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经肝动脉插管注射重组腺病毒治疗大鼠转移性肝癌的实验研究 被引量：31
1
作者 郝强 田建明 +5 位作者 曹雪涛 王培军 章卫平 杨继金 贾雨辰 于益芝 《中华放射学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2000年第10期666-669,共4页
目的　观察经动脉插管导入肿瘤坏死因子α(TNF α)和白细胞介素 2 (IL 2 )重组腺病毒对转移性大鼠肝癌模型的治疗作用。方法　用 2 93细胞扩增人TNF α(以下简称TNF)和IL 2重组腺病毒 ,并测定病毒滴度 ;取大鼠乳腺癌细胞株 (Walker 2 5 ... 目的　观察经动脉插管导入肿瘤坏死因子α(TNF α)和白细胞介素 2 (IL 2 )重组腺病毒对转移性大鼠肝癌模型的治疗作用。方法　用 2 93细胞扩增人TNF α(以下简称TNF)和IL 2重组腺病毒 ,并测定病毒滴度 ;取大鼠乳腺癌细胞株 (Walker 2 5 6 )转染至肝脏的荷瘤大鼠动物模型 ,经肝固有动脉分别注入不同剂量的重组腺病毒 ,首先确定人肿瘤坏死因子 (hTNF)基因的最适用量 ;然后分为hTNF组 ,人IL 2 (hIL 2 )组 ,hTNF +hIL 2组 ,病毒对照组 (LacZ组 )和培养液对照组进行治疗 ,观察大鼠生存期。结果　所制备的人TNF α和IL 2重组腺病毒滴度为 2× 10 9pfu/ml和 2 .1× 10 9pfu/ml。经肝固有动脉注射肿瘤坏死因子重组腺病毒 (Ad .hTNF)的适宜剂量为 1.0× 10 9pfu。治疗结果显示 ,单独注射TNF α或IL 2重组腺病毒能有效延长转移性肝癌大鼠的存活期 ;这两种重组腺病毒单独使用时 ,治疗效果之间存在显著性差异 ;联合应用这两种重组腺病毒比单一使用TNF α或IL 2重组腺病毒能更有效地延长荷瘤大鼠的存活期。结论　经肝动脉插管注射目的基因重组腺病毒 ,可能是基因治疗肿瘤的一种较为有效的途径 。 展开更多
关键词 转移性肝癌 经肝动脉插管注射 重组腺病毒
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Baxα高表达PC12细胞系的建立及(-)黄皮酰胺抗细胞凋亡作用机制的研究 被引量：16
2
作者 王润生 张均田 《药学学报》 CSCD 北大核心 2000年第6期404-407,共4页
目的　用Baxα高表达的PC12细胞研究了 (- )黄皮酰胺的抗细胞凋亡作用。方法　先将BaxαcDNA从原核载体 pBluescriptSK克隆到真核载体 pcDNA3。用脂质体转染的方法将 pcDNA3 Baxα导入PC12细胞。以 6 羟基多巴胺 (6 OHDA)诱导Baxα高... 目的　用Baxα高表达的PC12细胞研究了 (- )黄皮酰胺的抗细胞凋亡作用。方法　先将BaxαcDNA从原核载体 pBluescriptSK克隆到真核载体 pcDNA3。用脂质体转染的方法将 pcDNA3 Baxα导入PC12细胞。以 6 羟基多巴胺 (6 OHDA)诱导Baxα高表达PC12细胞的凋亡。结果　 (- )黄皮酰胺 (0 1～ 10 μmol·L-1)可使细胞凋亡率显著降低。结论　 (- )黄皮酰胺可以抑制细胞凋亡 。 展开更多
关键词 细胞凋亡 BAX基因 黄皮酰胺 神经退行性病变
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新型噬菌体展示载体pCANTAB5S的构建 被引量：14
3
作者 徐容 潘卫 +6 位作者 沈毅 陈秋莉 潘欣 冯春芝 戚中田 刘彦君 邓松华 《安徽医科大学学报》 CAS 2004年第2期83-86,共4页
目的　进一步改造噬菌体展示载体 ,使之能更有效地展示各种外源随机多肽文库。方法　以 pCANTAB5X IFN α2b重组质粒为模板 ,在上游引物中引入XbaⅠ、SacⅠ酶切位点 ,在下游引物中引入SacⅠ、StuⅠ、SalⅠ酶切位点 ,将用该引物扩增的IFN... 目的　进一步改造噬菌体展示载体 ,使之能更有效地展示各种外源随机多肽文库。方法　以 pCANTAB5X IFN α2b重组质粒为模板 ,在上游引物中引入XbaⅠ、SacⅠ酶切位点 ,在下游引物中引入SacⅠ、StuⅠ、SalⅠ酶切位点 ,将用该引物扩增的IFN α2b衔接片段PCR产物克隆到pMD18 T中 ,再将该片段用XbaⅠ和SalⅠ酶切并将之插入pCANTAB5L的XbaⅠ和SalⅠ位点中 ,经SacⅠ酶切 ,线性载体片段自连 ,构成新型噬菌体展示载体 pCANTAB5S。 结果　限制酶切位点SacⅠ被引入到噬菌体展示载体 ,并校正了pCANTAB5L载体StuⅠ、SalⅠ等位点的读框。结论　成功构建了含读框正确的SacⅠ等多个克隆位点的新型噬菌体展示载体pCANTAB5S ,可用于各种外源随机多肽文库的有效展示。 展开更多
