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稻瘟病菌Rab5蛋白的表达及互作蛋白的初步筛选 被引量：2
1
作者 林雄杰 王琴秋 +3 位作者 陈少华 周洁 王宗华 鲁国东 《热带作物学报》 CSCD 2011年第7期1352-1355,共4页
Rab5是Rab蛋白家族成员之一,它主要负责调控胞吞作用中囊泡与早期内含体的融合。通过构建MoRab5的原核表达载体,成功诱导了pET-28a-MoRab5融合蛋白的表达,并获得了纯化蛋白,通过His Pulldown检测到一些可能与Rab5互作的蛋白。
关键词 Rab5 互作蛋白 his pull—down 筛选
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人胚胎干细胞膜的特异多肽受体研究
2
作者 谭之扬 金磊 +1 位作者 赵文秀 马岚 《现代生物医学进展》 CAS 2014年第31期6001-6005,共5页
目的:通过多肽筛选和比较分析,找到针对人胚胎干细胞(hESC)特异结合的多肽的膜受体蛋白,为相关通路或特异膜表面蛋白下游的研究奠定基础。方法:首先,在前期运用噬菌体展示技术的基础上进行ELISA重筛选,通过对比结合强度的大小,挑选出特... 目的:通过多肽筛选和比较分析,找到针对人胚胎干细胞(hESC)特异结合的多肽的膜受体蛋白,为相关通路或特异膜表面蛋白下游的研究奠定基础。方法:首先,在前期运用噬菌体展示技术的基础上进行ELISA重筛选,通过对比结合强度的大小,挑选出特异性结合人胚胎干细胞的噬菌体多肽并且进行测序和合成有poly-his标签的多肽;然后运用His Pull-Down系统获得特异结合人胚胎干细胞的某一特殊噬菌体12肽的膜上靶分子受体蛋白;最后质谱测序后通过Mascot数据库和NCBI进行序列信息分析。结果:1通过ELISA重筛选,得到了高特异性结合人胚胎干细胞的两个噬菌体序列,其序列分别为HGAAWGTRTGHV(HGA)和VPATETAQAGHA(VPA)。2通过His Pull-Down实验得到了一个针对多肽VPA的特异性膜蛋白受体。3通过MALD质谱分析以及NCBI的数据库搜索分析,进一步确认这一VPA多肽特异性结合的潜在受体蛋白可能属于HECT超级家族。结论:寻找到一个潜在未知的人胚胎干细胞的特异表面标志物,此膜受体可与VPA多肽特异性结合,为人胚胎干细胞的筛选和鉴定提供了重要指标。 展开更多
关键词 人胚胎干细胞(hESC) VPATETAQAGHA 多肽 his pull-down
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十二指肠贾第虫Rab11互作蛋白的筛选
3
作者 高梦遥 赵志腾 +5 位作者 李璐 张西臣 王晓岑 李新 张楠 宫鹏涛 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2024年第1期25-31,共7页
目的 Rab11属于Rab小分子GTP酶家族,主要参与贾第虫外泌体样囊泡的产生。研究贾第虫囊泡运输中的分子机制,探寻贾第虫Rab11蛋白的互作蛋白至关重要。方法 通过分子克隆技术构建含His标签的原核表达质粒pET-32a-Rab11,经诱导表达和纯化,... 目的 Rab11属于Rab小分子GTP酶家族,主要参与贾第虫外泌体样囊泡的产生。研究贾第虫囊泡运输中的分子机制,探寻贾第虫Rab11蛋白的互作蛋白至关重要。方法 通过分子克隆技术构建含His标签的原核表达质粒pET-32a-Rab11,经诱导表达和纯化,获得Rab11融合蛋白(rGdRab11)。用该蛋白免疫小鼠,制备抗血清,以此为抗体采用免疫荧光法观察Rab11蛋白的亚细胞定位。应用His-pull down联合质谱技术筛选贾第虫全虫蛋白中与Rab11蛋白互作的候选蛋白,并在GiardiaDB数据库和Revigo中对筛选的候选蛋白进行生物信息学分析。结果 成功表达和纯化出Rab11融合蛋白,并制备鼠源抗Rab11多克隆抗体。免疫荧光法观察Rab11蛋白定位于贾第虫滋养体细胞膜区域和细胞质中。共筛选出528个与Rab11特异性结合的候选互作蛋白,其中蛋白质评分大于20分的候选互作蛋白有517个,包括124个未知蛋白,393个已知蛋白。GO分析上述蛋白涉及组蛋白修饰、组蛋白单泛素化、代谢过程、建立或维持细胞骨架极性以及内吞等多种生物进程。结论 成功表达和纯化出Rab11融合蛋白,并制备了鼠抗Rab11多克隆抗体。筛选出贾第虫中与Rab11互作的候选蛋白528个,为研究贾第虫Rab11的分子机制奠定了理论基础。 展开更多
关键词 十二指肠贾第虫 rGdRab11 his-pull down LC-MS/MS 互作蛋白
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人干细胞因子受体膜外区1～3免疫球蛋白样结构域的表达、纯化及活性 被引量：2
4
作者 苏林 刘长征 +3 位作者 邓艳春 杨克恭 梁植权 陈松森 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期154-158,共5页
