行改建,除去原载体的HindⅢ位点,将信号肽序列末端两个密码子CAGGCC改为CAAGCT,从而引入一个新的HindⅢ位点,并在其下游接上一段多克隆位点... 应用PCR重组技术,对大肠杆菌分泌型表达载体pIN-ⅢompA进行改建,除去原载体的HindⅢ位点,将信号肽序列末端两个密码子CAGGCC改为CAAGCT,从而引入一个新的HindⅢ位点,并在其下游接上一段多克隆位点序列。改建后的载体可用于直接插入外源DNA编码序列,表达产物在分泌过程中被切除信号肽而成为天然有活性的蛋白质,操作十分简便。 展开更多
关键词 大肠杆菌 分泌型表达载体 聚合酶链反应
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小鼠免疫抑制蛋白SOCS3脯氨酸富集区为其生物学功能所必需 被引量:2
15
作者 李海洁 曾彬 +3 位作者 张灼寒 王丽娜 张竹红 杨荣存 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期432-438,共7页
SOCS3(suppressors of cytokine signaling 3)可以调节信号转导过程并影响造血干细胞的分化.利用生物信息学方法,发现SOCS3蛋白含有脯氨酸富集区,采用重组PCR技术缺失SOCS3蛋白中的129-161位的氨基酸(SOCS3Δ129-161),并将其克隆到p... SOCS3(suppressors of cytokine signaling 3)可以调节信号转导过程并影响造血干细胞的分化.利用生物信息学方法,发现SOCS3蛋白含有脯氨酸富集区,采用重组PCR技术缺失SOCS3蛋白中的129-161位的氨基酸(SOCS3Δ129-161),并将其克隆到pcDNA31/V5质粒载体中.转染细胞,然后通过流式细胞技术,分析预测的功能区对SOCS3蛋白功能的影响.结果表明,此脯氨酸富集区对SOCS3蛋白的三级结构和功能有重要的意义.建模结果显示,SOCS3Δ129-161蛋白结构发生显著变化.脯氨酸富集区的缺失也影响小鼠骨髓细胞向CD8^+T细胞分化.研究结果显示,SOCS3蛋白中129-161位的脯氨酸富集区在其结构和功能上有重要的作用. 展开更多
关键词 SOCS3 蛋白三级结构建模 重组pcr 流式分析
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利用重组PCR技术构建大肠杆菌肠毒素LT_B0ST_I融合基因 被引量:1
16
作者 王莹 周智爱 +1 位作者 李震 曹祥荣 《上海农业学报》 CSCD 2001年第1期39-44,共6页
利用重组PCR技术将从原始菌种中扩增得到的LTB、STI 基因片段连接起来 ,构建了LTB STI 融合基因。并将其克隆到 pUCm T载体上 ,转化到大肠杆菌DH5α中 ,得到克隆T LS ,序列分析表明该克隆具有正确的基因序列和阅读框 ,具有起始密码子AT... 利用重组PCR技术将从原始菌种中扩增得到的LTB、STI 基因片段连接起来 ,构建了LTB STI 融合基因。并将其克隆到 pUCm T载体上 ,转化到大肠杆菌DH5α中 ,得到克隆T LS ,序列分析表明该克隆具有正确的基因序列和阅读框 ,具有起始密码子ATG和终止密码子TAA 。 展开更多
关键词 产肠毒素性大肠杆菌 耐热性肠毒素 重组pcr LTB-STI融合基因
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应用体外重组PCR技术构建Ppdc-ldh融合基因 被引量:2
17
作者 高年发 王勇 +2 位作者 高强 张健 张淼 《中国酿造》 CAS 北大核心 2009年第6期28-31,共4页
利用重组PCR技术连接分别从干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC334中扩增的乳酸脱氢酶基因(ldh)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)CP4中扩增的丙酮酸脱羧酶基因启动子(Ppdc)片段,构建了Ppdc-ldh融合基因。并将其克隆到pMD19-T载体... 利用重组PCR技术连接分别从干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC334中扩增的乳酸脱氢酶基因(ldh)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)CP4中扩增的丙酮酸脱羧酶基因启动子(Ppdc)片段,构建了Ppdc-ldh融合基因。并将其克隆到pMD19-T载体上,再转化到大肠杆菌DH5α中,得到阳性克隆质粒pT-Ppdc-ldh。序列分析表明该克隆具有正确的基因序列和阅读框,具有起始密码子GTG和终止密码子TAA,启动子的-35区和-10区序列与起始密码子之间的距离没有改变,可以插入到原核表达载体中进行表达。 展开更多
关键词 重组pcr Ppdc-ldh融合基因 干酪乳杆菌 运动发酵单胞菌
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A Novel Method for Conversion of Valuable BDS Intermediates HPBS/Cx-HPBS from DBT/Cx-DBT 被引量:1
18
作者 BoYU JianHUANG +4 位作者 XiaoFengCAI XiaoYongLIU CuiQingMA FuLiLI PingXU 《Chinese Chemical Letters》 SCIE CAS CSCD 2005年第7期935-938,共4页
A simple recombinant PCR method was used to delete the dszB gene responsible for the slowest step of the Dsz pathway and allow the accumulation of hydroxyphenyl benzene sulfinate (HPBS) in the recombinant E. coli. Usi... A simple recombinant PCR method was used to delete the dszB gene responsible for the slowest step of the Dsz pathway and allow the accumulation of hydroxyphenyl benzene sulfinate (HPBS) in the recombinant E. coli. Using GC/MS, HPBS accumulation was confirmed. The recombinant E. coli could also desulfurize Cx-DBT to corresponding Cx-HPBS. The result gave a new insight to BDS process and explored a new method to obtain valuable surfactants from cheap raw materials. 展开更多
关键词 BIODESULFURIZATION BIOSURFACTANT recombinant pcr.
