金属硫蛋白突变体的植物高效表达载体的构建及其在烟草中的表达 被引量：11

1

作者 张晓钰 李伟 +2 位作者 张竞 何笃修 茹炳根 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1999年第6期888-892,共5页

金属硫蛋白有α、β两个结构域（ｄｏｍ ａｉｎ），其中α结构域优先结合Ｃｄ２＋ 和Ｈｇ２＋ ．小鼠αα突变体在大肠杆菌中已经构建并得到表达，其转基因植株已得到，可在Ｃｄ３００（３００ μｍ ｏｌ／Ｌ）中生长．为了进一步提高... 金属硫蛋白有α、β两个结构域（ｄｏｍ ａｉｎ），其中α结构域优先结合Ｃｄ２＋ 和Ｈｇ２＋ ．小鼠αα突变体在大肠杆菌中已经构建并得到表达，其转基因植株已得到，可在Ｃｄ３００（３００ μｍ ｏｌ／Ｌ）中生长．为了进一步提高外源基因在烟草中的表达量，首先用ＰＣＲ 的方法设计引物，在基因翻译起始密码子ＡＴＧ 附近加入植物偏爱的碱基组合ＡＡＣＡＡＴＧ．另外，将该突变体基因插入具有双３５ Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）强启动子的植物双元表达载体ｐＧＰＴＶｄ３５Ｓ－ＢＡＲ中，获得了带有αα突变体的植物双元表达载体．通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草ＮＣ８９，获得了抗除草剂的转基因植株．经ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 和蛋白Ｄｏｔ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ 检测，证明了αα突变体在烟草中的嵌合与表达．抗重金属实验证明转基因烟草可以在Ｃｄ４００（４００ μｍ ｏｌ／Ｌ）中生长． 展开更多

关键词 突变体 烟草转基因 抗性育种 MT 重金属

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以克隆载体为自杀载体快速构建布鲁氏菌的无痕缺失突变株 被引量：11

2

作者 王玉飞 陈泽良 +5 位作者 赵红庆 苑锡铜 黄留玉 张伶 刘京梅 宋宏彬 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期642-645,共4页

构建突变株是病原微生物致病机理研究的重要手段。以往研究中布鲁氏菌的无痕缺失突变株都采用传统的自杀载体来构建,效率低下。首先对布鲁氏菌的电击转化条件进行了优化,然后选择含有反向筛选基因sacB的pEX18Gm质粒作为自杀载体,构建了... 构建突变株是病原微生物致病机理研究的重要手段。以往研究中布鲁氏菌的无痕缺失突变株都采用传统的自杀载体来构建,效率低下。首先对布鲁氏菌的电击转化条件进行了优化,然后选择含有反向筛选基因sacB的pEX18Gm质粒作为自杀载体,构建了缺失Ⅳ型启动子区的布鲁氏菌无痕缺失突变株。这不仅为构建布鲁氏菌的突变株提供了一个快速有效的技术平台,也为深入研究Ⅳ型分泌系统的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 自杀载体 布鲁氏菌 突变株构建

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植物突变体库的作用及构建研究进展 被引量：10

3

作者 高志勇 谢恒星 +1 位作者 王志平 刘史力 《作物杂志》 CAS 北大核心 2016年第6期16-19,共4页

发生突变的个体叫作突变体。突变体往往具有与野生型不同的表型,这样就为缺失组分的功能研究提供了有益的信息。主要介绍了植物突变体库的作用及构建方法,重点论述了自发突变体库、理化诱变突变体库及T-DNA插入突变体库的构建原理与特征... 发生突变的个体叫作突变体。突变体往往具有与野生型不同的表型,这样就为缺失组分的功能研究提供了有益的信息。主要介绍了植物突变体库的作用及构建方法,重点论述了自发突变体库、理化诱变突变体库及T-DNA插入突变体库的构建原理与特征,并对植物突变体库的研究前景进行了展望。 展开更多

关键词 植物 突变体库 功能基因组 构建

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结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株Pup-蛋白酶体系统Pup基因、Mpa基因、Dop基因和PafA基因缺失突变株的构建 被引量：9