目的 在原核和真核细胞中表达人干细胞因子受体（c-Kit）配体结合区膜外N端1～3免疫球蛋白样结构域（c-Kit/Ig1～3）,研究其配体结合活性.方法 采用重叠延伸PCR定点诱变法合成c-Kit/Ig1～3双突变片段（c-Kit/Ig1～3DM）,构建pET16b-c-Ki... 目的 在原核和真核细胞中表达人干细胞因子受体（c-Kit）配体结合区膜外N端1～3免疫球蛋白样结构域（c-Kit/Ig1～3）,研究其配体结合活性.方法 采用重叠延伸PCR定点诱变法合成c-Kit/Ig1～3双突变片段（c-Kit/Ig1～3DM）,构建pET16b-c-Kit/Ig1～3DM表达质粒,转化E.coli BL21（DE3）诱导表达,稀释复性,镍柱纯化.将C端添加组氨酸标签的c-Kit/Ig1～3基因克隆入真核表达载体pEAK12中,转染HEK293 ET细胞构建c-kit/Ig1～3高效表达细胞株,从细胞培养上清中使用镍金属螯合柱收集纯化蛋白.His-tag pull-down和酶联免疫结合实验检测融合蛋白配体结合活性.结果 在大肠杆菌中c-Kit/Ig1～3^DM以包涵体形式表达,复性后配体结合活性很低.在HEK293 ET细胞中筛选到2个高效表达c-Kit/Ig1～3的细胞株,上清表达量为2μg/ml,融合蛋白相对分子质量为58 000;受体配体结合实验显示真核表达的c-Kit/Ig1～3有明显的干细胞因子特异结合活性,解离常数Kd值为9.39 nmol/L.结论获得了具有较高配体结合活性的c-Kit/Ig1～3融合蛋白. 展开更多
关键词 人干细胞因子受体 免疫球蛋白样结构域 his-TAG pull-down 酶联免疫结合实验
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His-pull down联合质谱鉴定谷氨酸棒杆菌中乙酰羟酸合酶IlvN的相互作用蛋白 被引量：1
5
作者 侯正杰 张权威 +5 位作者 莫晓琳 夏利 谭淼 孙全伟 马倩 陈宁 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第16期11-17,共7页
以谷氨酸棒杆菌关键酶乙酰羟酸合酶调节亚基IlvN的相互作用蛋白研究为切入点,筛选出与其存在相互作用的蛋白.针对实验室选育的1株缬氨酸高产菌株Corynebacterium glutamicum XV,利用his-pull down技术捕获与乙酰羟酸合酶存在相互作用的... 以谷氨酸棒杆菌关键酶乙酰羟酸合酶调节亚基IlvN的相互作用蛋白研究为切入点,筛选出与其存在相互作用的蛋白.针对实验室选育的1株缬氨酸高产菌株Corynebacterium glutamicum XV,利用his-pull down技术捕获与乙酰羟酸合酶存在相互作用的蛋白质,通过液质联用的方法对差异蛋白进行鉴定,经蛋白电泳和液质分析后,鉴定得到45种蛋白,其中,大部分蛋白为参与翻译过程的核糖体蛋白,此外,还包括参与能量产生与转换、氨基酸转运与代谢、碳水化合物转运与代谢、脂转运与代谢、信号传导等过程的蛋白质.乙酰羟酸合酶是支链氨基酸合成过程中的一个重要关键酶,与其存在相互作用的蛋白涉及代谢过程中的多个方面,这些相互作用的蛋白对于支链氨基酸的合成代谢可能产生影响,所得蛋白相互作用结果对进一步指导协调代谢工程改造具有重要的意义. 展开更多
关键词 谷氨酸棒杆菌 分支链氨基酸 蛋白相互作用 his-pull down IlvN
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大菱鲆(Scophthalmus maximus)热休克蛋白SmHsp47相互作用蛋白His-pull down和质谱鉴定
6
作者 朱春月 孙志宾 +3 位作者 马爱军 刘志峰 杨敬昆 赵亭亭 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2021年第4期971-982,共12页
首次克隆了大菱鲆(Scophthalmus maximus)热休克蛋白SmHsp47基因。该基因cDNA序列全长为1927 bp,其中开放阅读框长度为1218 bp,编码一条长度为405个氨基酸的多肽链。结果表明,大菱鲆SmHsp47基因在肝脏、皮肤、鳃和肠等4个组织中都有表达... 首次克隆了大菱鲆(Scophthalmus maximus)热休克蛋白SmHsp47基因。该基因cDNA序列全长为1927 bp,其中开放阅读框长度为1218 bp,编码一条长度为405个氨基酸的多肽链。结果表明,大菱鲆SmHsp47基因在肝脏、皮肤、鳃和肠等4个组织中都有表达,表达量最高的组织是肝脏,表达量最低组织是鳃;25℃处理6 h后SmHsp47在皮肤中的表达量增加150多倍。利用大肠杆菌原核表达系统表达了SmHsp47的his标签融合蛋白,然后利用His-pull down技术捕获了SmHsp47的相互作用蛋白质,通过质谱分析鉴定出31种候选蛋白,其中大部分蛋白为参与翻译后修饰,蛋白转换及分子伴侣;此外还包括参与脂转运与代谢、能量产生与转换、细胞骨架、防御机制等过程的蛋白质。从31种候选蛋白中进一步筛选出3种分值较高的蛋白:未知蛋白(uncharacterized protein,A0A6A4TFV0)、胎球蛋白B(Fetuin B,A0A2U9C388)和胶原结合蛋白(collagen-binding protein,A0A2U9B608),可为后续的研究提供方向。 展开更多
关键词 大菱鲆(Scophthalmus maximus) SmHsp47 蛋白相互作用 his-pull down
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