多重PCR法快速鉴定转基因小麦植株及后代 被引量：25

1

作者 陈明洁 刘勇 +1 位作者 涂知明 何光源 《华中科技大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2004年第9期105-107,共3页

根据转基因植物中常用的报告基因uidA、选择基因bar的序列 ,设计合成两对不同的引物 ,建立了在转基因小麦材料分子确证中 ,应用一次PCR反应同时扩增检测两种或多种外源基因的多重PCR方法 .通过对质粒 pAHC2 5以及 30个转基因小麦样品进... 根据转基因植物中常用的报告基因uidA、选择基因bar的序列 ,设计合成两对不同的引物 ,建立了在转基因小麦材料分子确证中 ,应用一次PCR反应同时扩增检测两种或多种外源基因的多重PCR方法 .通过对质粒 pAHC2 5以及 30个转基因小麦样品进行PCR扩增分析 ,比较多重PCR的检测结果与单基因的PCR扩增结果 。 展开更多

关键词 转基因小麦 标记基因 多重PCR

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多重PCR-变性高效液相色谱检测食品中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌 被引量：6

2

作者 徐君怡 曹际娟 +2 位作者 郑秋月 裴轶君 于珂 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期207-212,共6页

本研究应用多重PCR反应(mPCR)结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立食品中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的快速检测方法。以编码嗜热弯曲菌属的16S rRNA基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因和编码结肠弯曲菌的cdt基因为靶基因,选择3对引物,建立并... 本研究应用多重PCR反应(mPCR)结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立食品中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的快速检测方法。以编码嗜热弯曲菌属的16S rRNA基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因和编码结肠弯曲菌的cdt基因为靶基因,选择3对引物,建立并优化了鉴别空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的mPCR体系,扩增产物分别为287bp、159bp和173bp。采用22株细菌验证了该mPCR具有特异性。mPCR检测的灵敏度在DNA水平上达到空肠弯曲菌10pg/μL、结肠弯曲菌1pg/μL;在人工模拟污染样品起始污染浓度为1.5个/mL时,42℃微需氧条件下培养24h即可被检出。在随机采集的172份冷冻鸡肉类样品中,检出了18份样品为空肠弯曲菌阳性,7份样品为结肠弯曲菌阳性。本研究建立的mPCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的快速检测。 展开更多

关键词 空肠弯曲菌 结肠弯曲菌 多重PCR 变性高效液相色谱

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多重PCR-DHPLC快速检测食品中产志贺毒素大肠杆菌 被引量：6

3

作者 晚观生 刘晓玉 +2 位作者 郑秋月 徐君怡 曹际娟 《工业微生物》 CAS CSCD 2016年第3期42-46,共5页

应用多重PCR(motiplex PCR)结合变性高效液相色谱技术(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)建立了快速检测食品中产志贺毒素大肠杆菌O111和O157的方法。以基因wzx O111、rfb EO157为靶基因,建立多重PCR-DHPLC方法... 应用多重PCR(motiplex PCR)结合变性高效液相色谱技术(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)建立了快速检测食品中产志贺毒素大肠杆菌O111和O157的方法。以基因wzx O111、rfb EO157为靶基因,建立多重PCR-DHPLC方法,进行特异性和灵敏度测试,同时进行RT-PCR检测比较灵敏度。该方法具有良好特异性,可以一次PCR扩增同时检测O111、O157;灵敏度达到25 CFU/m L。129份牛肉样品中检出1例O111,3例O157阳性;74份鸡肉样品中检测出O111、O157阳性各1例,67份蔬菜样品中未检测到O111、O157。本文建立O111、O157多重PCR-DHPLC检测方法,操作简便,特异性强,适用于产志贺毒素大肠杆菌筛选检测。 展开更多

关键词 多聚酶链式反应 变性高效液相色谱 检测 产志贺毒素大肠杆菌

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食品中3种致病菌多重PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：4