4

作者 李瑞山 雷英 +11 位作者 吴芳 张辉 张春军 章乐 曹旭东 吴江东 朱彬 张玉清 邬博 何丽 王钊 张万江 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2015年第1期9-16,共8页

目的利用SOE-PCR技术和T载体技术,快速构建结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株Pup-蛋白酶体系统Pup基因、Mpa基因、Dop基因和PafA基因缺失突变株,为进一步研究结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统的功能奠定基础。方法基于同源重组原理,利用... 目的利用SOE-PCR技术和T载体技术,快速构建结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株Pup-蛋白酶体系统Pup基因、Mpa基因、Dop基因和PafA基因缺失突变株,为进一步研究结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统的功能奠定基础。方法基于同源重组原理,利用SOE-PCR技术和T载体技术分别将各待缺失基因的上下游同源臂与卡那霉素抗性基因融合,构建各基因缺失突变盒;将各基因缺失突变盒与T-Vector pMD 19(Simple)相连接,构建各基因缺失突变自杀载体;利用电穿孔技术将各载体转入H37Rv菌株,通过筛选阳性克隆、菌落PCR鉴定、DNA测序及遗传稳定性检测,获得各目的基因的缺失突变株。结果成功构建了带有1 601bp的特异性置换片段Pup-N-K和1 591bp的特异性置换片段K-Pup-C的Pup基因缺失突变株H37Rv△Pup,带有1 604bp的特异性置换片段Mpa-N-K和1 602bp的特异性置换片段K-Mpa-C的Mpa基因缺失突变株H37Rv△Mpa,带有1 515bp的特异性置换片段Dop-N-K和1509bp的特异性置换片段K-Dop-C的Dop基因缺失突变株H37Rv△Dop及带有1 590bp的特异性置换片段PafA-N-K和1 584bp的特异性置换片段K-PafA-C的PafA基因缺失突变株H37Rv△PafA,且各突变株均具有良好的遗传稳定性。结论利用SOE-PCR技术和T载体技术可以快速构建结核分枝杆菌基因缺失突变株,依据此方法成功构建了H37Rv菌株Pup-蛋白酶体系统Pup基因、Mpa基因、Dop基因和PafA基因缺失突变株,为进一步研究结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 Pup-蛋白酶体系统 缺失突变株 构建

原文传递

金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株RN4220 Δnuc1的构建 被引量：6

5

作者 唐俊妮 周锐 +2 位作者 史贤明 康名松 陈焕春 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期43-47,共5页

金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶(Staphylococcal nuclease,SNase),命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶(Thermonuclease,TNase),命名为nuc2,nuc2是一个新的候选基因,以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一... 金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶(Staphylococcal nuclease,SNase),命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶(Thermonuclease,TNase),命名为nuc2,nuc2是一个新的候选基因,以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一个编码基因nuc1,为了进一步研究nuc2基因的功能,首先要将金黄色葡萄球菌nuc1基因缺失。研究目的就是通过构建同源重组质粒pBT2Δnuc1,将其电转入金黄色葡萄球菌菌株RN4220中,获得nuc1基因缺失突变株。经过了7轮培养和筛选,同源重组几率为2%(7/345),筛选出的nuc1突变株用PCR方法和RT-PCR进行了验证,从而获得了nuc1基因缺失突变株RN4220Δnuc1。 展开更多

关键词 金黄色葡萄球菌 nucl nuc2 同源重组 突变株构建

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羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株VirB12基因缺失株的构建及鉴定 被引量：4

6

作者 马晓菁 易新萍 +5 位作者 付湘芸 叶锋 谷文喜 刘帅 马俊杰 钟旗 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期794-798,共5页

