基因重组HBV联合表达反义RNA和显性阴性突变体抗HBV作用及HBV包装细胞系的构建 被引量：12

1

作者 孙殿兴 胡大荣 +3 位作者 邬光惠 胡学玲 100700 李娟 范公忍 《中华肝脏病杂志》 CAS CSCD 2002年第4期260-265,共6页

目的 探讨HBV作为基因治疗载体的可能性并检验其联合表达反义RNA和显性阴性突变体抗HBV的作用。方法 在表达完整HBV颗粒的质粒上,经基因修饰后联合表达S区反义RNA和核心-P蛋白的融合蛋白,整合于具有HBV复制的2.2.15细胞,形成细胞克隆,EL... 目的 探讨HBV作为基因治疗载体的可能性并检验其联合表达反义RNA和显性阴性突变体抗HBV的作用。方法 在表达完整HBV颗粒的质粒上,经基因修饰后联合表达S区反义RNA和核心-P蛋白的融合蛋白,整合于具有HBV复制的2.2.15细胞,形成细胞克隆,ELISA 法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg,斑点杂交法检测细胞内HBV核壳中HBV DNA,PCR检测上清液中重组HBV颗粒。HBV全基因经删除包装信号ε区后,插入到G418抗性PCI-neo载体,转染HepG2细胞系,用G418筛选形成细胞克隆,检测表达HBsAg及HBcAg较多者作为HBV包装细胞系,进一步转染表达复制缺损型HBV的质粒,经两种抗生素同时筛选,PCR方法观察上清液中的病毒。结果 2.2.15-pMEP4组、2.2.15-CP组、2.2.15-SAS组和2.2.15-CPAS组,对HBsAg平均抑制率分别为2.74％±3.83％、40.08％±2.05％（t=35.5,P<0.01）、66.54％±4.45％（t=42.3,P<0.01）和73.68％±5.07％（t=51.9,P<0.01）;对HBeAg平均抑制率分别为4.46％±4.25％、52.86％±1.32％（t=36.2,P<0.01）、26.36％±1.69％（t=22.3,P<0.01）和 59.28％±2.10％（t=39.0,P<0.01）;对 HBV复制的抑制率分别为0、82.0％、59.9％和96.6％。在各治疗组培养上清液中均能检测出重组HBV颗粒。证明包装细胞系具有HBSAg和HBcAg表达。 展开更多

关键词 基因重组 HBV 反义RNA 显性阴性突变体 包装细胞系 基因治疗

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大鼠前脑啡肽原基因逆转录病毒表达载体及产毒细胞系的建立 被引量：7

2

作者 臧卫东 赵青赞 +2 位作者 王天云 柴玉荣 薛乐勋 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2006年第1期122-124,共3页

目的:构建大鼠前脑啡肽原基因(pENK)逆转录病毒载体,获得携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法:应用RT-PCR方法获得大鼠pENK基因,HindⅢ、ClaⅠ双酶切后,同相应双酶切的pLNCX2载体大片段连接,构建成pENK基因逆转录病毒载体pLNCX2-pENK。... 目的:构建大鼠前脑啡肽原基因(pENK)逆转录病毒载体,获得携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法:应用RT-PCR方法获得大鼠pENK基因,HindⅢ、ClaⅠ双酶切后,同相应双酶切的pLNCX2载体大片段连接,构建成pENK基因逆转录病毒载体pLNCX2-pENK。然后用脂质体法将该载体转染PT67细胞,G418筛选,并进行滴度测定。结果与结论:成功地构建了pLNCX2-pENK载体,获得8×108CFU/L的产毒细胞系。成功建立了携带pENK的高滴度逆转录病毒产毒细胞系。 展开更多

关键词 镇痛 脑啡肽 逆转录病毒载体 包装细胞系

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基于人免疫缺陷病毒-1的慢病毒载体系统研究进展 被引量：1