关键词 噬菌体 pCANTAB5S 遗传学 质粒 遗传载体 肽库
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HCVC基因腺病毒表达载体骨架质粒pAd.HCV-C的构建、鉴定及表达 被引量：15
4
作者 郝春秋 周永兴 +3 位作者 冯志华 李谨革 贾战生 王平忠 《世界华人消化杂志》 CAS 2001年第6期635-639,共5页
目的构建能表达HVC基因的腺病毒表达载体的重组骨架质粒,为进一步包装能高效表达HCVC基因的腺病毒载体做准备。方法用分别含有BgⅡ及HindⅢ酶切位点的HCVC区基因上、下游引物,以含有HCV H株基因序列的质粒pBRTM/HCV1-3011为模板,通过PC... 目的构建能表达HVC基因的腺病毒表达载体的重组骨架质粒,为进一步包装能高效表达HCVC基因的腺病毒载体做准备。方法用分别含有BgⅡ及HindⅢ酶切位点的HCVC区基因上、下游引物,以含有HCV H株基因序列的质粒pBRTM/HCV1-3011为模板,通过PCR扩增获得HCVC区基因片段,基因片段回收后,以BglⅡ及HindⅢ双酶切,定向插入到腺病毒骨架质粒pAd,CMV-Link.1中CMV启动子下游BglⅡ与HindⅢ位点之间,获得重组表达质粒pAd.HCV-C通过BglⅡ/HindⅢ双酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行了鉴定,以抗HCVC单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法检测了pAd.HCV-C在人肝癌细胞7721中的瞬时表达。结果酶切、PCR及测序鉴定证实,pAd,HCV-C插入片段为HCVC区基因片段,免疫荧光法检测表明其可以在7721细胞中瞬时表达。结论构建的质粒pAd.HCV-C可以在7721细胞中瞬时表达HCVC区基因,为包装表达HCVC基因的腺病毒载体奠定了基础。 展开更多
关键词 C型肝炎样病毒属 遗传学 病毒基因 腺病毒科 遗传载体
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反义人骨形态发生蛋白2基因逆转录病毒表达载体的构建及其对骨肉瘤细胞生物学行为的影响 被引量：8
5
作者 岳文 杨连甲 +5 位作者 李鑫 董绍忠 晏伟 朱峰 张殿忠 范清宇 《中华骨科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2000年第9期525-528,共4页
目的 从分子水平探讨骨形态发生蛋白 2(BMP-2)基因对骨肉瘤生物学行为的影响，并为骨肉瘤的基因治疗提供理论依据。方法 将人 BMP-2基因约 1.0 kb的 cDNA片段反向插入逆转录病毒表达载体 PDOR,构建人 BMP-2基因的反义逆转录表达载体，... 目的 从分子水平探讨骨形态发生蛋白 2(BMP-2)基因对骨肉瘤生物学行为的影响，并为骨肉瘤的基因治疗提供理论依据。方法 将人 BMP-2基因约 1.0 kb的 cDNA片段反向插入逆转录病毒表达载体 PDOR,构建人 BMP-2基因的反义逆转录表达载体，然后用脂质体将重组的 PDOR-BMP-2质粒转染至人的骨肉瘤细胞 OS-9901，经 G 418筛选并获得阳性克隆。用免疫组织化学卵白素-生物素-过氧化酶 (ABC)方法检测肿瘤细胞中 BMP和增殖细胞核抗原 (PCNA)的表达。应用流式细胞仪分析肿瘤细胞增殖周期并对其进行电镜观察。结果 转染后， OS-9901肿瘤细胞的内源性 BMP表达明显下降 (t=24.01。 展开更多
关键词 骨形态发生蛋白2 骨肉瘤 DNA 基因治疗
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人胃癌细胞端粒酶RNA组分hTR基因片段的克隆及其正反义真核表达载体的构建 被引量：11
6
作者 冯润华 李建芳 +2 位作者 刘炳亚 朱正纲 尹浩然 《世界华人消化杂志》 CAS 2001年第12期1409-1414,共6页