为获得毒力较弱且能够区分疫苗免疫与自然感染的羊种布鲁氏菌候选疫苗株,本研究构建羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株VirB12基因缺失突变株。分别扩增Rev.1疫苗株VirB12基因上下游同源臂序列以及卡那霉素抗性基因,采用融合PCR方法将3个基因片段... 为获得毒力较弱且能够区分疫苗免疫与自然感染的羊种布鲁氏菌候选疫苗株,本研究构建羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株VirB12基因缺失突变株。分别扩增Rev.1疫苗株VirB12基因上下游同源臂序列以及卡那霉素抗性基因,采用融合PCR方法将3个基因片段连接构建突变盒,连接至pMD19-T载体,电转化入布鲁氏菌Rev.1感受态细胞筛选阳性克隆,获得Rev.1-ΔVirB12突变株。Rev.1-ΔVirB12连续传代15代未发生回复突变。羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1-ΔVirB12的构建为羊种布鲁氏菌疫苗研制奠定了基础。 展开更多

关键词 羊种布鲁氏菌 Rev.1 突变株 构建

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Survivin启动子介导自杀基因与突变体融合基因真核表达载体的构建 被引量：3

7

作者 孙萍胡 吴云林 +3 位作者 董文杰 乔敏敏 朱黎明 涂水平 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2009年第11期1085-1090,共6页

目的:构建Survivin启动子介导自杀基因胞嘧啶脱氨酶(CD)与SurvivinCys84Ala突变体(SurMut)融合基因的重组腺相关病毒质粒(pAM/SurP-CDglySurMut),探讨其在肿瘤细胞中有效表达融合基因的能力.方法:PCR扩增E.coliCD基因和带有甘氨酸(gly)... 目的:构建Survivin启动子介导自杀基因胞嘧啶脱氨酶(CD)与SurvivinCys84Ala突变体(SurMut)融合基因的重组腺相关病毒质粒(pAM/SurP-CDglySurMut),探讨其在肿瘤细胞中有效表达融合基因的能力.方法:PCR扩增E.coliCD基因和带有甘氨酸(gly)连接体的Survivin突变体片段,亚克隆至具有Survivin启动子的腺相关病毒载体pAM/SurP,获得重组表达载体pAM/Sur P-CDglySurMut.重组载体瞬时转染胃癌细胞,Western blot检测融合蛋白的表达.结果:经PCR扩增成功克隆E.coliCD基因和带有gly连接体的Survivin突变体片段.重组阳性克隆经限制性酶切鉴定和基因测序,证实目的基因CDglySurMut已正确插入pAM/SurP载体中.Westernblot证实Survivin启动子能够驱动CDglySurMut融合基因在胃癌细胞中表达.结论:pAM/SurP-CDglySurMut载体能够在肿瘤细胞中表达融合蛋白,为进一步探讨其靶向治疗肿瘤奠定了实验基础. 展开更多

关键词 SURVIVIN启动子 Survivin突变体 胞嘧啶脱氨酶基因 载体构建

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Radixin定点突变过表达对HepG2细胞膜转运蛋白Bsep的影响 被引量：2

8

作者 封欣婵 柴进 +1 位作者 程英 陈文生 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期1002-1007,共6页

目的构建pcDNA3.1-RDX定点突变真核过表达质粒,研究其在胆汁淤积时对HepG2细胞膜转运蛋白胆盐输出泵(bile salt export pump,Bsep)定位表达的影响。方法从含有RDX野生型质粒中,利用PCR方法钓取RDX野生型基因片段并以野生型为基础进行定... 目的构建pcDNA3.1-RDX定点突变真核过表达质粒,研究其在胆汁淤积时对HepG2细胞膜转运蛋白胆盐输出泵(bile salt export pump,Bsep)定位表达的影响。方法从含有RDX野生型质粒中,利用PCR方法钓取RDX野生型基因片段并以野生型为基础进行定点突变,PCR扩增后转入pcDNA3.1载体,其产物转化DH-5α感受态细胞。对长出的单克隆进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确即为构建成功的目的质粒。将目的质粒转染HepG2细胞,经G418筛选构建稳转细胞株。提取各株细胞的总蛋白,检测磷酸化RDX是否影响HepG2细胞膜上转运蛋白Bsep的表达。结果 PCR和测序结果均证实pcDNA3.1-RDX WT、pcDNA3.1-RDX T564D、pcDNA3.1-RDX T564A过表达载体构建成功。蛋白免疫印迹表明,与转染pcDNA-3.1-RDX-WT的HepG2相比,转染pcDNA-3.1-T564D的HepG2的Bsep膜蛋白表达量显著增加(P<0.05),而转染pcDNA-3.1-T564A的HepG2的Bsep膜蛋白表达量有所下降(P>0.05)。结论成功构建了pcDNA3.1-RDX WT、pcDNA3.1-RDX T564D、pcDNA3.1-RDX T564A过表达载体,并证实RDX的磷酸化能增强HepG2细胞膜上Bsep的表达。 展开更多