3

作者 高强 刘珠果 +1 位作者 陈红星 邓继先 《生物技术通讯》 CAS 2007年第1期122-124,共3页

慢病毒能够感染分裂细胞和非分裂细胞,因而被发展成为重要的转基因载体。慢病毒载体已经发展到了第三代,其安全性已经大为提高。经过结构优化的慢病毒载体已经用于转基因动物生产和基因治疗研究,而稳定包装细胞系的建立使得慢病毒的生... 慢病毒能够感染分裂细胞和非分裂细胞,因而被发展成为重要的转基因载体。慢病毒载体已经发展到了第三代,其安全性已经大为提高。经过结构优化的慢病毒载体已经用于转基因动物生产和基因治疗研究,而稳定包装细胞系的建立使得慢病毒的生产更为简便。 展开更多

关键词 慢病毒载体 生物安全性 包装细胞系 转基因动物 基因治疗

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牛泡沫病毒BFV3026细胞感染性的确立及包装细胞系的建立 被引量：1

4

作者 余荭 孔晓红 +3 位作者 李汀 马永钢 陈启民 耿运琪 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期330-335,共6页

分别将牛泡沫病毒BFV3026接种于胎牛肺细胞(FBL)、牛肺细胞系(BL12)、新生牛肾细胞(NBK)、兔肺细胞(RL)、人乳腺癌上皮细胞(MCF)、293T、HeLa、CV-1、CHO等9种细胞,通过对它们及其传代细胞的病变观察与RT-PCR检测,确立BFV3026对这9种细... 分别将牛泡沫病毒BFV3026接种于胎牛肺细胞(FBL)、牛肺细胞系(BL12)、新生牛肾细胞(NBK)、兔肺细胞(RL)、人乳腺癌上皮细胞(MCF)、293T、HeLa、CV-1、CHO等9种细胞,通过对它们及其传代细胞的病变观察与RT-PCR检测,确立BFV3026对这9种细胞的感染。并以BFV3026原病毒DNA为模板,通过PCR构建以pcD NA3 1(-)为载体的gag-pol、env真核表达质粒共转染BL12细胞,经G418持续筛选,获得8个NeoR细胞克隆。RT-PCR及包装实验证实:其中7个细胞克隆能有效行使包装辅助功能。 展开更多

关键词 牛泡沫病毒 BFV3026细胞 感染性 包装细胞系

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人神经元素3基因重组逆转录病毒表达载体的构建及其包装细胞株的建立 被引量：2

5

作者 楚元奎 吕长荣 +2 位作者 陈冬梅 曹晖 窦忠英 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期448-453,共6页

为构建表达人神经元素3基因(neurogenin 3,ngn3)的重组逆转录病毒载体,建立稳定表达ngn3的包装细胞株,本研究以流产人胎儿胰腺组织为材料,通过RT-PCR方法克隆出人ngn3基因,将其连接到pMD18-T载体上并测序,结果表明,测序得到的基因序列... 为构建表达人神经元素3基因(neurogenin 3,ngn3)的重组逆转录病毒载体,建立稳定表达ngn3的包装细胞株,本研究以流产人胎儿胰腺组织为材料,通过RT-PCR方法克隆出人ngn3基因,将其连接到pMD18-T载体上并测序,结果表明,测序得到的基因序列与发表的人ngn3基因序列(GenBank Accession No.BC126468)完全一致。将EcoRI和HpaI双酶切后的基因片段构建到pMSCV-neo逆转录病毒载体中,酶切鉴定结果表明,pMSCV-ngn3重组逆转录病毒载体构建成功。脂质体法将pMSCV-ngn3重组载体导入PT67包装细胞,G418筛选后,对得到的细胞株进行RT-PCR和免疫组化检测,结果显示,该细胞株在mRNA水平和蛋白水平均稳定表达Ngn3;收集该细胞株的培养上清液,进行RT-PCR检测及电镜观察,结果表明,该细胞株将导入的重组逆转录病毒载体pMSCV-ngn3包装成了具有感染性的病毒颗粒,并将其释放到了培养上清液中。以上结果表明PT67-ngn3包装细胞株建立成功。该细胞株的成功建立,为下一步将ngn3基因应用于提高人胎儿胰腺祖细胞诱导分化效率方面的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 人 神经元素3基因 逆转录病毒载体 包装细胞株

