目的对细粒棘球蚴抗原B(EgAgB)的3个亚单位(EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4)的反应性表位的结构进行预测分析并进行基因重组,鉴定构建的多表位重组抗原的反应性。方法用Bioedit和Discovery Studio Visualizer分析软件和I-TASSER在线服务器对EgA...目的对细粒棘球蚴抗原B(EgAgB)的3个亚单位(EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4)的反应性表位的结构进行预测分析并进行基因重组,鉴定构建的多表位重组抗原的反应性。方法用Bioedit和Discovery Studio Visualizer分析软件和I-TASSER在线服务器对EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4等3个亚单位抗原序列及其不同组合方式的组合序列进行分析和结构预测。选择结构预测评分较高的表位或亚单位组合方式进行基因重组。设计特异性重叠引物,用重叠延伸PCR技术扩增目标序列。将目标序列克隆至pET32a(+)载体中构建表达质粒表达重组蛋白,表达产物经纯化后即为多表位重组抗原。采用蛋白质印迹(Western blotting)分析鉴定多表位重组抗原的反应性。结果结构预测显示,EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4等3个亚单位的主要表位均呈"Z"字型结构,且主要表位区域亦均位于序列的中部;对拟进行组合的3个EgAgB亚单位和4个主要表位(KK36、RK30、B4-2和B4-3)的57种不同的组合方式进行了结构预测,选择6种组合方式进行重组表达。对6个多表位重组抗原(MEA-8、MEA-20、MEA-26、MEA-36、MEA-49和MEA-52)进行的Western blotting分析显示,多表位重组抗原与细粒棘球蚴病患者血清的反应条带明显强于AgB亚单位抗原。结论构建的6个多表位重组抗原与细粒棘球蚴病患者血清的反应性明显强于EgAgB亚单位抗原。展开更多
Five highly conserved and immunogenic epitopes of hepatitis C virus (HCV) have been chosen to form a multi-epitope antigen gene and fused with β-galactosidase gene to express a hybrid GZ-PCX antigen, which could be s...Five highly conserved and immunogenic epitopes of hepatitis C virus (HCV) have been chosen to form a multi-epitope antigen gene and fused with β-galactosidase gene to express a hybrid GZ-PCX antigen, which could be specifically recognized by human HCV sera. High level of anti-GZ-PCX IgG has been induced when mice or rabbits were immunized with GZ-PCX antigen emulsificated with complete Freund’s adjuvant or mixed with killed attenuated Salmonella typhimurium SL3261. The specific anti-GZ-PCX IgG reached a high liter of 10-6, which remained for several months. Specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) effects, delayed type hypersensltivity reaction (DTH) and proliferation of peripheral lymphocytes have been induced by GZ-PCX antigen or synthetic peptides. High level of anti-GZ-PCX slgG has been detected in mice’s intestinal washing fluids, which indicates that the antigen induced mucosal immunity as well as systematic immunity. The studies show that the HCV multi-epitope antigen induces high level of specific immune responses without obvious toxicity, which might be able to provide protectivity to any HCV genotypes and isolates.展开更多
目的目前常用的丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)血清学检测试剂都基于3~6个重组蛋白或合成多肽,抗原制备繁琐且诊断效果参差不齐。制备一种诊断效能优良的HCV抗原势在必行。方法利用原核表达系统和层析纯化技术制备涵盖我国HCV主...目的目前常用的丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)血清学检测试剂都基于3~6个重组蛋白或合成多肽,抗原制备繁琐且诊断效果参差不齐。制备一种诊断效能优良的HCV抗原势在必行。方法利用原核表达系统和层析纯化技术制备涵盖我国HCV主要流行株(1b和2a)的6个免疫显性区域的多表位HCV抗原(命名为H65),并以此建立HCV-IgG的血清学检测方法,通过对部分HCV阴阳性血清的检测,初步评价了H65抗原的免疫活性。结果融合Trx标签的H65抗原为可溶性形式表达,纯化后蛋白浓度可达2.991mg/ml,纯度为94.53%;Western blot法检测实验初步证实了蛋白H65的抗原性;应用某商品化试剂盒与H65抗原血清检测方法,对50份HCV阴阳性血清进行检测,McNemer检验显示,新制备诊断抗原与“金标准”比较,P>0.05,Kappa>0.75,且与某商品化试剂盒比较,P>0.05,Kappa>0.75,提示一致性优异。结论H65具有良好的免疫活性,为进一步应用多表位HCV抗原为基础的HCV-IgG体外诊断试剂提供了依据。展开更多