关键词 RDX定点突变 载体构建 PCDNA3 1载体 胆盐输出泵

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黑线仓鼠白化突变系抑制差减文库的构建及初步分析 被引量：2

9

作者 李爱学 曾林 +3 位作者 尚世臣 王鹏 姚晓兰 孙兆增 《实验动物与比较医学》 CAS 2013年第1期19-22,共4页

目的构建黑线仓鼠白化突变系的抑制差减文库，分离获得黑线仓鼠发生被毛突变的相关基因片段，并进行初步分析。方法以黑线仓鼠作为实验组（tester），以其白化突变系作为驱动组（driver），采用抑制差减杂交技术构建差减文库（SSH）。... 目的构建黑线仓鼠白化突变系的抑制差减文库，分离获得黑线仓鼠发生被毛突变的相关基因片段，并进行初步分析。方法以黑线仓鼠作为实验组（tester），以其白化突变系作为驱动组（driver），采用抑制差减杂交技术构建差减文库（SSH）。对阳性克隆进行测序并分析。结果共获得126个有生物学意义的表达序列标签（ESTs），包括21个骨架蛋白，42个转录因子，24个代谢酶基因，25个转运分子及其调节蛋白和4个未知基因。差异基因中没有发现常见的白化疾病相关基因，发现多种与溶酶体的形成及内吞作用相关的基因，推测黑线仓鼠白化突变性状的产生可能与黑色素的运输障碍有关。结论成功构建了黑线仓鼠白化突变的抑制差减文库，获得126个白化突变的相关基因，为进一步寻找白化突变相关基因，揭示其分子机制奠定了基础。 展开更多

关键词 黑线仓鼠 白化突变 差减杂交 筛选

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酒用糯高粱EMS突变体库构建及突变体筛选 被引量：2

10

作者 丁延庆 曹宁 +5 位作者 周棱波 程斌 高旭 汪灿 邹桂花 张立异 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第12期2884-2891,共8页

【目的】利用甲基磺酸乙酯(EMS)构建酒用糯高粱突变体库,并筛选出田间表型性状明显突变的株系,为糯高粱遗传改良、新品种选育及基因功能研究提供丰富的基础材料。【方法】采用0.4%EMS对糯高粱品种红缨子进行诱变处理,M1代单株收获,并对M... 【目的】利用甲基磺酸乙酯(EMS)构建酒用糯高粱突变体库,并筛选出田间表型性状明显突变的株系,为糯高粱遗传改良、新品种选育及基因功能研究提供丰富的基础材料。【方法】采用0.4%EMS对糯高粱品种红缨子进行诱变处理,M1代单株收获,并对M2代突变群体开展全生育期的田间表型性状鉴定,筛选出性状明显突变的株系。【结果】经EMS诱变处理后红缨子M1代突变群体田间存活率降至31.9%,且出现了多种性状变异,如叶片白(黄)化、叶片畸形、穗畸形、植株矮化和不育等性状,共获得M1代突变株系1020个。在M2代突变群体中发现86个突变株系,突变频率为8.43%。其中,叶色(白化、黄化、芯叶白化、浅绿色、白绿条纹、黄绿条纹)突变株系42个、叶型(畸形叶、卷曲叶和直立叶)突变株系8个、穗型(畸形、小穗和穗缺失)突变株系10个、生育期(早熟和晚熟)突变株系5个、蜡质(蜡质缺失)突变株系4个、感病性(易感病)突变株系4个、育性(完全不育和半不育)突变株系5个及株高(高杆和矮杆)突变株系8个。【结论】构建的酒用糯高粱EMS突变体库表型变异丰富,可用于高粱功能基因组学研究和酒用糯高粱育种。 展开更多