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过表达FGFR2重组HEK293细胞株的构建和鉴定 被引量：2

6

作者 欧阳曼 王海龙 +2 位作者 赵影 李小燕 陈小佳 《中国医药工业杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期38-42,共5页

构建含有成纤维细胞生长因子受体蛋白2(FGFR2)基因序列的重组慢病毒表达载体,与慢病毒包装质粒共转染包装细胞293T,获得过表达FGFR2的重组病毒颗粒;用重组病毒颗粒感染人胚肾细胞(HEK)293细胞,并用嘌呤霉素(20?g/ml)进行筛选,最终获得... 构建含有成纤维细胞生长因子受体蛋白2(FGFR2)基因序列的重组慢病毒表达载体,与慢病毒包装质粒共转染包装细胞293T,获得过表达FGFR2的重组病毒颗粒;用重组病毒颗粒感染人胚肾细胞(HEK)293细胞,并用嘌呤霉素(20?g/ml)进行筛选,最终获得过表达FGFR2的重组细胞株。蛋白质免疫印迹(Western Blot)试验结果显示,该重组细胞株与空白对照HEK293细胞相比能高表达FGFR2,实时荧光定量核苷酸扩增试验(QPCR)和酶联免疫反应(ELISA)检测结果表明FGFR2蛋白下游相关通路的u PA等分子的转录和分泌水平上调,克隆形成试验也证实重组HEK293细胞促增殖能力增强。结果表明,该重组过表达FGFR2的细胞模型可用于下一步的功能研究以及靶向FGFR2药物的筛选。 展开更多

关键词 成纤维细胞生长因子受体2 慢病毒包装 过表达 重组细胞株

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iRhom2及其突变基因重组慢病毒的包装和稳定表达细胞系的建立 被引量：1

7

作者 游颖 马雨楠 +1 位作者 曾林 孙兆增 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期597-601,共5页

目的通过重组慢病毒感染,建立iRhom2及其突变基因的Vero细胞稳定细胞表达系,用于iRhom2的功能研究。方法将iRhom2及其突变基因克隆到慢病毒载体Lenti-OE-Flag,构建重组慢病毒载体Lenti-OEiRhom2和Lenti-OE-iRhom2mut,将重组质粒瞬时转染... 目的通过重组慢病毒感染,建立iRhom2及其突变基因的Vero细胞稳定细胞表达系,用于iRhom2的功能研究。方法将iRhom2及其突变基因克隆到慢病毒载体Lenti-OE-Flag,构建重组慢病毒载体Lenti-OEiRhom2和Lenti-OE-iRhom2mut,将重组质粒瞬时转染HEK-293T包装细胞,获得重组慢病毒。将重组病毒感染Vero细胞,利用puromycin进行加压筛选,获得二者的重组表达细胞系。结果构建了iRhom2及其突变基因的逆转录病毒载体,并获得了重组逆转录病毒,并利用该病毒获得了二者的稳定表达细胞系。Western-blot实验证实,二者能够在Vero细胞内稳定表达。结论利用重组逆转录病毒感染,成功获得了iRhom2及其突变系的Vero细胞稳定表达株,为进一步研究iRhom2的生物学功能及其机制奠定了良好的基础。 展开更多