目的克隆人胃癌细胞端粒酶RNA组分(hTR)基因片段并构建其正义和反义真核表达载体,为以端粒酶为靶目标的肿瘤基因治疗奠定基础。方法采用RT-PCR方法从人胃癌细胞株MKN-45中扩增出人hTR部分cDNA序列。将该片段插入pEF6/V5-His-TOPO载体后... 目的克隆人胃癌细胞端粒酶RNA组分(hTR)基因片段并构建其正义和反义真核表达载体,为以端粒酶为靶目标的肿瘤基因治疗奠定基础。方法采用RT-PCR方法从人胃癌细胞株MKN-45中扩增出人hTR部分cDNA序列。将该片段插入pEF6/V5-His-TOPO载体后构建人端粒酶RNA组分(hTR)基因正义真核表达载体(pEF-hTR)。随后采用EcoRV和SpeⅠ从pEF-hTR上切下该目的基因片段并反向插入pBluescriptⅡKS载体上的EcoRV/SpeⅠ酶切位点上。最后采用KpnⅠ和NotⅠ从pBluescriptⅡKS载体上切下该目的基因片段并正向插入pEF-hTR的KpnⅠ/NotⅠ酶切位点上从而构建出人端粒酶RNA组分(hTR)基因反义真核表达载体(pEF-ahTR)。对所构建的载体均进行酶切鉴定和测序确认。结果所克隆的基因片段其碱基序列与文献报道完全一致,且插入载体的方向完全正确。结论本实验已成功克隆了人端粒酶RNA组分(hTR)基因的部分序列并成功构建其正义、反义真核表达载体,从而为研究反义抑制人胃癌细胞端粒酶活性对胃癌细胞生物学行为的影响奠定了基础。 展开更多
关键词 胃肿瘤 病理学 端粒 末端转移酶 遗传学 RNA 遗传载体 克隆细胞
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重组人肝再生增强因子原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 被引量：7
7
作者 刘杞 石小枫 +1 位作者 罗娅 张定凤 《中华肝脏病杂志》 CAS CSCD 2000年第1期9-11,共3页
目的用聚合酶链反应法（ＰＣＲ）和基因重组技术构建重组人肝再生增强因子原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。方法利用 ＰＣＲ方法从我们构建的ｐＵＣ１９－ｈＡＬＲ质粒中扩增出带Ｎｄｅｌ和 ＢａｍＨＩ酶切位点的ｈＡＬＲ编码区Ｄ... 目的用聚合酶链反应法（ＰＣＲ）和基因重组技术构建重组人肝再生增强因子原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。方法利用 ＰＣＲ方法从我们构建的ｐＵＣ１９－ｈＡＬＲ质粒中扩增出带Ｎｄｅｌ和 ＢａｍＨＩ酶切位点的ｈＡＬＲ编码区ＤＮＡ。ＰＣＲ产物和质粒ｐＥＴ１１ａ分别被相应内切酶消化，然后被Ｔａ ＤＮＡ连接酶连接以获取重组表达质粒。重组表达质粒ｐＥＴ１１３－ｈＡＬＲ经电转化人大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，在ＩＰＴＧ诱导下表达ｒｈＡＬＲ。结果内切酶消化和ＤＮＡ测序证实ｈＡＬＲ的编码区正确地插人载体，重组ｈＡＬＲ在大肠杆菌中成功地表达。其分子量是１．５×１０４与预计的理论值相符合，表达量占菌体总蛋白的３０％；它不仅存在于破碎菌的上清液中，也存在于沉淀中。结论ｈＡＬＲ表达质粒的成功构建和重组ｈＡＬＲ在大肠杆菌中的成功表达，为进一步研究它的生物学功能和制备相应抗体奠定了基础。 展开更多
关键词 基因表达 肝再生增强因子 肝再生 大肠杆菌
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腺病毒载体介导bcl-2基因转染对周围神经再生修复的影响 被引量：6
8
作者 杨萍 应大君 +1 位作者 宋林 孙建森 《中华创伤杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第7期417-421,共5页
目的　探讨腺病毒载体中介bcl- 2基因转染对周围神经再生修复的影响。　方法选用SD大鼠坐骨神经切断损伤模型 ,神经外膜端端对线缝合后 ,于神经缝合处远端 0 .5cm处分别注射Ad s-bcl- 2、Ad as -bcl- 2、Ad lacZ和等渗盐水。术后 4 8h、... 目的　探讨腺病毒载体中介bcl- 2基因转染对周围神经再生修复的影响。　方法选用SD大鼠坐骨神经切断损伤模型 ,神经外膜端端对线缝合后 ,于神经缝合处远端 0 .5cm处分别注射Ad s-bcl- 2、Ad as -bcl- 2、Ad lacZ和等渗盐水。术后 4 8h、7,15和 30d常规 4 0g L多聚甲醛灌注固定 ,取脊髓L4～ 6 节段冰冻切片 ,行x -gal染色、bcl- 2免疫组化和原位杂交染色、GAP - 4 3组化染色 ;并动态观察坐骨神经功能指数 (SFI)以了解后肢恢复情况。　结果　Ad s-bcl - 2组脊髓前角运动神经元中GAP - 4 3表达均较其他组高 (P <0 .0 5 ) ,SFI恢复最好 ;Ad as -bcl- 2组神经元中GAP - 4 3的表达较其他组低 (P <0 .0 5 ) ,SFI恢复最差 ;Ad LacZ组与等渗盐水组比较 ,差异无显著性意义 (P >0 .0 5 )。　结论　腺病毒载体中介bcl- 2基因转染能促进坐骨神经损伤后再生和功能恢复。 展开更多