4

作者 周蓓莉 肖进文 +5 位作者 刘生峰 李应国 周庆 聂福平 王昱 杨俊 《食品科技》 CAS 北大核心 2012年第6期312-315,共4页

建立用多重聚合酶链式反应(Multiplex polymerase chain reaction,mPCR)同时检测食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌的方法。以沙门氏菌的gyrB基因、单核细胞增生性李斯特菌的gyrB基因、金黄色葡萄球菌的coa基因... 建立用多重聚合酶链式反应(Multiplex polymerase chain reaction,mPCR)同时检测食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌的方法。以沙门氏菌的gyrB基因、单核细胞增生性李斯特菌的gyrB基因、金黄色葡萄球菌的coa基因作为目的基因,分别设计3对引物,通过优化反应体系,建立3种致病菌的多重PCR检测体系。采用单重PCR检测时,灵敏度可达0.423ng/mL(沙门氏菌)、2.5ng/mL(金黄色葡萄球菌)和0.36ng/mL(单核细胞增生性李斯特菌);而采用三重PCR检测时,灵敏度较单重PCR有所下降,分别为2.43ng/mL(沙门氏菌)、2.5ng/mL(金黄色葡萄球菌)、3.6ng/mL(单核细胞增生性李斯特菌)。初步建立能同时、快速、灵敏地检测食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌的三重PCR方法。 展开更多

关键词 食源性致病菌 多重聚合酶链式反应(mpcr) 食品 检测

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水产品中常见5种致病菌的多重PCR-DHPLC快速检测方法的建立 被引量：3

5

作者 钱云开 苑静 +3 位作者 高飞 王海洋 肖艳霞 张进杰 《中国卫生检验杂志》 北大核心 2014年第14期2014-2016,共3页

目的建立水产品中5种常见致病菌的快速高分辨检测手段,提高检测的效率和准确性。方法筛选沙门菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌的特异基因,通过参阅文献和自行设计,分别确定invA、nuc、prfA、tlh、owp... 目的建立水产品中5种常见致病菌的快速高分辨检测手段,提高检测的效率和准确性。方法筛选沙门菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌的特异基因,通过参阅文献和自行设计,分别确定invA、nuc、prfA、tlh、owpW为检测基因,优化引物浓度和引物组合,进行多重PCR扩增,产物经DHPLC进行快速检测。优化确定的方法通过重现性试验,特异性试验,灵敏度试验,以及人工污染水产品样品的检测。结果 DHPLC检测出峰顺序依次为invA、nuc、prfA、tlh、owpW,扩增片段大小为284 bp、329 bp、388 bp、450 bp、588 bp,此方法具有良好的重现性和特异性,灵敏度分别可达188 CFU/ml、670 CFU/ml、280 CFU/ml、240 CFU/ml、580 CFU/ml,不同水产品的状态、成分以及增菌液类型对后续检测不存在影响。结论本方法可以很好的满足实际食品微生物检测的要求。 展开更多

关键词 变性高效液相色谱 多重聚合酶链式反应 食源性致病菌 食品安全

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MPCR检测食品中大肠杆菌O157和单核增生李斯特氏菌的研究 被引量：3

6

作者 丁久法 潘迎捷 +3 位作者 赵勇 孙晓红 秦红友 唐明未 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2009年第20期375-378,共4页

根据大肠杆菌O157(Escherichia coliO157,E.coliO157)的志贺样毒素基因slt和"黏附抹平"因子eaeA基因、单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytohenes,LM)的编码溶血素O的hlyA基因和毒力基因plcA,分别设计上游和下游的slt、eaeA... 根据大肠杆菌O157(Escherichia coliO157,E.coliO157)的志贺样毒素基因slt和"黏附抹平"因子eaeA基因、单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytohenes,LM)的编码溶血素O的hlyA基因和毒力基因plcA,分别设计上游和下游的slt、eaeA、hlyA和plcA四对引物,对应扩增片段依次为780、450、708、600bp。通过对单管多重PCR(multiplex PCR,MPCR)扩增的特异性、敏感性分析以及对单管多重PCR扩增条件,如Mg2+浓度、dNTPs浓度和退火温度等的优化,建立快速检测大肠杆菌O157和单增李斯特菌的多重PCR方法,该方法能同时检测到0.50ng的E.coliO157和单增李斯特菌基因组DNA,并且操作简便、快速,具有良好的敏感性和特异性,能够快速实现对食品中多种致病菌的诊断和监控。 展开更多

关键词 多重PCR 大肠杆菌O157 单核增生李斯特氏菌

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保健食品中3种病原菌多重PCR快速检测方法的建立及验证 被引量：2

7

作者 韩来辉 王潇 李井涛 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2015年第11期1219-1222,共4页