关键词 酒用糯高粱 甲基磺酸乙酯(EMS) 突变体库 构建 表型鉴定 筛选

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人尿激酶原cDNA序列缺失突变体的构建及表达 被引量：1

11

作者 韩素文 俞炜源 +1 位作者 程度胜 胡宝成 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 1997年第2期127-131,共5页

采用ＰＣＲ重叠延伸法和基因重组技术构建了人尿激酶原ｃＤＮＡ序列中缺失１５０～１５６位氨基酸的突变体，以ＣＯＳ７细胞中获得暂时性表达以及在ＣＨＯ细胞中稳定高效表达，其表达水平为４５０～５００ＩＵ／１０６ｃｅｌ／２４ｈ... 采用ＰＣＲ重叠延伸法和基因重组技术构建了人尿激酶原ｃＤＮＡ序列中缺失１５０～１５６位氨基酸的突变体，以ＣＯＳ７细胞中获得暂时性表达以及在ＣＨＯ细胞中稳定高效表达，其表达水平为４５０～５００ＩＵ／１０６ｃｅｌ／２４ｈ，表达产物经ＳＤＳＰＡＧＥ电转溶实验和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析证明，细胞分泌的ＰｒｏＵＫ突变体与天然ＰｒｏＵＫ以及完整全长ＤＮＡ序列表达ＰｒｏＵＫ的分子量相同，为５４ｋＤａ，绝大多数为单链，比完整ｃＤＮＡ序列表达产物的单链比例明显增高。 展开更多

关键词 尿激酶原 CDNA 突变体 构建 表达 基因工程

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潜在抑癌基因eIF4E3野生型和突变体质粒的构建 被引量：1

12

作者 姚运红 袁炜 +2 位作者 熊敏涵 张叶 胡新荣 《黑龙江医学》 2020年第4期472-474,共3页

目的构建并鉴定野生型PIRES2-EGFP-eIF4E3(eIF4E3)、突变体PIRES2-EGFP-eIF4E3 C69a (e IF4E3C69a)、突变体PIRES2-EGFP-eIF4E3 w86a (e IF4E3 w86a)真核过表达载体,为进一步研究基因eIF4E3的功能奠定基础。方法通过PCR在人细胞cDNA库... 目的构建并鉴定野生型PIRES2-EGFP-eIF4E3(eIF4E3)、突变体PIRES2-EGFP-eIF4E3 C69a (e IF4E3C69a)、突变体PIRES2-EGFP-eIF4E3 w86a (e IF4E3 w86a)真核过表达载体,为进一步研究基因eIF4E3的功能奠定基础。方法通过PCR在人细胞cDNA库中扩增eIF4E3,人工化学合成突变体e IF4E3C69a和eIF4E3w86a。将目的片段和空载质粒PIRES2-EGFP分别双酶切后进行连接,重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α,挑取单克隆,摇菌扩增,提取质粒,双酶切电泳、菌液及其质粒进行PCR鉴定、DNA测序鉴定。结果 PCR结果显示插入片段大小正确,测序结果通过Blast比对NIH基因库的eIF4E3基因序列显示e IF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3w86a序列准确且编码框架正确插入PIRES2-EGFP中。结论成功构建eIF4E3、eIF4E3C69a、e IF4E3W86a真核过表达载体。 展开更多

关键词 真核翻译起始因子4E 野生型 突变体 质粒构建

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采用同源重组技术构建金黄色葡萄球菌sae基因缺失突变株

13

作者 唐俊妮 康铭松 +2 位作者 周锐 史贤明 陈焕春 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期698-702,共5页