关键词 腺病毒载体 BCL-2 基因转染 周围神经再生 修复 遗传载体
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逆转MDR-1小干扰RNA的慢病毒载体系统的构建和鉴定 被引量：7
9
作者 钟琦 黄志刚 +5 位作者 房居高 陈晓红 张伟 黑虎 王鸿 韩德民 《中国耳鼻咽喉头颈外科》 北大核心 2007年第9期505-509,共5页
目的构建并鉴定表达MDR-1小干扰RNA的慢病毒载体系统并检测其对于喉癌多药耐药细胞系(LSC-1/TAX)多药耐药表型的逆转效果。方法根据MDR-1基因序列,设计3条寡聚核苷酸序列,合成互补DNA链,插入慢病毒表达质粒pLVTHM中,与pCMV-dR8.74和pMD2... 目的构建并鉴定表达MDR-1小干扰RNA的慢病毒载体系统并检测其对于喉癌多药耐药细胞系(LSC-1/TAX)多药耐药表型的逆转效果。方法根据MDR-1基因序列,设计3条寡聚核苷酸序列,合成互补DNA链,插入慢病毒表达质粒pLVTHM中,与pCMV-dR8.74和pMD2G共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。以RT-PCR、realtimePCR及Westernblot方法检测三条siRNA在人喉癌耐药细胞系(LSC-1/TAX)中的干扰效率,并采用MTT方法检测干扰前后化疗药物的敏感性。结果通过酶切和测序证实慢病毒载体构建正确,产生能够表达GFP和siRNA的慢病毒颗粒,浓缩滴度为>1×108TU/ml。三条siRNA均可以感染LSC-1/TAX细胞系,其中第三条siRNA敲减效果最佳。结论成功建立逆转MDR-1小干扰RNA的慢病毒载体系统,为逆转喉癌多药耐药表型的实验奠定了基础。 展开更多
关键词 抗药性 多药 喉肿瘤 RNA干扰 慢病毒属 遗传载体
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热休克蛋白70重组腺病毒载体的构建及鉴定 被引量：8
10
作者 徐小娜 曲彦 《青岛大学医学院学报》 CAS 2008年第2期162-164,167,共4页
目的构建人热休克蛋白70(HSP70)的腺病毒表达载体,为进一步研究HSP70对应激状态下细胞的保护作用提供实验基础。方法采用AdEasy系统构建携带外源性HSP70编码基因的重组腺病毒载体pAd-HSP70,脂质体法转染人胚肾293细胞,包装产生重组腺病... 目的构建人热休克蛋白70(HSP70)的腺病毒表达载体,为进一步研究HSP70对应激状态下细胞的保护作用提供实验基础。方法采用AdEasy系统构建携带外源性HSP70编码基因的重组腺病毒载体pAd-HSP70,脂质体法转染人胚肾293细胞,包装产生重组腺病毒vAdvHSP。收获病毒进行滴度鉴定,RT-PCR方法检测目的基因在Hela细胞的转录表达。结果PCR、序列测定以及限制性酶切证实HSP70基因正确插入腺病毒表达载体,并在HEK293细胞中包装出重组腺病毒;荧光显微镜下可观察到GFP的表达,收获病毒的滴度为3.2×1012U/L。结论成功构建pAd-HSP70重组腺病毒表达载体,且重组腺病毒在Hela细胞能有效转录。 展开更多
关键词 HSP70热休克蛋白质类 腺病毒科 遗传载体
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真核双表达载体pIRES-hVEGF_(121)cDNA/hBMP-4的构建与鉴定 被引量：6
11
作者 韩雷 汪春兰 +5 位作者 赵宇 何金生 王帮河 王兴宇 杨兵 周志林 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2007年第2期133-136,共4页