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人α-防御素-1基因与J链基因的融合及其表达载体的构建 被引量:2
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作者 白晓东 刘贤华 +1 位作者 仝青英 张韶峰 《中华医院感染学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期263-266,共4页
目的本研究旨在将α-防御素-1(HNP-1)基因与J链基因进行融合使其成为融合基因J-HNP-1。方法从pCH-J质粒中扩增出J链;从pBabeNeo-HNP-1质粒中扩增出HNP-1;然后以它们的自身产物为模板,进行重组PCR,获取J-HNP-1 DNA片段,并插入编码双重报... 目的本研究旨在将α-防御素-1(HNP-1)基因与J链基因进行融合使其成为融合基因J-HNP-1。方法从pCH-J质粒中扩增出J链;从pBabeNeo-HNP-1质粒中扩增出HNP-1;然后以它们的自身产物为模板,进行重组PCR,获取J-HNP-1 DNA片段,并插入编码双重报告基因Myc和6个多聚组氨酸(His)的哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-HisC中,构建出C端带Myc和6×His的rpcDNA3.1(-)/Myc-HisC/J-HNP-1。结果经过重组得到的融合基因J-HNP-1的目的片段为786 bp,与预测相符。结论杀菌分子J-HNP-1的重组和哺乳动物细胞表达载体的构建,为进一步进行抗菌肽的研究及制备奠定了基础。 展开更多
关键词 重组pcrI抗菌肽 J链 α-防御素-1
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大肠杆菌glgC基因的定点突变及功能分析 被引量:1
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作者 周爽 许可 +1 位作者 何明雄 张义正 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期1372-1378,共7页
利用PCR从Escherichia coli JM109基因组中扩增到全长为1296bp的glgC基因编码区,通过PCR重组方法进行点突变,获得氨基酸突变的3个突变体,分别是Pro295Ser(Val121Ala,Met151Ile和Val334Asp)、Gly336Asp单点突变和Pro295Ser/Gly336Asp(Lys... 利用PCR从Escherichia coli JM109基因组中扩增到全长为1296bp的glgC基因编码区,通过PCR重组方法进行点突变,获得氨基酸突变的3个突变体,分别是Pro295Ser(Val121Ala,Met151Ile和Val334Asp)、Gly336Asp单点突变和Pro295Ser/Gly336Asp(Lys109Arg),其基因分别命名为295+3、336和295/336+1。将突变和未突变的基因分别克隆到pET32-a,构建重组质粒pET-glgC、pET-295+3、pET-336和pET-295/336+1,在文中分别简称为a、b、c和d。转化大肠杆菌BL21(DE3),在1mmol/L IPTG诱导下表达。SDS-PAGE电泳分析显示,在约67kDa处有1条明显与预期大小一致的蛋白质,表明目的基因已得到融合表达。上述转化子的碘染和糖原含量测定结果,第336位的Gly变成Asp后,宿主菌的糖原含量提高;Pro295Ser/Gly336Asp(Lys109Arg)的突变导致宿主菌的糖原含量与Gly336Asp突变体相近,表明在336突变基因的基础上增加Pro295Ser的突变没有进一步加大宿主菌中AGPase酶的反馈抑制效应的降低。已有的结果显示,Pro295Ser可以降低AGPase酶的反馈抑制效应活性,而实验中295+3突变基因转入宿主菌后细胞糖原含量明显降低,推测这个结果可能是295+3中的Val334Asp的突变造成,而334位的氨基酸可能是AGPase功能域中的一个重要位点。 展开更多
关键词 glgC基因 定点突变 重组pcr 原核表达:功能分析
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