关键词 iRhom2 慢病毒载体 包装细胞 稳定表达

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单嗜性包装细胞包装逆转录病毒方法研究 被引量：1

8

作者 张杰 王彦刈 +1 位作者 吕磊 郁建平 《贵州大学学报（自然科学版）》 2015年第3期28-31,共4页

逆转录病毒的感染范围(嗜性)是由所使用的包装细胞表达的包膜蛋白所决定的,因此改变现有的包装细胞的包膜蛋白就可以改变所包装的逆转录病毒的嗜性。为了达此目的,在稳定表达MMLV包膜蛋白的逆转录病毒包装细胞BOSC23细胞中共转染VSV-G... 逆转录病毒的感染范围(嗜性)是由所使用的包装细胞表达的包膜蛋白所决定的,因此改变现有的包装细胞的包膜蛋白就可以改变所包装的逆转录病毒的嗜性。为了达此目的,在稳定表达MMLV包膜蛋白的逆转录病毒包装细胞BOSC23细胞中共转染VSV-G表达载体和表达GFP的逆转录病毒载体,结果包装出的逆转录病毒只能感染少量的人源性的293F细胞,说明VSV-G不能完全替换掉MMLV包膜蛋白。因此我们利用RNA干扰技术首先沉默BOSC23细胞中的MMLV包膜蛋白的表达,然后共转染VSV-G表达载体和表达GFP的逆转录病毒载体,结果包装出了高滴度的泛嗜性的逆转录病毒。 展开更多

关键词 逆转录病毒 包装细胞 泛嗜性

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逆转录病毒转染的小鼠IL－3基因在NIH／3T3细胞中的表达

9

作者 方敏 王立人 +1 位作者 雷学锋 毕爱华 《同济医科大学学报》 CSCD 北大核心 1996年第6期417-420,共4页

将小鼠白细胞介素３（ＩＬ－３）ｃＤＮＡ重组到逆转录病毒载体ｐＮ２Ａ质粒上，用电穿孔法将此重组子转染包装细胞系（ＰＡ３１７），经用Ｇ４１８（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）选择培养基筛选，得到产病毒效价为每ｍｌ５×１０４～２... 将小鼠白细胞介素３（ＩＬ－３）ｃＤＮＡ重组到逆转录病毒载体ｐＮ２Ａ质粒上，用电穿孔法将此重组子转染包装细胞系（ＰＡ３１７），经用Ｇ４１８（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）选择培养基筛选，得到产病毒效价为每ｍｌ５×１０４～２×１０５ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ）的Ｇ４１８抗性细胞克隆。然后取其培养上清液转染ＮＩＨ／３Ｔ３细胞。通过检测被病毒转染的ＮＩＨ／３Ｔ３细胞培养上清液对小鼠骨髓细胞的增殖反应（ＭＴＴ法）和促分化作用（ＣＦＵ培养法），表明转染的ＮＩＨ／３Ｔ３细胞克隆能分泌ＩＬ－３。此结果为进行ＩＬ－３转基因治疗研究奠定了实验基础。 展开更多

关键词 逆转录病毒 载体 白细胞介素3 CDNA 基因 表达

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乙型肝炎病毒拉米夫定耐药株的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系的建立

10

作者 林占洲 王战会 +3 位作者 周彬 杨富强 余治健 侯金林 《肝脏》 2007年第6期469-471,共3页

目的构建1.3拷贝乙型肝炎病毒(HBV)拉米夫定耐药株的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系。方法在野毒株1.3拷贝HBV载体的基础上采用定点突变的方法将rtL180M,rtM204V位点突变,构建拉米夫定耐药病毒株,并通过PCR、限制性内切酶酶切,分别... 目的构建1.3拷贝乙型肝炎病毒(HBV)拉米夫定耐药株的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系。方法在野毒株1.3拷贝HBV载体的基础上采用定点突变的方法将rtL180M,rtM204V位点突变,构建拉米夫定耐药病毒株,并通过PCR、限制性内切酶酶切,分别以正向和反向将野毒株和耐药株分别连接于逆转录病毒载体pLNCX2的相应酶切位点,构建成重组逆转录病毒载体,经双酶切及PCR扩增鉴定。重组载体转染包装细胞,筛选培养细胞克隆并进行病毒滴定。结果通过双酶切、PCR扩增、测序鉴定证实成功构建了1.3拷贝HBV拉米夫定耐药株的逆转录病毒载体。成功建立包装细胞系并测得病毒滴度均为1×105cuf/ml。结论含正向及反向1.3拷贝HBV拉米夫定耐药的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系构建成功,可以用于拉米夫定耐药细胞模型研究。 展开更多

