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猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞中非结构蛋白Nsp2表达分析 被引量:4
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作者 温贵兰 张涵淞 +5 位作者 扈鸿霞 章先 张毅 王晓杜 李肖梁 方维焕 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期1109-1116,共8页
猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)非结构蛋白Nsp2对病毒复制和致病具有重要作用,本研究旨在分析Nsp2在Marc-145细胞内的分布与表达。构建nsp2含PL2区域基因片段的原核表达载体,重组... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)非结构蛋白Nsp2对病毒复制和致病具有重要作用,本研究旨在分析Nsp2在Marc-145细胞内的分布与表达。构建nsp2含PL2区域基因片段的原核表达载体,重组蛋白纯化后作为免疫抗原,制备Nsp2特异性单克隆抗体。将携带nsp2基因的真核表达载体转染至Marc-145及HEK293细胞,或将PRRSV感染Marc-145细胞后不同时间点收集细胞样品。免疫荧光观察Nsp2在转染细胞中的亚细胞定位,免疫印迹分析Nsp2在真核细胞中的表达。筛选获得了1株稳定分泌特异性抗Nsp2的单克隆杂交瘤细胞株,能用于免疫荧光和印迹分析。重组真核表达质粒转染Marc-145与HEK293细胞后,Nsp2主要定位于细胞质中,免疫印迹检测到约为120与50ku的蛋白条带。PRRSV感染Marc-145细胞4h即可检测到Nsp2的表达,主要定位于细胞核周围,随着感染时间延长Nsp2分布范围逐渐扩大至整个细胞质。病毒感染8h,可检测到120ku左右的Nsp2蛋白条带,感染后12h可检测到70和50ku左右的Nsp2蛋白,且蛋白表达量随感染时间延长显著增多。PRRSV感染细胞中Nsp2的表达与剪切分析,为深入研究该蛋白在病毒复制和致病中的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 非结构蛋白nsp2 表达与剪切方式
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B组轮状病毒WH-1株NSP2基因序列和蛋白质结构分析 被引量:2
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作者 李维琳 唐力 +5 位作者 王斌 唐少文 N.Kobayashi 李燕 段纪俊 杨继红 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第11期853-857,共5页
目的 克隆成人腹泻标本WH 1中B组轮状病毒组 (groupBrotavirus ,GBRV)非结构蛋白NSP2基因 ,分析其核苷酸序列 ,比较与其它GBRV基因同源性 ,预测其mRNA二级结构、蛋白质二级结构。方法 利用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术 ,从成人... 目的 克隆成人腹泻标本WH 1中B组轮状病毒组 (groupBrotavirus ,GBRV)非结构蛋白NSP2基因 ,分析其核苷酸序列 ,比较与其它GBRV基因同源性 ,预测其mRNA二级结构、蛋白质二级结构。方法 利用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术 ,从成人腹泻标本WH 1中扩增GBRVNSP2基因 ,克隆载体pUCmT ,对NSP2基因进行核苷酸序列分析。利用GeneBee软件比较与其它GBRV毒株NSP2基因同源性 ,Rnaviz2 .0软件绘制NSP2基因的二级结构 ,PredictProtein软件分析NSP2蛋白结构。结果 成人腹泻标本WH 1中GBRV非结构蛋白NSP2基因全长 10 0 7bp ,与ADRV核苷酸序列的同源性达 98% ,与印度加尔各达分离株CAL 1达 82 % ,与IDIR(鼠 )同源性仅为 79%。氨基酸序列与ADRV的同源性达 98.4 % ,与CAL 1达 97.7% ,而与IDIR仅为 89.0 %。其mRNA折叠形成多达 2 6个发卡环状结构。NSP2蛋白是由 30 1个氨基酸残基组成的多肽 ,含有 2个潜在的N 糖基化位点和多个磷酰化位点。结论 成人腹泻标本WH 1中GBRV非结构蛋白NSP2基因和氨基酸序列与人GBRV有较高的同源性 ,而与动物中GBRV同源性相对较低 ,其中与ADRV的同源性最高 ,推测GBRVWH 1株与ADRV具有相同起源。 展开更多
关键词 轮状病毒 WH-1株 nsp2 基因序列 蛋白质 结构分析
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人B组轮状病毒WH-1株NSP2基因片段的克隆与序列分析
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作者 唐少文 叶临湘 +3 位作者 王斌 郑华英 李燕 杨继红 《中国人兽共患病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期109-112,共4页