目的构建人血管内皮生长因子(hVEGF121)和人骨形态发生蛋白-4(hBMP-4)的真核双表达质粒,转染COS-7细胞并表达。方法将hVEGF121 cDNA和hBMP-4通过非定向和定向克隆至真核双表达质粒pIRES中,重组质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4,经酶切鉴定... 目的构建人血管内皮生长因子(hVEGF121)和人骨形态发生蛋白-4(hBMP-4)的真核双表达质粒,转染COS-7细胞并表达。方法将hVEGF121 cDNA和hBMP-4通过非定向和定向克隆至真核双表达质粒pIRES中,重组质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4,经酶切鉴定后,转染COS-7细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western blot检测。结果真核双表达载体pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4构建成功且hVEGF121cDNA和hBMP-4在COS-7细胞中得到了有效表达。结论hVEGF121和hBMP-4在COS-7细胞中成功表达,为进一步研究打下良好基础。 展开更多
关键词 血管内皮生长因子类/遗传学 骨形态发生蛋白质类/遗传学 遗传载体 基因表达
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用限制性内切酶制备T载体 被引量：8
12
作者 陆哲明 柯杨 《北京大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期726-728,共3页
目的 :介绍一种制备T载体的方法。方法 :用限制性内切酶XcmⅠ酶切 ,在两端产生T末端 ,制备的T载体可直接用来克隆用TaqDNA聚合酶产生带A末端的PCR产物。 结果 :PCR产物直接和T载体连接 ,用常规氯化钙法制备的感受态菌转化 ,对转化子提... 目的 :介绍一种制备T载体的方法。方法 :用限制性内切酶XcmⅠ酶切 ,在两端产生T末端 ,制备的T载体可直接用来克隆用TaqDNA聚合酶产生带A末端的PCR产物。 结果 :PCR产物直接和T载体连接 ,用常规氯化钙法制备的感受态菌转化 ,对转化子提取质粒进行酶切鉴定 ,证明阳性率达 80 %。结论 :制备T载体过程简单 ,质量稳定 ,产量高 。 展开更多
关键词 T载体 DNA限制酶类 遗传载体 基因扩增
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新型基因载体巯基烷基化壳聚糖的制备及体外性质的初步研究 被引量：6
13
作者 白欣 慕卿 +5 位作者 李树宝 张梅 何金生 方月娥 汪春兰 赵宇 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2009年第2期162-167,共6页
目的制备巯基烷基化壳聚糖(TACS)载基因纳米粒,并对其体外相关性质进行初步研究。方法复凝聚法制备TACS/pDNA复合纳米粒子,并用透射电镜对其的形态和粒径进行观察和表征;凝胶阻滞分析观察其对基因的保护情况;以Lipofectamine 2000转染... 目的制备巯基烷基化壳聚糖(TACS)载基因纳米粒,并对其体外相关性质进行初步研究。方法复凝聚法制备TACS/pDNA复合纳米粒子,并用透射电镜对其的形态和粒径进行观察和表征;凝胶阻滞分析观察其对基因的保护情况;以Lipofectamine 2000转染试剂作为阳性对照,检测其对人胚胎肾细胞(HEK293)的转染活性;四噻氮唑盐(MTT)比色法测定其对细胞活性的影响。结果TACS/pDNA复合纳米粒子形态不很均一,粒径在390nm左右;凝胶阻滞分析证明了载体能有效地包裹和保护基因不受DNaseⅠ酶的消化;体外基因转染实验证实了TACS纳米粒子能够有效地转染HEK293,其转染效率远高于壳聚糖纳米粒子,略低于脂质体;MTT测定其对细胞活力影响甚微,对细胞的毒性明显低于脂质体。结论TACS有望成为一种有价值的新型基因载体。 展开更多
关键词 遗传载体 壳聚糖 转染
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mIL-4昆虫表达载体pIZT/V5-His的构建及其高效表达 被引量：3
14
作者 孙延波 李菁华 史红艳 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期194-195,198,共3页