关键词 乙型肝炎病毒 拉米夫定耐药 逆转录病毒载体 包装细胞系

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抗肝癌sFv-TNF-α基因逆转录病毒包装细胞系的建立

11

作者 程虹 刘彦仿 +1 位作者 张惠中 沈万安 《西北国防医学杂志》 CAS 2003年第2期118-120,共3页

目的 :将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因 (sFv -TNF -α)克隆至逆转录病毒载体pLXSN ,包装并筛选具有高滴度感染性重组病毒产生细胞系。方法 :用平 -粘末端连接方法将sFv-TNF -α克隆至pLXSN ,磷酸钙共沉淀法转染PA31 7包装细胞并测定... 目的 :将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因 (sFv -TNF -α)克隆至逆转录病毒载体pLXSN ,包装并筛选具有高滴度感染性重组病毒产生细胞系。方法 :用平 -粘末端连接方法将sFv-TNF -α克隆至pLXSN ,磷酸钙共沉淀法转染PA31 7包装细胞并测定病毒滴度 ,用PCR及免疫组化方法分析鉴定重组逆转录病毒细胞系。结果 :成功构建了表达载体pLXSN -sFv-TNF -α ,筛选出一株cfu >1× 1 0 9·L- 1 的感染性重组病毒产生细胞系C2 2 。结论 :外源基因整合到转染细胞DNA中并表达 。 展开更多

关键词 肝癌 单链双功能抗体 逆转录病毒表达载体 包装细胞系 基因转染 免疫组化

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抗肝癌单链双功能抗体基因逆转录病毒表达载体的构建及病毒包装细胞系的建立

12

作者 程虹 刘彦仿 +1 位作者 张惠中 沈万安 《世界华人消化杂志》 CAS 2000年第6期708-709,共2页

人类基因治疗技术的迅速发展使越来越多针对先天性和获得性疾病的基因治疗方案进入临床试验,同时,逆转录病毒作为介导基因转染的载体也是目前基础和临床应用研究中最广泛使用的基因转移方法.迄今所掌握的研究资料表明,接受逆转录病毒介... 人类基因治疗技术的迅速发展使越来越多针对先天性和获得性疾病的基因治疗方案进入临床试验,同时,逆转录病毒作为介导基因转染的载体也是目前基础和临床应用研究中最广泛使用的基因转移方法.迄今所掌握的研究资料表明,接受逆转录病毒介导基因治疗的患者中尚未发现因病毒感染导致的不良反应.因此,我们选择改造的缺陷型逆转录病毒载体 pLXSN,将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因(sFv-TNF-α) 展开更多

关键词 肝肿瘤 逆转录病毒科 基因疗法 克隆 包装细胞

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人HGF基因重组逆转录病毒表达载体及包装细胞株的构建和鉴定 被引量：1

13

作者 王韫芳 南雪 +3 位作者 岳文 李艳华 闫舫 裴雪涛 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 2004年第3期205-208,共4页