目的 了解人B组轮状病毒近 2 0年来基因变异情况 ,为轮状病毒疫苗的研制提供依据。方法 利用逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)技术 ,扩增人B组轮状病毒WH - 1株NSP2基因 4 89bp的片断 ,并将其克隆到载体 pUCmT ,转化感受态细胞One-shot... 目的 了解人B组轮状病毒近 2 0年来基因变异情况 ,为轮状病毒疫苗的研制提供依据。方法 利用逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)技术 ,扩增人B组轮状病毒WH - 1株NSP2基因 4 89bp的片断 ,并将其克隆到载体 pUCmT ,转化感受态细胞One-shotTop10F’ ,提取转化菌质粒经限制性内切酶PstI酶切分析 ,筛选出阳性菌提取质粒 ,对插入片段进行了测序和核苷酸序列分析。结果 利用GeneBee与其他B组轮状病毒株ADRV(人 )、CAL - 1(人 )及IDIR(鼠 )的NSP2基因进行同源性比较 ,发现毒株WH - 1与ADRV核苷酸序列的同源性达 99 8% ,与CAL - 1达 93 7% ,与IDIR(鼠 )的同源性为80 0 %。使用PredictProtein软件分析WH - 1NSP2的蛋白组成 ,发现其编码的 14 9个氨基酸组成的多肽中 ,含有 1个潜在的N -糖基化位点和多个磷酰化位点。从氨基酸序列的同源性看 ,WH - 1与ADRV的同源性达 99 3% ,与CAL - 1达 98 6 % ,而与IDIR为 86 2 %。结论 WH - 1与ADRV的起源相同 ,且B组轮状病毒NSP2基因保守性很高。对人B组轮状病毒NSP2基因序列分析将有助于B组轮状病毒的流行病学、基因进化以及轮状病毒疫苗的研制都将有重要意义。 展开更多
关键词 人B组轮状病毒 WH-1株nsp2 基因片段 克隆 序列分析
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Nsp2 and GP5-M of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Contribute to Targets for Neutralizing Antibodies 被引量:4
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作者 Jia Su Lei Zhou +5 位作者 Bicheng He Xinhui Zhang Xinna Ge Jun Han Xin Guo Hanchun Yang 《Virologica Sinica》 SCIE CAS CSCD 2019年第6期631-640,共10页
Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)is characterized by its genetic variation and limited cross protection among heterologous strains.Even though several viral structural proteins have been regar... Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)is characterized by its genetic variation and limited cross protection among heterologous strains.Even though several viral structural proteins have been regarded as inducers of neutralizing antibodies(NAs)against PRRSV,the mechanism underlying limited cross-neutralization among heterologous strains is still controversial.In the present study,examinations of NA cross reaction between a highly pathogenic PRRSV(HP-PRRSV)strain,JXwn06,and a low pathogenic PRRSV(LP-PRRSV)strain,HB-1/3.9,were conducted with viral neutralization assays in MARC-145 cells.None of the JXwn06-hyperimmuned pigs’sera could neutralize HB-1/3.9 in vitro and vice versa.To address the genetic variation between these two viruses that are associated with limited crossneutralization,chimeric viruses with coding regions swapped between these two strains were constructed.Viral neutralization assays indicated that variations in nonstructural protein 2(nsp2)and structural proteins together contribute to weak cross-neutralization activity between JXwn06 and HB-1/3.9.Furthermore,we substituted the nsp2-,glycoprotein2(GP2)-,GP3-,and GP4-coding regions together,or nsp2-,GP5-,and membrane(M)protein-coding regions simultaneously between these two viruses to construct chimeric viruses to test cross-neutralization reactivity with hyperimmunized sera induced by their parental viruses.The results indicated that the swapped nsp2 and GP5-M viruses increased the neutralization reactivity with the donor strain antisera in MARC-145 cells.Taken together,these results show that variations in nsp2 and GP5-M correlate with the limited neutralization reactivity between the heterologous strains HP-PRRSV JXwn06 and LP-PRRSV HB-1/3.9. 展开更多