针对金黄色葡萄球菌sae基因前后两段序列设计两对引物,PCR扩增出sae基因上下游同源臂序列,克隆到穿梭载体pBT2中;两段序列之间用来自质粒p646的Em抗性基因片段连接,作为筛选标记,从而构建同源重组穿梭质粒pBT2Δsae;将pBT2Δsae电转化... 针对金黄色葡萄球菌sae基因前后两段序列设计两对引物,PCR扩增出sae基因上下游同源臂序列,克隆到穿梭载体pBT2中;两段序列之间用来自质粒p646的Em抗性基因片段连接,作为筛选标记,从而构建同源重组穿梭质粒pBT2Δsae;将pBT2Δsae电转化到金黄色葡萄球菌菌株RN4220中,40℃经过七轮培养,进行抗性培养基筛选和PCR验证,以及RT-PCR观察基因表达水平。获得一株金黄色葡萄球菌sae基因缺失突变株RNΔsae,为进一步研究sae基因的调控机制等提供有用的实验材料。 展开更多

关键词 金黄色葡萄球菌 sae基因 同源重组 突变株构建

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秀丽隐杆线虫rict-1/daf-2&Pdhs-3∶∶dhs-3∶∶gfp双突变体构建

14

作者 宗华 鲍斌 《合肥工业大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2018年第12期1695-1699,共5页

线虫存在与同哺乳动物同源的调控脂肪沉积及相关代谢疾病的因子和代谢通路,是一种研究脂肪沉积的模式生物。线虫中已经构建出许多脂肪沉积改变的突变体,而且目前已有利用绿色荧光指示脂肪沉积的突变体Pdhs-3∶∶dhs-3∶∶gfp,Pdhs-3∶∶... 线虫存在与同哺乳动物同源的调控脂肪沉积及相关代谢疾病的因子和代谢通路,是一种研究脂肪沉积的模式生物。线虫中已经构建出许多脂肪沉积改变的突变体,而且目前已有利用绿色荧光指示脂肪沉积的突变体Pdhs-3∶∶dhs-3∶∶gfp,Pdhs-3∶∶dhs-3∶∶gfp在脂滴表面激发绿色荧光,因此可以直接观测线虫脂肪沉积的变化。rict-1编码线虫中与哺乳动物Rictor同源蛋白。daf-2编码线虫胰岛素受体络氨酸激酶。为了研究脂肪沉积与相关调控因子及代谢通路的关系,文章构建了rict-1/daf-2&Pdhs-3∶∶dhs-3∶∶gfp双突变体。首先采用Pdhs-3∶∶dhs-3∶∶gfp的雄虫与rict-1/daf-2的雌雄同体杂交得到子一代,继而筛选出绿色荧光纯合的子三代。最后通过酶切、基因测序等方法获得性状稳定的、能够稳定遗传的突变体。 展开更多

关键词 线虫 脂肪沉积 绿色荧光 双突变体 基因型 构建

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长QT综合征KCNQ1基因G983A突变体的构建、体外转录与表达

15

作者 李伟 杨钧国 +4 位作者 杜戎 管思明 柯琴梅 王斌 徐秋梅 《心脏杂志》 CAS 2008年第6期673-677,共5页

目的构建先天性长QT综合征KCNQ1基因G983A突变体,并研究其在非洲爪蟾卵母细胞上的表达。方法首先进行定点诱变,构建含KCNQ1G983A突变点的原核表达载体pSP64-KCNQ1(G983A),并对pSP64-KCNQ1(G983A)进行纯化和线性化,然后应用SP6RNA体外转... 目的构建先天性长QT综合征KCNQ1基因G983A突变体,并研究其在非洲爪蟾卵母细胞上的表达。方法首先进行定点诱变,构建含KCNQ1G983A突变点的原核表达载体pSP64-KCNQ1(G983A),并对pSP64-KCNQ1(G983A)进行纯化和线性化,然后应用SP6RNA体外转录试剂盒进行转录,并回收和鉴定转录的cRNAs。制备非洲爪蟾卵母细胞,经显微注射仪将KCNQ1(G983A)cRNAs注射至卵母细胞中,2d后采用双电极电压钳记录卵母细胞膜的电流。结果成功地构建pSP64-KCNQ1(G983A)突变体,经转录获得KCNQ1(G983A)cRNAs,并在爪蟾卵母细胞上表达。结论KCNQ1基因(G983A)突变体的成功构建及表达,为进一步探讨长QT综合征的发病机制奠定了基础。 展开更多