目的 :构建携带肝细胞生长因子 (HGF)的逆转录病毒载体 ,并建立高效、稳定生产HGF的包装细胞株。方法 :以pcDNA3.0 HGF质粒为模板进行PCR反应扩增出HGF基因全长序列 ,亚克隆至逆转录病毒载体pMSCVneo构建重组逆转录病毒质粒 ,以脂质体... 目的 :构建携带肝细胞生长因子 (HGF)的逆转录病毒载体 ,并建立高效、稳定生产HGF的包装细胞株。方法 :以pcDNA3.0 HGF质粒为模板进行PCR反应扩增出HGF基因全长序列 ,亚克隆至逆转录病毒载体pMSCVneo构建重组逆转录病毒质粒 ,以脂质体介导转染包装细胞PT6 7,经G4 18筛选 ,进而挑选抗性集落扩大培养后 ,用靶细胞NIH3T3测定病毒滴度 ,筛选出高效产毒细胞株。扩大培养后进行RT PCR鉴定HGFmRNA的表达。扩大培养NIH3T3细胞抗性集落 (NIH3T3/HGF) ,并用细胞培养上清进行人肝癌细胞系HepG2的扩散试验。结果 :PCR反应扩增出 2 2 0 0bp的HGF基因 ,构建了重组逆转录病毒表达载体pMSCV HGF ,测序鉴定正确。经脂质体介导转染包装细胞、G4 18筛选和NIH3T3测定病毒滴度 ,筛选出具有最高病毒滴度 (8.8× 10 7cfu /ml)的细胞集落 ,扩大培养后建立高效表达HGF的包装细胞株PT/HGF ,RT PCR证实HGF基因在PT/HGF中有转录。NIH3T3/HGF培养上清可使HepG2细胞扩散 ,形态改变。结论 :成功构建了携带HGF的逆转录病毒载体pMSCV HGF ,并建立了稳定、高效生产有活性的HGF的产毒细胞株PT/HGF。 展开更多

关键词 肝细胞生长因子 包装细胞PT67 逆转录病毒载体 FF/HGF细胞株 转染

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β-分泌酶底物肽反转录病毒载体及其包装细胞株的构建 被引量：1

14

作者 崔媛媛 胡海涛 +5 位作者 董炜疆 王兰 郑慧媛 赵璇 石明娟 吴志新 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期624-626,共3页

目的用pLXSN反转录病毒载体构建介导β-分泌酶底物肽(BACEsp)基因表达的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体,并建立高效、稳定表达BACEsp的包装细胞株。方法根据BACEsp基因序列设计引物,PCR合成的BAC-Esp片段和pLXSN载体用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶... 目的用pLXSN反转录病毒载体构建介导β-分泌酶底物肽(BACEsp)基因表达的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体,并建立高效、稳定表达BACEsp的包装细胞株。方法根据BACEsp基因序列设计引物,PCR合成的BAC-Esp片段和pLXSN载体用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后连接,构建成表达BACEsp的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体。用脂质体介导转染PT67包装细胞,经抗性筛选后,挑单克隆扩大培养,用NIH3T3细胞测定病毒滴度,筛选出高效产毒细胞株。结果经酶切、连接后构建成的质粒称为pLXSN-BACEsp,经测序证实构建成功,无任何碱基突变。经脂质体介导转染包装细胞、抗性筛选和测定病毒滴度,筛选出具有高病毒滴度的细胞集落,扩大培养后建立BAC-Esp高效表达的包装细胞株。结论成功构建了能表达BACEsp的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体,并建立了稳定、高效地产生有活性的BACEsp产毒包装细胞株。 展开更多

关键词 阿尔茨海默病 β分泌酶底物肽 反转录病毒载体 包装细胞株 转染

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MAR介导的逆转录病毒包装细胞系的建立

15

作者 张靖 王天云 +2 位作者 张俊河 杨保胜 张继红 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第12期182-185,共4页

根据GenBank登录的序列号,使用primer5.0进行引物设计,提取人的外周血基因组DNA为模板,PCR方法扩增出人β-珠蛋白MAR序列,将MAR序列插入到逆转录病毒表达载体pLXSN,构建MAR序列介导的逆转录病毒载体。酶切和测序鉴定后,阳离子聚合物转染... 根据GenBank登录的序列号,使用primer5.0进行引物设计,提取人的外周血基因组DNA为模板,PCR方法扩增出人β-珠蛋白MAR序列,将MAR序列插入到逆转录病毒表达载体pLXSN,构建MAR序列介导的逆转录病毒载体。酶切和测序鉴定后,阳离子聚合物转染PA317细胞,G418筛选出阳性细胞克隆,提取病毒液上清,测定逆转录病毒颗粒滴度,逆转录病毒颗粒的最高滴度为1.6×106CFU/mL,成功建立了MAR介导的逆转录病毒包装细胞系。 展开更多

关键词 核基质结合区 逆转录病毒载体 包装细胞系

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