关键词 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) Neutralizing antibody(NA) non-structural protein 2(nsp2) structural proteins(SPs)
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猪繁殖与呼吸综合征病毒GS15株NSP2蛋白多位点缺失病毒的拯救与体外生长特性分析
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作者 张兴民 张婧 +13 位作者 孙普 李娇阳 崔占鼎 李国秀 王健 李平花 袁红 李坤 曹轶梅 付元芳 李冬 赵志荀 曾巧英 卢曾军 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期2307-2322,共16页
【目的】本实验室前期在高致病性毒株PRRSV/GSWW/2015的感染性克隆上,拯救获得了非结构蛋白(non-structural protein 2,NSP2)第519-565位和第628-747位氨基酸双缺失的工程病毒(r GS15-?2)。本研究旨在在双缺失病毒的感染性克隆上,构建... 【目的】本实验室前期在高致病性毒株PRRSV/GSWW/2015的感染性克隆上,拯救获得了非结构蛋白(non-structural protein 2,NSP2)第519-565位和第628-747位氨基酸双缺失的工程病毒(r GS15-?2)。本研究旨在在双缺失病毒的感染性克隆上,构建拯救获得NSP2三个位点缺失的工程病毒。【方法】在前期双缺失病毒感染性克隆的基础上,利用融合PCR方法分别构建缺失NSP2第323-364位和第372-433位优势抗原表位的两个3个位点缺失的重组质粒。经脂质体介导,转染Marc-145细胞拯救病毒,通过电子显微镜观察、免疫荧光实验、测定病毒滴度、绘制生长曲线等方法对缺失病毒的生长特性进行分析。【结果】成功获得拯救病毒r GS15-?3-1和r GS15-?3-2。电子显微镜下可以观察到直径大小为50-80 nm的病毒粒子;免疫荧光实验检测表明,拯救病毒与亲本病毒GS15一致,都能检测到PRRSV N蛋白表达;缺失区域RT-PCR扩增鉴定,拯救病毒传至40代缺失标记稳定存在;r GS15-△3-1与r GS15-△3-2病毒滴度分别为2.00×10^(6.0)TCID_(50)/m L和2.25×10^(5.8)TCID50/m L,与亲本病毒相比病毒滴度差异显著(P<0.05);生长曲线分析表明拯救病毒复制水平低于亲本病毒达到最高滴度的培养时间比亲本病毒延迟24 h。【结论】本研究通过对PRRSV基因2型非结构蛋白NSP2多位点缺失病毒的体外生长特性分析,为研制新型PRRSV标记疫苗奠定了基础,也为猪繁殖与呼吸综合征的防控提供新的策略。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 感染性克隆 非结构蛋白2(nsp2) 缺失标记 生长特性
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hPRRSV GD07株Nsp2基因真核表达载体的构建和表达
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作者 牛晓芸 王艳丽 +1 位作者 钟望 贺东生 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第6期22-25,共4页
为了深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2蛋白的免疫特性、结构与功能,试验根据GenBank公布的PRRSV CH-1a株Nsp2基因的核苷酸序列设计1对特异性引物,PCR扩增目的基因,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pcDNA3.1(+)... 为了深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2蛋白的免疫特性、结构与功能,试验根据GenBank公布的PRRSV CH-1a株Nsp2基因的核苷酸序列设计1对特异性引物,PCR扩增目的基因,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-Nsp2,并对其进行经PCR、双酶切鉴定及DNA序列测定;将构建的重组质粒转染到Marc-145细胞中,用SDS-PAGE、Western-blot对表达产物进行鉴定。结果表明:RT-PCR扩增出的Nsp2基因大小与预期一致,经SDS-PAGE及Western-blot鉴定Nsp2蛋白在Marc-145细胞中成功表达。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS) 非结构蛋白-2(nsp2) 真核表达
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