目的:构建昆虫表达载体pIZT/V5-His的基础上,建立能稳定高效表达mIL-4的昆虫细胞系。方法:PCR体外扩增mIL-4,将目的基因mIL-4和昆虫表达载体pIZT/V5-His用EcoRI和XbaI做双酶切,通过T4 DNA连接酶构建成含mIL-4目的基因的表达载体pIZT/V5-... 目的:构建昆虫表达载体pIZT/V5-His的基础上,建立能稳定高效表达mIL-4的昆虫细胞系。方法:PCR体外扩增mIL-4,将目的基因mIL-4和昆虫表达载体pIZT/V5-His用EcoRI和XbaI做双酶切,通过T4 DNA连接酶构建成含mIL-4目的基因的表达载体pIZT/V5-His-IL4。采用脂质体法将重组DNA转染到生长良好的昆虫细胞Sf9中。转染后的第3天,用ELISA方法检测转染细胞的培养上清中分泌型蛋白mIL-4的含量。结果:转染后的昆虫细胞Sf9能产生大量的mIL-4,含量可达1 mg.L-1,明显高于对照组(0.003 mg.L-1)。结论:昆虫表达载体pIZT/V5-His可用于mIL-4的高效表达。 展开更多
关键词 白细胞介素4 昆虫细胞SF9 基因表达 遗传载体
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人胰岛素原基因在体外培养的NIH3T3细胞中的基因转移和表达的研究 被引量：2
15
作者 白然 李昌臣 +3 位作者 李跃 马郁芳 陈磊 谷玲 《中华内分泌代谢杂志》 CSCD 北大核心 2000年第1期34-37,共4页
目的　研究人胰岛素原基因在体外培养的小鼠成纤维细胞NIH 3T3细胞系的基因转移和表达情况 ,进而为 1型糖尿病的基因治疗提供实验依据。方法　采用脂质体转染法分别将未携带外源基因的反转录病毒载体 pLNCX和携带大鼠磷酸烯醇式丙酮酸... 目的　研究人胰岛素原基因在体外培养的小鼠成纤维细胞NIH 3T3细胞系的基因转移和表达情况 ,进而为 1型糖尿病的基因治疗提供实验依据。方法　采用脂质体转染法分别将未携带外源基因的反转录病毒载体 pLNCX和携带大鼠磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 (PEPCK)启动子 人胰岛素原基因 (INS)的重组反转录病毒载体pN PEPCK INS转染到体外培养的NIH 3T3细胞系中。转染后 72小时 ,用G418筛选出阳性细胞克隆并培养至 2 4天 ,提取细胞的染色体DNA ,行PCR扩增 ,电泳检查转入基因情况。同时用放射免疫分析方法监测培养液的胰岛素水平及转染后 2 4天的细胞内胰岛素水平。结果　PCR证实pLNCX和 pN PEPCK INS均整合到NIH 3T3细胞的染色体中。培养液的胰岛素水平在转染前后均无明显变化 (P >0 .0 5 ) ,而转入 pN PEPCK INS的NIH 3T3细胞内的胰岛素水平则于转染后 2 4天明显高于未转染组 (P <0 .0 1)及pLNCX转染组 (P <0 .0 5 )。结论人胰岛素原基因在NIH 3T3细胞系的转移成功和在细胞内的高效表达说明基因治疗有望成为 1型糖尿病的有效治疗途径之一。 展开更多
关键词 胰岛素原 基因 糠尿病 NIH-3T3细胞 基因治疗
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VEGF_(165)正反义表达载体的构建及其对人胃癌细胞VEGF表达的调节 被引量：6
16
作者 刘都户 张渭 +2 位作者 粟永萍 张学庸 黄裕新 《世界华人消化杂志》 CAS 2001年第8期886-891,共6页
目的构建 VEGF_(165)(vascular endothelial growth factor,血管内皮生长因子)正、反义表达载体,将其转染人胃癌细胞,观察其对胃癌细胞 VEGF 在 mRNA 和蛋白质水平表达的调节作用.方法用限制性内切酶将 VEGF_(165) cDNA 从 pGEM-hVEGF_(... 目的构建 VEGF_(165)(vascular endothelial growth factor,血管内皮生长因子)正、反义表达载体,将其转染人胃癌细胞,观察其对胃癌细胞 VEGF 在 mRNA 和蛋白质水平表达的调节作用.方法用限制性内切酶将 VEGF_(165) cDNA 从 pGEM-hVEGF_(165)克隆载体上切下来,以正、反方向插入质粒 pCDNA_3中,构建VEGF_(165)正、反义真核表达载体;用限制性内切酶和 Sanger 双脱氧终止 DNA 测序法证明 VEGF_(165)正、反义表达载体目的基因的序列和方向的正确性;用脂质体将 VEGF_(165)正、反义表达载体转染人胃癌细胞,用 RNA 斑点杂交及免疫荧光流式细胞仪检测 VEGF mRNA 和蛋白质的表达水平.结果酶谱分析及 DNA 测序表明 VEGF_(165)正、反义真核表达载体目的基因的序列及方向正确;转染正义表达载体后 VEGF mRNA和蛋白质表达水平增加(蛋白免疫强度为75.4%;P<0.05 vs 对照组,31.6%),转染反义表达载体后 VFGF mRNA 和蛋白表达水平降低(蛋白免疫强度为8.9%;P<0.05 vs 对照组).结论成功地构建了 VEGF_(165)正、反义真核表达载体;构建的载体能在胃癌细胞内有效表达,调节血管内皮生长因子的水平. 展开更多
