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逆转录病毒载体介导HPV16E7对人关节软骨细胞的转化及其生长特性 被引量:6
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作者 何清义 李起鸿 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期516-520,共5页
目的 研究HPV16E7(humanpapillomavirus 16E7)基因片段对人关节软骨细胞的转化作用以及转化细胞的生长特性。方法 利用含HPV16E7基因的逆转录病毒载体pLXSN转染人关节软骨细胞 ,检测HPV16E7基因的整合与表达 ,并用生长曲线、血清依赖... 目的 研究HPV16E7(humanpapillomavirus 16E7)基因片段对人关节软骨细胞的转化作用以及转化细胞的生长特性。方法 利用含HPV16E7基因的逆转录病毒载体pLXSN转染人关节软骨细胞 ,检测HPV16E7基因的整合与表达 ,并用生长曲线、血清依赖试验 ,电镜及流式细胞仪细胞周期时相观察 ,了解转化细胞与正常软骨细胞的生长特性。结果 挑选出了能够在体外长期培养的经HPV16E7转化的细胞克隆 ,已传代 5 0代 ,PCR及RT PCR证实HPV16E7已与宿主细胞基因组成功整合及转录 ,转化细胞的生长速度要高于正常软骨细胞 ,二者都对血清有较大程度的依赖 ,转化细胞的核质比大 ,核仁明显 ,S期细胞数显著高于正常软骨细胞。结论 经HPV16E7基因转化的人关节软骨细胞增殖能力强 ,可连续传代达 5 0代。 展开更多
关键词 基因转化 软骨细胞 hpv16e7基因 逆转录载体
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人乳头瘤病毒HPV16 E7蛋白基因在沙门氏菌疫苗菌株X4072中的表达 被引量:6
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作者 金顺钱 陆士新 +5 位作者 彭琼 谭文 陈瑞红 周春晓 杨晓 黄翠芬 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 1998年第1期38-44,共7页
采用PCR方法,从HPV16型质粒中分离出HPV16E7基因片段,用EcoRI和SalI双酶解后,定向插入到表达质粒pYA3332(asd+)的Ptrc启动子下游,构建成pYA3332-HPV16-E7重组表达质粒。... 采用PCR方法,从HPV16型质粒中分离出HPV16E7基因片段,用EcoRI和SalI双酶解后,定向插入到表达质粒pYA3332(asd+)的Ptrc启动子下游,构建成pYA3332-HPV16-E7重组表达质粒。在大肠杆菌X6212上筛选出重组质粒后,通过中间菌株X3730的转化过渡,将重组质粒导入鼠伤寒沙门氏减毒疫苗菌株X4072(asd-),构建成宿主和载体之间具有平衡致死结构的HPV16型重组疫苗。SDS-PAGE染色和Westernblot法分析证实。 展开更多
关键词 hpv16 e7 鼠伤寒沙门氏菌 疫苗 重组
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宫颈癌及癌前病变组织中含HPV16E7基因转录本分析 被引量:4
3
作者 季红薇 朱华 +4 位作者 林丛 张文淼 陈俊 朱雪洁 邹阮敏 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1183-1188,共6页
目的:探讨宫颈癌发生发展过程中不同病变时期人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7相关转录本的变化。方法:乳头瘤病毒癌基因转录本扩增(APOT)检测15例低度鳞状上皮内病变(LSIL)、20例高度鳞状上皮内病变(HSIL)、18例宫颈癌及9例HPV阴性正常宫颈... 目的:探讨宫颈癌发生发展过程中不同病变时期人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7相关转录本的变化。方法:乳头瘤病毒癌基因转录本扩增(APOT)检测15例低度鳞状上皮内病变(LSIL)、20例高度鳞状上皮内病变(HSIL)、18例宫颈癌及9例HPV阴性正常宫颈组织中的E7基因转录本;对转录本进行测序和序列比对分析;Southern blot验证E7相关转录本在宫颈癌组织中的表达。结果:与LSIL组织比较,HSIL及宫颈癌组织存在更加复杂、多样的E7基因转录本,但未见特征的转录本。宫颈组织共获得5种HPV16 E7的转录模式,模式A、C和E是本研究首次报道;在5种转录模式中,模式A与B在所有HPV16阳性的宫颈组织中都能检测到,是HSIL组织的主要转录模式;模式C主要在宫颈癌组织中检测到,其次为HSIL组织;而模式D和E却只在宫颈癌组织中被发现;模式D和E转录都含E4序列,部分宫颈癌标本未能检测到含E4转录本,且不同宫颈癌标本检测的含E4转录本也存在明显差异条带。结论:HPV16 E7的转录模式在宫颈癌变各时期中的差异都较大;随着细胞癌变程度的加深,病毒的某些特定转录模式会逐渐增多而形成优势转录。 展开更多
关键词 宫颈癌 hpv16 e7基因 转录本 癌前病变
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全酿酒酵母HPV16-E7疫苗的构建及免疫原性研究 被引量:3
4
作者 陈贤璟 宋一一 +3 位作者 孙蓬明 陈晖 林超琴 吴齐斌 《中国妇产科临床杂志》 2009年第2期123-126,共4页