目的建立快速检测保健食品中沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR（multiplex PCR,m PCR）方法,并进行验证及初步应用。方法以提取的各菌株基因组DNA为模板,利用Gen Bank中登录的沙门菌inv A、志贺菌ipa H、金黄色葡萄球菌nuc基因... 目的建立快速检测保健食品中沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR（multiplex PCR,m PCR）方法,并进行验证及初步应用。方法以提取的各菌株基因组DNA为模板,利用Gen Bank中登录的沙门菌inv A、志贺菌ipa H、金黄色葡萄球菌nuc基因序列设计引物,采用优化后的反应体系及确定的反应条件进行PCR扩增,扩增产物经3%琼脂糖凝胶电泳鉴定,对建立的方法进行特异性、敏感性、重复性验证。将沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌等量混合后,进行10倍系列稀释,加至10批无病原菌蛋白质粉和10批无病原菌减肥茶样品匀浆中,用建立的方法进行PCR扩增,并与GB常规生化检测结果进行比较。结果确定m PCR反应体系为：10×PCR buffer 2.0μl,d NTPs 2.5μl,Taq DNA酶0.6μl,上下游引物各1.5μl,Mg2＋1.0μl,补加dd H2O至25μl。10株细菌中,沙门菌、2株志贺菌、金黄色葡萄球菌扩增结果为阳性,其他菌株为阴性,inv A、ipa H、nuc基因扩增片段与Gen Bank登录的序列同源性分别为99%、99%和100%;沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌菌株均能在101~105 CFU/ml浓度时扩增出特异性目的条带;5个浓度混合菌液扩增产物均可见特异性反应条带。该方法扩增出10批人工添加细菌蛋白质粉和10批人工添加细菌减肥茶中沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的特异性基因片段,检出限均为102 CFU/ml,与GB常规生化检测结果一致。结论建立的保健食品中沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌m PCR检测方法特异性强,灵敏度高,重复性好,可满足不同检验机构快速、准确检测保健食品中多种病原微生物样品的实际需要。 展开更多

关键词 保健食品 沙门菌 志贺菌 金黄色葡萄球菌 多重聚合酶链式反应 验证

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一种高效筛选公共引物的方法

8

作者 陈英 段欠欠 +5 位作者 沈苏南 王晓囡 奚邦生 张玲 季建刚 孙万平 《中国血液流变学杂志》 CAS 2016年第1期1-5,31,共6页

目的：设计一种筛选高效性多重聚合酶链反应（multiplex polymerase chain reaction，MPCR）公共引物的新方法。方法将3条正向引物和3条反向引物序列分别连接于一段人类β-actin基因序列5＇和3＇端，连接序列通过pMD19-T载体构建质粒模... 目的：设计一种筛选高效性多重聚合酶链反应（multiplex polymerase chain reaction，MPCR）公共引物的新方法。方法将3条正向引物和3条反向引物序列分别连接于一段人类β-actin基因序列5＇和3＇端，连接序列通过pMD19-T载体构建质粒模板，利用此构建的质粒模板可实现9对引物PCR扩增敏感性的筛选，实现了引物的高效筛选；其步骤包括：引物设计、插入序列的选择、酶切转化、质粒提取、敏感性检测。结果通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物得出实验结果，结果显示9对公共引物的重复敏感性有明显差异，其中2对引物两次敏感性检测均达到10 copies/μL，1对引物两次敏感性均是103 copies/μL。结论该方法适用于从多对引物中排除低效性引物，筛选出敏感性高的引物对。 展开更多

关键词 引物筛选 公共引物 多重聚合酶链反应(mpcr)

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变性高效液相色谱检测空肠弯曲菌 被引量：1

9

作者 徐君怡 曹际娟 +3 位作者 刘淑艳 蒋丹 徐杨 王刚 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期854-858,共5页

目的应用多重PCR反应(multiplex PCR,mPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中空肠弯曲菌的快速检测方法。方法以编码嗜热弯曲菌属的16S rRNA基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基... 目的应用多重PCR反应(multiplex PCR,mPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中空肠弯曲菌的快速检测方法。方法以编码嗜热弯曲菌属的16S rRNA基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因为靶基因,选择2对引物,建立并优化了鉴别空肠弯曲菌的多重PCR体系,扩增产物分别为287bp、159 bp。采用22株细菌验证了该多重PCR具有特异性。PCR检测的灵敏度在DNA水平上达到10 pg/μL;在人工模拟污染样品起始污染浓度为1.5个/mL时,42℃微需氧条件下培养24 h可被检出。结果在随机采集的172份冷冻鸡肉类样品中,检出了18份样品为空肠弯曲菌阳性。结论本研究建立的多重PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对空肠弯曲菌的快速检测。 展开更多