关键词 长QT综合征 KCNQ1基因 突变体 构建 表达

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幼叶黄化油菜(Brassica napus L.)突变体Cr3529叶绿体超微结构观察 被引量：27

16

作者 赵云 王茂林 +1 位作者 李江 张义正 《四川大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期974-977,共4页

对油菜Cr3529叶片细胞中的叶绿体数目及结构进行了显微及亚显微观察.结果显示,突变与野生型细胞中叶绿体的数目没有显著性的差异,但叶绿体的结构有较大的差异.较之正常油菜,Cr3529油菜叶绿体基粒类囊体数较少,基质类囊体数较多,而且,在... 对油菜Cr3529叶片细胞中的叶绿体数目及结构进行了显微及亚显微观察.结果显示,突变与野生型细胞中叶绿体的数目没有显著性的差异,但叶绿体的结构有较大的差异.较之正常油菜,Cr3529油菜叶绿体基粒类囊体数较少,基质类囊体数较多,而且,在基粒类囊体中基粒片层数也较少,大部分基粒只有几个片层,基粒的平均片层数为5.46,约为野生型的一半.作者认为,较少的基粒片层数可能是引起Cr3529油菜叶绿素含量减少,并最终导致植株显著减产的重要原因. 展开更多

关键词 甘蓝型油菜 叶绿体 黄化突变 结构

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利用T载体克隆快速构建布鲁氏菌缺失突变株 被引量：15

17

作者 白耀霞 杨毅 +7 位作者 王玉飞 王同坤 于爽 陈燕芬 付思美 黄留玉 田晋红 陈泽良 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期62-67,共6页

目的:建立一种基于T载体快速克隆构建布鲁氏菌突变株的方法,提高布鲁氏菌突变株构建的效率。方法:采用融合PCR的方法,将待缺失基因上下游的同源臂与卡那霉素抗性基因融合起来,构建突变盒,然后将突变盒直接与T载体连接,构建突变载体,将... 目的:建立一种基于T载体快速克隆构建布鲁氏菌突变株的方法,提高布鲁氏菌突变株构建的效率。方法:采用融合PCR的方法,将待缺失基因上下游的同源臂与卡那霉素抗性基因融合起来,构建突变盒,然后将突变盒直接与T载体连接,构建突变载体,将载体转入布鲁氏菌感受态细胞并筛选抗性克隆,进而获得布鲁氏菌的缺失突变株。结果:结合融合PCR和T载体快速克隆,能够在48h之内构建好突变载体,与传统的酶切连接相比,效率高、周期短。结论:基于T载体快速克隆是一种非常高效的构建突变株的方法,为布鲁氏菌突变株的构建提供了一种新方法。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 T载体 突变株构建

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pUC19K质粒的构建及其在布鲁氏菌突变株构建中的应用 被引量：12

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作者 乔凤 陈泽良 +4 位作者 王玉飞 赵瑾 杜昕颖 于雅琴 黄留玉 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期1-5,共5页

突变株的构建是细菌基因功能研究的前提。构建了一个可用于布鲁氏菌突变株构建的自杀质粒。在pUC19质粒的多克隆位点插入卡那霉素抗性基因,在该基因两侧添加多个酶切位点,构建成为pUC19K。利用该质粒,构建了布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因... 突变株的构建是细菌基因功能研究的前提。构建了一个可用于布鲁氏菌突变株构建的自杀质粒。在pUC19质粒的多克隆位点插入卡那霉素抗性基因,在该基因两侧添加多个酶切位点,构建成为pUC19K。利用该质粒,构建了布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因的突变株。结果表明,利用该自杀质粒,通过一轮筛选即可得到目标基因被抗性基因替换的突变株。pUC19K质粒的构建及成功应用,为布鲁氏菌突变株的构建提供了一个快速有效的手段,也为布鲁氏菌的基因功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 自杀质粒 突变株构建