目的构建人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E7重组全酿酒酵母疫苗,评价疫苗的免疫效应。方法将HPV16 E7 cDNA亚克隆入酵母表达载体pYES2/NT,重组质粒转化酿酒酵母,经诱导表达、热灭活制备全酵母HPV16-E7疫苗,免疫C57BL/6小鼠。ELISA、MTT、LDH... 目的构建人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E7重组全酿酒酵母疫苗,评价疫苗的免疫效应。方法将HPV16 E7 cDNA亚克隆入酵母表达载体pYES2/NT,重组质粒转化酿酒酵母,经诱导表达、热灭活制备全酵母HPV16-E7疫苗,免疫C57BL/6小鼠。ELISA、MTT、LDH法分别检测疫苗诱导的细胞因子、脾淋巴细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答水平。结果全酵母疫苗能够有效表达HPV16-E7蛋白;疫苗小鼠免疫,能够刺激脾淋巴细胞增殖,并诱导出Th1型细胞因子和特异性CTL杀伤效应;免疫效果优于单纯HPV16-E7蛋白免疫(P<0.01)。结论全酵母疫苗既能表达HPV16-E7蛋白,又能有效诱导特异性CTL免疫应答。研究结果为进一步进行疫苗抗肿瘤疗效研究,提供了实验基础。 展开更多
关键词 人乳头状瘤病毒 e7基因 酿酒酵母 疫苗 免疫原性
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人乳头瘤病毒16型E7抗原表达模型的构建 被引量:3
5
作者 李辉 伍欣星 《武汉大学学报(医学版)》 CAS 2004年第1期7-11,共5页
目的 :构建pEGFP HPV1 6E7表达载体 ,并观察其在肝癌细胞中的瞬时和稳定表达及小鼠肝癌细胞皮下成瘤情况 ,为建立表达HPV1 6E7的实体瘤动物模型奠定基础。方法 :应用基因重组技术 ,构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)与HPV1 6E7的融合表达载体 ... 目的 :构建pEGFP HPV1 6E7表达载体 ,并观察其在肝癌细胞中的瞬时和稳定表达及小鼠肝癌细胞皮下成瘤情况 ,为建立表达HPV1 6E7的实体瘤动物模型奠定基础。方法 :应用基因重组技术 ,构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)与HPV1 6E7的融合表达载体 ,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析 ,用脂质体转染技术将其转入小鼠肝癌细胞 ,2 4h后RT PCR检测HPV1 6E7mRNA的生成 ,荧光显微镜观察EGFP HPV1 6E7融合蛋白的表达 ,将转染细胞接种小鼠皮下 ,观察成瘤及成瘤后融合蛋白的表达情况。结果 :酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入目的基因片段及载体DNA大小、方向和插入位点均正确 ,在转染的小鼠肝癌细胞中检测到HPV1 6E7mRNA的生成和绿色荧光蛋白的表达 ,接种的转染细胞在小鼠皮下可成瘤且可检测到HPV1 6E7mRNA的生成。结论 :pEGFP HPV1 6E7表达载体便于观察转染细胞中EGFP HPV1 6E7融合蛋白的表达情况 ,小鼠肝癌细胞接种小鼠皮下可成瘤 ,成瘤后可检测到HPV1 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒 表达载体 基因转染 hpv16e7 动物模型 基因重组 抗原
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人乳头瘤病毒16 E7基因的原核表达及表达条件的优化 被引量:2
6
作者 许蓓妮 刘金花 +4 位作者 彭敏 解庭波 朱丽琴 伍欣星 吴承龙 《武汉大学学报(医学版)》 CAS 2006年第4期415-420,432,共7页
目的:构建pET-28a(+)-HPV16 E7原核表达质粒,并对其表达条件进行优化,为进一步研究HPV16E7致病机制及HPV疫苗提供相应的技术平台。方法:应用基因重组技术,构建pET-28a(+)与HPV16 E7(标准株和湖北株)的原核表达重组质粒,用PCR、限制性内... 目的:构建pET-28a(+)-HPV16 E7原核表达质粒,并对其表达条件进行优化,为进一步研究HPV16E7致病机制及HPV疫苗提供相应的技术平台。方法:应用基因重组技术,构建pET-28a(+)与HPV16 E7(标准株和湖北株)的原核表达重组质粒,用PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测对重组质粒DNA进行鉴定,将其转入宿主菌E.coliBL21(DE 3)进行诱导以表达蛋白;SDS-PAGE及Western blot检测鉴定表达蛋白的分子量及特异性。优化诱导表达的条件,如温度、IPTG浓度、适用的培养基,探讨不同温度下蛋白的表达形式;纯化回收HPV16 E7蛋白。结果:PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV16 E7(标准株)蛋白得到高效原核表达,最佳表达条件:表达HPV16 E7的工程菌BL21(DE 3)的最佳诱导温度是37℃,诱导剂IPTG的浓度为0.3-0.4 mmol/L,最佳培养基为1.5倍LB。结论:pET-28a(+)-HPV16 E7标准株和湖北株重组载体构建成功,人乳头瘤病毒16 E7标准株获得高效原核表达。 展开更多
关键词 hpv16 e7基因 重组 原核表达 优化