关键词 VEGF 血管内皮生长因子 遗传学 胃肿瘤 病理学 基因表达
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第三代腺病毒载体的改良与应用 被引量：4
17
作者 陈琳 薛绪潮 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期722-725,共4页
腺病毒载体是一种非常有效的转基因载体,具有高效率、低致病性、高滴度及不整合入宿主细胞染色体等优点,广泛应用于基因治疗。第一、二代腺病毒载体仍有许多不足之处,在其基础上发展了第三代腺病毒载体。第三代腺病毒载体与前者相比,具... 腺病毒载体是一种非常有效的转基因载体,具有高效率、低致病性、高滴度及不整合入宿主细胞染色体等优点,广泛应用于基因治疗。第一、二代腺病毒载体仍有许多不足之处,在其基础上发展了第三代腺病毒载体。第三代腺病毒载体与前者相比,具有低免疫原性及高容量等优点,在基因治疗中表现出独特优势。然而,由于辅助病毒污染的存在及病毒产量有待提高,第三代腺病毒载体的临床应用仍面临一定困难。 展开更多
关键词 第三代腺病毒 遗传载体 辅助病毒
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人细小病毒B19 VP1独特区基因变异的研究 被引量：3
18
作者 钱新宏 张国成 +6 位作者 焦西英 张萍 孙新 曹玉红 许东亮 费琳琳 黄文晋 《中华儿科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期128-130,共3页
目的　获取人细小病毒B19(HPVB19)VP1独特区基因 ,并进行序列测定及变异分析 ,为研制诊断试剂及预防疫苗创造条件。方法　应用聚合酶链反应 (PCR)技术从 1例急性特发性血小板减少性紫癜患儿的血清中扩增HPVB19VP1独特区基因片段 ,将其... 目的　获取人细小病毒B19(HPVB19)VP1独特区基因 ,并进行序列测定及变异分析 ,为研制诊断试剂及预防疫苗创造条件。方法　应用聚合酶链反应 (PCR)技术从 1例急性特发性血小板减少性紫癜患儿的血清中扩增HPVB19VP1独特区基因片段 ,将其克隆至pGEM Teasy载体 ,转化大肠杆菌DH5α ,筛选阳性克隆 ,测定目的基因的序列。结果　成功地扩增到HPVB19VP1独特区全长基因 ,长度为 70 5个核苷酸 ,测定结果与Genbank中GallinellaG和VenturoliS所发表的HPVB19VP1独特区全长基因序列比较 ,有 2处核苷酸发生突变 ,但所编码的氨基酸均未发生变化。结论　 ( 1)HPVB19VP1独特区有基因变异 ;( 2 )构建了HPVB19VP1独特区基因的重组质粒 。 展开更多
关键词 人细小病毒B19 DNA结合蛋白类 转录因子 遗传载体 变异 序列分析 儿童 病毒感染
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人notch1-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定 被引量：3
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作者 张燕 张明芳 +1 位作者 林玲 郑志竑 《福建医科大学学报》 2009年第3期211-216,共6页
目的构建人notch1-shRNA慢病毒表达载体,为Notch信号通路的相关研究奠定基础。方法根据人notch1基因mRNA序列设计并合成两条互补的DNA单链寡核苷酸,将退火后形成的双链连接于pENTR/U6质粒,通过与pLenti6/BLOCK-iT-DEST载体的LR重组,构建... 目的构建人notch1-shRNA慢病毒表达载体,为Notch信号通路的相关研究奠定基础。方法根据人notch1基因mRNA序列设计并合成两条互补的DNA单链寡核苷酸,将退火后形成的双链连接于pENTR/U6质粒,通过与pLenti6/BLOCK-iT-DEST载体的LR重组,构建notch1-shRNA慢病毒表达载体,经脂质体介导入293FT细胞,包装成慢病毒。用该慢病毒感染人神经母细胞瘤系SH-SY5Y细胞,RT-PCR和Westernblot法检测细胞notch1基因的表达。结果目的序列成功连接于载体并包装成较高滴度的慢病毒,细胞mRNA和蛋白质的检测均表明构建的notch1-shRNA慢病毒表达载体LR-ND-A能显著抑制SH-SY5Y细胞notch1基因的表达。结论成功构建人notch1-shRNA慢病毒表达载体。 展开更多