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集成干扰素突变体Ⅱ的分子构建、表达及提纯 被引量：4

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作者 牛晓霞 刘金毅 +1 位作者 杨轶 吴晓东 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第12期1-5,共5页

目的:通过定点突变,构建集成干扰素突变体Ⅱ(IFN-Con-m2),以期获得兼具高效作用和可定点聚乙二醇(PEG)修饰的新型药物分子。方法:采用PCR体外定点突变技术,使集成干扰素突变体Ⅰ(IFN-Con-m1)基因的第86位密码子由TAC突变为TGC。将扩增... 目的:通过定点突变,构建集成干扰素突变体Ⅱ(IFN-Con-m2),以期获得兼具高效作用和可定点聚乙二醇(PEG)修饰的新型药物分子。方法:采用PCR体外定点突变技术,使集成干扰素突变体Ⅰ(IFN-Con-m1)基因的第86位密码子由TAC突变为TGC。将扩增片段克隆入pET-23b表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。IPTG诱导后,表达的IFN-Con-m2经包涵体变复性、疏水层析、DEAE层析和凝胶过滤层析等纯化后,用WISH-VSV系统进行生物活性测定。结果:IFN-Con-m2以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后,IFN-Con-m2的纯度大于95%,比活性大于5.0×108IU/mg。结论:构建了IFN-Con-m2的表达载体,并成功地在大肠杆菌中表达,获得了高活性突变分子IFN-Con-m2,建立了IFN-Con-m2的纯化工艺。 展开更多

关键词 集成干扰素突变体 定点突变 构建 表达 纯化

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肿瘤坏死因子受体相关因子6泛素化位点突变载体的构建及其功能位泛素化位点的鉴定 被引量：4

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作者 王琴 林春霖 +5 位作者 程志彬 何若凡 林鹏航 陈辉 叶建新 朱广伟 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期551-558,共8页

目的:预测人肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)基因上的泛素化位点,并构建泛素化位点突变质粒,探讨突变质粒对人结直肠癌HCT116和SW480细胞中核因子κB(NF-κB)和激活蛋白1(AP-1)相对荧光素酶活性的影响。方法:采用UbPred、UbiSite和BDM... 目的:预测人肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)基因上的泛素化位点,并构建泛素化位点突变质粒,探讨突变质粒对人结直肠癌HCT116和SW480细胞中核因子κB(NF-κB)和激活蛋白1(AP-1)相对荧光素酶活性的影响。方法:采用UbPred、UbiSite和BDM-PUB软件预测TRAF6基因的泛素化位点,采用CE Design V1.04软件设计突变引物,采用突变试剂盒进行定点突变,采用PCR法扩增获得突变后的目的片段,扩增产物经Dpnl酶消化,去除甲基化模板质粒,消化产物在ExnaseⅡ催化作用下发生同源重组获得重组质粒;将重组质粒转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞,对重组质粒进行DNA测序。采用双荧光素酶报告基因系统检测转染突变质粒后HCT116和SW480细胞中NF-κB和AP-1相对荧光素酶活性。结果:经过DNA测序,泛素化突变位点已经成功突变,泛素化突变质粒构建成功。与TRAF6野生型基因比较,转染第124、319和331位突变质粒后,结直肠癌HCT116和SW480细胞中NF-κB和AP-1相对荧光素酶活性降低(P<0.05或P<0.01),其中转染第124位突变质粒后,结直肠癌HCT116和SW480细胞中NF-κB和AP-1相对荧光素酶活性降低最明显(P<0.01)。结论:成功构建人TRAF6基因的泛素化突变质粒,TRAF6的第124位氨基酸是其最重要的泛素化位点,可能影响下游信号通路中NF-κB和AP-1的活性。 展开更多

关键词 肿瘤坏死因子受体相关因子6 突变质粒构建 泛素化 荧光素酶报告系统 核因子κB 激活蛋白1

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