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MIP-1α和Flt3l基因佐剂联合应用对HPV16E7 DNA疫苗的免疫增强作用 被引量:2
7
作者 蓝佳明 高志云 +7 位作者 耿媛 揣侠 赵娜 韩小艳 张永红 谢立新 金玉怀 王永祥 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期305-309,314,共6页
目的:探讨巨噬细胞炎性蛋白1α(Macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)和酪氨酸激酶受体3配体(Flt3ligand,Flt3l)基因佐剂联合应用增强人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus16,HPV16)E7DNA疫苗免疫效果的可能性。方法:构建真... 目的:探讨巨噬细胞炎性蛋白1α(Macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)和酪氨酸激酶受体3配体(Flt3ligand,Flt3l)基因佐剂联合应用增强人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus16,HPV16)E7DNA疫苗免疫效果的可能性。方法:构建真核表达质粒pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7。C57BL/6小鼠随机分为8组,分别为pcDNA3组、pcDNA3/MIP-1α组、pcDNA3/Flt3l组、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/Flt3l混合组、pcDNA3/HPV16E7组、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合组、pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7混合组以及pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7混合组。每组14只,肌肉注射质粒免疫小鼠,每3周免疫1次,共3次;末次免疫后2周每组随机抽取6只小鼠,取脾脏制备淋巴细胞悬液,用CCK-8试剂盒检测其对TC-1靶细胞的特异性杀伤能力。其余小鼠在腹股沟处皮下注射5×104个TC-1细胞,观察肿瘤生长情况。结果:成功构建了真核表达质粒pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7;pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7混合组的CTL杀伤能力明显高于其它各组(P<0.01);肿瘤细胞攻击后16天,pcDNA3组小鼠全部长出肿瘤,而pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7混合组的成瘤率仅为12.5%,明显低于其他组,统计学分析示8组之间成瘤率差异有显著性(P=0.007)。60天后各组成瘤率之间的差异无统计学意义(P=0.229)。结论:联合应用MIP-1α和Flt3l基因佐剂增强了HPV16E7DNA疫苗的免疫效果,一定程度上延缓了肿瘤的发生。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒16e7 酪氨酸激酶受体3配体 巨噬细胞炎性蛋白1Α 基因佐剂 质粒 DNA疫苗
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腺病毒载体介导的HPV16E7基因沉默及其对宫颈癌CaSki细胞的影响
8
作者 李娜 刘梦琼 +3 位作者 郑义 朱永强 肖滑卫 黄来强 《现代生物医学进展》 CAS 2013年第16期3001-3004,共4页
目的:构建利用RNA干扰技术沉默HPV16E7基因的腺病毒载体,并探讨其对人宫颈癌细胞系CaSki细胞增殖的影响,以及腺病毒载体在宫颈癌基因治疗中的可行性。方法:利用腺病毒载体介导的RNA干扰对CaSki细胞中HPV16E7蛋白的表达进行抑制。显微镜... 目的:构建利用RNA干扰技术沉默HPV16E7基因的腺病毒载体,并探讨其对人宫颈癌细胞系CaSki细胞增殖的影响,以及腺病毒载体在宫颈癌基因治疗中的可行性。方法:利用腺病毒载体介导的RNA干扰对CaSki细胞中HPV16E7蛋白的表达进行抑制。显微镜观察细胞病变情况。MTT实验用来检测腺病毒载体感染的CaSki细胞的增殖情况。结果:成功构建了用以介导CaSki细胞中HPV16E7基因沉默的腺病毒载体。腺病毒感染后的CaSki细胞发生典型病理变化,HPV16E7基因表达受到明显抑制,细胞分裂明显减慢。结论:腺病毒载体介导的RNA干扰能够特异性的沉默HPV16E7基因,抑制CaSki细胞的增殖,为腺病毒载体用于宫颈癌基因治疗的可行性提供了依据。 展开更多
关键词 宫颈癌 hpv16e7基因 腺病毒载体 RNA干扰 CASKI细胞
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人乳头瘤病毒16型(新疆株)E7基因的克隆与突变研究
9
作者 张茂祥 张富春 +4 位作者 蹇晓红 马正海 王芸 张馨玉 王宾 《生物技术》 CAS CSCD 2003年第6期4-6,共3页