利用肠道病毒71型(EV71)衣壳蛋白优势表位肽段构建融合蛋白抗原能有效抑制病毒感染,有望成为继灭活病毒后更为安全有效的疫苗品种。该融合蛋白能通过原核体系有效表达但形成无序包涵体,采用常规层析介质难以实现目标蛋白与宿主杂质的有...利用肠道病毒71型(EV71)衣壳蛋白优势表位肽段构建融合蛋白抗原能有效抑制病毒感染,有望成为继灭活病毒后更为安全有效的疫苗品种。该融合蛋白能通过原核体系有效表达但形成无序包涵体,采用常规层析介质难以实现目标蛋白与宿主杂质的有效分离,阻碍了对该抗原蛋白进行全面临床前活性及安全性评价。在原有融合蛋白抗原N端插入组氨酸标签,对形成的包涵体变性溶解后直接采用镍金属螯合亲和介质进行分离纯化,获得了纯度大于95%的抗原纯品,目标蛋白收率46.8%。采用透析方式脱除纯化样品中高浓度脲,发现直接透析至无脲的缓冲液中蛋白质大量沉淀,而先稀释至2mol/L脲的缓冲液中然后用G25脱盐柱完全脱除脲则无任何沉淀形成,获得近100%的蛋白质收率。透射电镜分析最终样品发现融合蛋白形成了10nm左右粒径均一的类病毒蛋白颗粒,且在p H 8.0的磷酸盐缓冲液中保持稳定。该研究结果为将EV71融合蛋白抗原发展为安全有效且低成本的手足口疫苗奠定了基础。展开更多
文摘目的对细粒棘球蚴抗原B(EgAgB)的3个亚单位(EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4)的反应性表位的结构进行预测分析并进行基因重组,鉴定构建的多表位重组抗原的反应性。方法用Bioedit和Discovery Studio Visualizer分析软件和I-TASSER在线服务器对EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4等3个亚单位抗原序列及其不同组合方式的组合序列进行分析和结构预测。选择结构预测评分较高的表位或亚单位组合方式进行基因重组。设计特异性重叠引物,用重叠延伸PCR技术扩增目标序列。将目标序列克隆至pET32a(+)载体中构建表达质粒表达重组蛋白,表达产物经纯化后即为多表位重组抗原。采用蛋白质印迹(Western blotting)分析鉴定多表位重组抗原的反应性。结果结构预测显示,EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4等3个亚单位的主要表位均呈"Z"字型结构,且主要表位区域亦均位于序列的中部;对拟进行组合的3个EgAgB亚单位和4个主要表位(KK36、RK30、B4-2和B4-3)的57种不同的组合方式进行了结构预测,选择6种组合方式进行重组表达。对6个多表位重组抗原(MEA-8、MEA-20、MEA-26、MEA-36、MEA-49和MEA-52)进行的Western blotting分析显示,多表位重组抗原与细粒棘球蚴病患者血清的反应条带明显强于AgB亚单位抗原。结论构建的6个多表位重组抗原与细粒棘球蚴病患者血清的反应性明显强于EgAgB亚单位抗原。
文摘Five highly conserved and immunogenic epitopes of hepatitis C virus (HCV) have been chosen to form a multi-epitope antigen gene and fused with β-galactosidase gene to express a hybrid GZ-PCX antigen, which could be specifically recognized by human HCV sera. High level of anti-GZ-PCX IgG has been induced when mice or rabbits were immunized with GZ-PCX antigen emulsificated with complete Freund’s adjuvant or mixed with killed attenuated Salmonella typhimurium SL3261. The specific anti-GZ-PCX IgG reached a high liter of 10-6, which remained for several months. Specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) effects, delayed type hypersensltivity reaction (DTH) and proliferation of peripheral lymphocytes have been induced by GZ-PCX antigen or synthetic peptides. High level of anti-GZ-PCX slgG has been detected in mice’s intestinal washing fluids, which indicates that the antigen induced mucosal immunity as well as systematic immunity. The studies show that the HCV multi-epitope antigen induces high level of specific immune responses without obvious toxicity, which might be able to provide protectivity to any HCV genotypes and isolates.
文摘目的目前常用的丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)血清学检测试剂都基于3~6个重组蛋白或合成多肽,抗原制备繁琐且诊断效果参差不齐。制备一种诊断效能优良的HCV抗原势在必行。方法利用原核表达系统和层析纯化技术制备涵盖我国HCV主要流行株(1b和2a)的6个免疫显性区域的多表位HCV抗原(命名为H65),并以此建立HCV-IgG的血清学检测方法,通过对部分HCV阴阳性血清的检测,初步评价了H65抗原的免疫活性。结果融合Trx标签的H65抗原为可溶性形式表达,纯化后蛋白浓度可达2.991mg/ml,纯度为94.53%;Western blot法检测实验初步证实了蛋白H65的抗原性;应用某商品化试剂盒与H65抗原血清检测方法,对50份HCV阴阳性血清进行检测,McNemer检验显示,新制备诊断抗原与“金标准”比较,P>0.05,Kappa>0.75,且与某商品化试剂盒比较,P>0.05,Kappa>0.75,提示一致性优异。结论H65具有良好的免疫活性,为进一步应用多表位HCV抗原为基础的HCV-IgG体外诊断试剂提供了依据。
文摘利用肠道病毒71型(EV71)衣壳蛋白优势表位肽段构建融合蛋白抗原能有效抑制病毒感染,有望成为继灭活病毒后更为安全有效的疫苗品种。该融合蛋白能通过原核体系有效表达但形成无序包涵体,采用常规层析介质难以实现目标蛋白与宿主杂质的有效分离,阻碍了对该抗原蛋白进行全面临床前活性及安全性评价。在原有融合蛋白抗原N端插入组氨酸标签,对形成的包涵体变性溶解后直接采用镍金属螯合亲和介质进行分离纯化,获得了纯度大于95%的抗原纯品,目标蛋白收率46.8%。采用透析方式脱除纯化样品中高浓度脲,发现直接透析至无脲的缓冲液中蛋白质大量沉淀,而先稀释至2mol/L脲的缓冲液中然后用G25脱盐柱完全脱除脲则无任何沉淀形成,获得近100%的蛋白质收率。透射电镜分析最终样品发现融合蛋白形成了10nm左右粒径均一的类病毒蛋白颗粒,且在p H 8.0的磷酸盐缓冲液中保持稳定。该研究结果为将EV71融合蛋白抗原发展为安全有效且低成本的手足口疫苗奠定了基础。