关键词 空肠弯曲菌 多重PCR 变性高效液相色谱 DHPLC

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多重PCR快速确证外源基因在转基因小麦后代的传递 被引量：1

10

作者 施农农 王慧中 +2 位作者 徐莺 何光源 胡斌 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期51-57,共7页

根据转入小麦0世代中的高分子谷蛋白亚基1Dx5基因和报告基因uidA、作为选择标记的除草剂抗性基因bar的序列,设计合成三对引物。以整合uidA+bar的质粒pAHC25和整合1Dx5 的质粒p1Dx5为模板寻找uidA与1Dx5及或bar多重扩增的最佳模板浓度及... 根据转入小麦0世代中的高分子谷蛋白亚基1Dx5基因和报告基因uidA、作为选择标记的除草剂抗性基因bar的序列,设计合成三对引物。以整合uidA+bar的质粒pAHC25和整合1Dx5 的质粒p1Dx5为模板寻找uidA与1Dx5及或bar多重扩增的最佳模板浓度及最适退火温度。 MPCR模板量是单对引物扩增时的两倍,引物浓度同常规PCR为0．3μmol／L,uidA与bar的适宜退火温度范围为57．1-62．3℃;uidA与1Dx5为60．0℃-60．6℃;uidA、bar、1Dx5的最适合退火温度范围为57．0℃～58．4℃。MPCR对大小相差50bp及以下的多重扩增片段可通过10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。在此基础上对14株T1代转基因小麦基因组DNA进行多重PCR 扩增,筛选出基因未分离的小麦后代,并与常规PCR比较,结果一致,其中11株同时传递1Dx5和 bar基因、1株同时传递uidA、bar和1Dx5基因,3株未检测到外源基因。表明MPCR在快速确证外源基因在转基因植株后代的传递中作用显著。研究在常规PCR反应体系上,对模板浓度和多重引物退火温度进行微调,且把MPCR技术与PAGE技术结合起来,提高了研究结果的准确性,获得了较好的扩增和检测效果,简化了MPCR优化程序,使MPCR的优势更明显,为该技术的广泛应用提供了借鉴。 展开更多

关键词 多重PCR转基因检测

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表型和分子分型技术在霍乱弧菌研究中的应用

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作者 黄冰 李孝权 +1 位作者 邓志爱 张欣强 《中国公共卫生管理》 2012年第3期378-380,共3页

目的分析1999～2005年广州地区O1群和O139群霍乱弧菌代表菌株的致病基因型和PFGE型别,确定霍乱菌株的分子流行病学特征和同源性,研究本地霍乱弧菌的分子特性。方法采用多重PCR方法检测霍乱弧菌的4种致病相关基因,采用限制性内切酶Not I... 目的分析1999～2005年广州地区O1群和O139群霍乱弧菌代表菌株的致病基因型和PFGE型别,确定霍乱菌株的分子流行病学特征和同源性,研究本地霍乱弧菌的分子特性。方法采用多重PCR方法检测霍乱弧菌的4种致病相关基因,采用限制性内切酶Not I,以脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)对菌株进行分子分型,采用分型处理软件BioNumerics Version对PFGE图谱做聚类分析。结果本地霍乱弧菌代表株中存在3种致病基因型(A、B、C型),病例分离的霍乱弧菌多为A型基因,而环境分离的霍乱弧菌则多为C型和B型。总共96株霍乱弧菌分为60个不同的PFGE型,带型范围:8 kb-650 kb。相同或相近的PFGE型(相差1～3条带)存在于多次霍乱暴发疫情分离株中、环境分离霍乱与临床株之间、输入病例与本地病例分离霍乱弧菌间,不同的PFGE克隆型(4～6带及以上)的流行病学联系也较远。结论将致病基因分型、PFGE型与流行病学资料结合,揭示了本地霍乱菌株从受污染的珠江水及水产品传递给人并引起霍乱暴发、散发的特征,提示开展霍乱菌株PFGE分子分型监测及加强地区间合作的必要性和急迫性。 展开更多

关键词 霍乱弧菌 多重PCR 致病相关基因 脉冲场凝胶电泳 分子分型

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