目的 :克隆分析人乳头瘤病毒 16型 (HPV16 )新疆株的E7基因 ;并对E7基因进行突变改造 ,以比较野生型与突变型HPV16E7基因的功能。方法 :根据从中国新疆维吾尔族妇女宫颈癌活检组织标本中提取的DNA ,进行PCR扩增获得HPV16E7基因 ,然后分... 目的 :克隆分析人乳头瘤病毒 16型 (HPV16 )新疆株的E7基因 ;并对E7基因进行突变改造 ,以比较野生型与突变型HPV16E7基因的功能。方法 :根据从中国新疆维吾尔族妇女宫颈癌活检组织标本中提取的DNA ,进行PCR扩增获得HPV16E7基因 ,然后分别将其克隆到pMD18-T载体上进行DNA序列分析。根据HPV16E7基因的特点 ,分别设计点突变引物 ,用PCR的方法进行HPV16E7基因的点突变。结果 :PCR检测显示扩增出HPV16 (新疆株 )E7基因 ;测序结果表明HPV16 -XJ的E7基因全长2 97bp ,与德国标准株一致 ;利用设计突变位点的引物经PCR扩增 ,经序列测定后 ,分别得到了第 70、172、2 71位碱基突变的HPV16E7基因 ;分别构建了野生型与单、双、三点突变的重组质粒pMD18-T -HPV16E7。结论 :人乳头瘤病毒 16型 (新疆株 )E7基因结构与德国标准株相同。HPV16E7基因多点突变的改造 ,为探索HPV16E7基因功能的变化和开展疫苗研究奠定了理论基础。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒 e7基因 克隆 突变
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HPV16E7-HSP70 Hybrid DNA Vaccine Induces E7-Specific Cytotoxic T Cells and Antitumor Immunity 被引量:2
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作者 ZHU Liqin LI Hui XIONG Jinhu WANG Tongxiang OU Xuan WEI Yun WU Xinxing 《Wuhan University Journal of Natural Sciences》 CAS 2006年第3期749-755,共7页
Using human papillomavirus type 16 (HPV16) E7 as an antigen and Heat Shock Protein 70 as adjuvant, we constructed a DNA vaccine by linking HSP70 gene to E7^C91G; gene. Mice, after being immunized with E7^C91G;-HSP70... Using human papillomavirus type 16 (HPV16) E7 as an antigen and Heat Shock Protein 70 as adjuvant, we constructed a DNA vaccine by linking HSP70 gene to E7^C91G; gene. Mice, after being immunized with E7^C91G;-HSP70, E7^C91G/HSP70, E7^C91G, and wild E7 DNA vaccines respectively, produced E7 specific CD8^+ T-cell precursor frequencies of 280.33±2.52, 144.34±4.04, 164.34±5.13 and 82.33±3.51 respectively within every 1 × 10^5 mouse splenocytes. This proves that E7^C91G-HSP70 fusion vaccine can significantly enhance the E7 specific cellular immunity within the mice body(p〈0. 01). After being immunized with E7^C91G-HSP70 fusion vaccine, tumor-bearing mice of the group being treated have significantly longer latency and survival periods, comparing with other three categories of E7 vaccines. Experiment shows that this vaccine has a significant effect on enhancing E7 positive tumor-treatment within mice body. After being immunized with E7^C91G-HSP70 vaccine, there were no pathological changes found in livers, kidneys and spleens of the mice, which proves that the vaccine is quite safe. After all, E7^C91G-HSP70 fusion vaccine has a much stronger tumor- treatment effect than thai of wild type E7 DNA vaccine. 展开更多
关键词 human papillomavirus type 16 hpv16 e7 gene DNA vaccine cellular immunity
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