关键词 RNA 基因表达 慢病毒属 遗传载体 信号传导
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pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP真核表达质粒构建 被引量：5
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作者 邵喜英 陈占红 +2 位作者 曹江 方永明 王晓稼 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期189-194,共6页
目的:构建pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP与pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP真核表达质粒,并观察pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒在MCF-7和Bcap-37细胞中的表达。方法:①采用RT-PCR技术扩增... 目的:构建pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP与pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP真核表达质粒,并观察pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒在MCF-7和Bcap-37细胞中的表达。方法:①采用RT-PCR技术扩增CYP19 cDNA,插入pcDNA3.1(+)载体中,构建pcDNA3.1(+)-CYP19表达质粒;酶切pcDNA3.1(+)-CYP19(304bp BamHⅠ)-GFP和pcDNA3.1(+)-CYP19质粒,构建pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP表达质粒;②以pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒为模板,采用定点突变技术,构建pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP和pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP及pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP表达质粒;③pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒通过脂质体介导转染MCF-7和Bcap-37细胞,荧光显微镜观察其在细胞中的表达。结果:①酶切鉴定及测序验证pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP构建成功;②测序验证pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP和pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP及pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP构建成功;③在经转染的MCF-7和Bcap-37细胞中观察到较强的绿色荧光。结论:pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP和pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP及pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP真核表达质粒已成功构建,并证实pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒能在MCF-7和Bcap-37细胞中表达,为进一步研究CYP19基因单核苷酸多态性的确切功能奠定基础。 展开更多
关键词 细胞色素P450酶系统/遗传学 质粒 遗传载体 真核细胞 CYP19基因 真核表达质粒 GFP
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