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Dietzia菌中铁氧还蛋白及其还原酶在正十六烷降解中的关键作用 被引量：1
1
作者 范裕昭 秦晓宇 +2 位作者 聂勇 吴晓磊 许子牧 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期1-6,共6页
微生物降解烷烃作为一种经济高效的方式,在环境修复和石油开采等方面起到了重要作用.在烃降解过程中主要通过红素氧还蛋白(Rd)和红素氧还蛋白还原酶(RdR)的电子传递链为中长链烷烃羟化酶AlkB提供能量;然而许多依赖于AlkB的烷烃降解菌,如... 微生物降解烷烃作为一种经济高效的方式,在环境修复和石油开采等方面起到了重要作用.在烃降解过程中主要通过红素氧还蛋白(Rd)和红素氧还蛋白还原酶(RdR)的电子传递链为中长链烷烃羟化酶AlkB提供能量;然而许多依赖于AlkB的烷烃降解菌,如Dietzia菌,其基因组中未发现已知的RdR的蛋白编码基因,因而其如何发挥AlkB的功能依然未知.以Dietzia sp.DQ12-45-1b作为模式菌株,前期研究发现铁氧还蛋白(Fd)与铁氧还蛋白还原酶(FdR)编码基因的缺失会导致菌株对正十六烷代谢的缺陷.通过构建Fd、FdR及其所在的细胞色素P450类烷烃羟化酶CYP153基因簇的敲除与回补突变株,对比野生型菌株生长表型,发现在Fd或FdR的编码基因缺失的情况下会导致菌株丧失对正十六烷的代谢能力,确定了该基因簇中Fd及FdR基因是Dietzia sp.DQ12-45-1b正十六烷降解的必需基因.此外还发现烷烃羟化酶CYP153基因的缺失并不影响菌株对正十六烷的降解利用.上述结果暗示FdR在降解过程中可能存在与其他烷烃羟化酶如AlkW等的电子传递关系,有助于进一步探索Dietzia菌的烃代谢降解过程机制.(图6表2参20) 展开更多
关键词 Dietzia菌属 烷烃降解 电子传递 铁氧还蛋白还原酶 CYP153羟化酶
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结核分枝杆菌铁氧还蛋白还原酶FdrA和FprA在CYP125A1的电子传递链中的作用分析 被引量：2
2
作者 乔峰 张健美 +5 位作者 白银磊 杨信怡 李聪然 李国庆 胡辛欣 游雪甫 《中国医药生物技术》 CSCD 2012年第3期178-186,共9页
目的体外评价结核分枝杆菌(Mtb)铁氧还蛋白还原酶FdrA和FprA的活性,探索它们分别与两种铁氧还蛋白的偶联作用,并分析它们在CYP125A1的电子传递链中的作用。方法采用大肠杆菌作为宿主克隆结核分枝杆菌FdrA、FprA和CYP125A1编码基因并进... 目的体外评价结核分枝杆菌(Mtb)铁氧还蛋白还原酶FdrA和FprA的活性,探索它们分别与两种铁氧还蛋白的偶联作用,并分析它们在CYP125A1的电子传递链中的作用。方法采用大肠杆菌作为宿主克隆结核分枝杆菌FdrA、FprA和CYP125A1编码基因并进行蛋白外源表达;以NADH或NADPH为电子供体,2,6-二氯酚靛酚(DCPIP)为电子受体评价FdrA及FprA的活性;应用细胞色素C为电子受体研究FdrA或FprA与不同铁氧还蛋白的偶联作用;分析CYP125A1对4-胆甾烯-3-酮的代谢作用进而研究FdrA和FprA在CYP125A1的电子传递链中的作用。结果 FdrA对NADH亲和力较高,Fdx对FdrA活性有明显提升作用,菠菜铁氧还蛋白(spFDX)对其活性没有提升作用,FdrA/Fdx和FdrA/spFDX均不能支持CYP125A1的活性。FprA对NAPDH亲和力较高,Fdx和spFDX均对FprA活性有明显提升作用,Fdx尤甚,FprA/spFDX可以支持CYP125A1的活性,FprA/Fdx不能支持CYP125A1的活性。结论 FprA是结核分枝杆菌CYP125A1的电子传递链蛋白,FdrA可能不是CYP125A1的电子传递链蛋白。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 铁氧还蛋白NAPP还原酶 细胞色素P450酶系统 电子传递链复合蛋白质类
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下调MTRR基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌细胞自噬和凋亡的影响及机制研究 被引量：5
3
作者 陈佳 王琪 +1 位作者 张玮 李力 《中华妇产科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期285-292,共8页
目的探讨下调甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞自噬和凋亡的影响及作用机制。方法（1）实验分为3组：下调MTRR基因表达的SKOV3/DDP细胞（SKOV3／DDP-MTRRi组）、转染阴性对照（NC）序列的SK... 目的探讨下调甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞自噬和凋亡的影响及作用机制。方法（1）实验分为3组：下调MTRR基因表达的SKOV3/DDP细胞（SKOV3／DDP-MTRRi组）、转染阴性对照（NC）序列的SKOV3／DDP细胞（SKOV3／DDP．NC组，作为阴性对照）、未转染的SKOV3／DDP细胞（SKOV3／DDP组，作为空白对照）。不同浓度（0、1、2、4μg/ml）顺铂作用后，采用流式细胞仪检测3组细胞的凋亡率，免疫荧光法检测3组细胞的自噬现象，蛋白印迹（westernblot）法检测3组细胞中自噬标志分子自噬微管相关蛋白轻链3B（LC3B）、p62蛋白的表达，透射电镜观察3组细胞中自噬体的形成情况。（2）雷帕霉素诱导后SKOV3／DDP．MTRRi细胞自噬及凋亡情况变化的检测，实验分为4组，雷帕霉素组（5nmol/L雷帕霉素处理）、雷帕霉素＋顺铂组（5nmol/L雷帕霉素＋4肛咖l顺铂处理）、顺铂组（4μg/ml顺铂处理）、空白对照组，采用westernblot法检测4组细胞中自噬标志分子LC3B、p62蛋白的表达，四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测4组细胞的生存率，流式细胞仪检测g组细胞的凋亡率。（3）4μg／ml．铂作用48h后，westernblot法检测3组（即SKOV3／DDP-MTRRi组、SKOV3／DDP-NC组、SKOV3／DDP组）细胞中凋亡相关因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）和Bcl-2家族以及磷脂酰肌醇3激酶（P13K），蛋白激酶B（Akt）自噬通路关键蛋白的表达。结果（1）不同浓度（0、1、2．4μg／ml）]顺铂组作用48h后，随着顺铂浓度的增加，3组细胞的凋亡逐渐增加，当顺铂浓度达到2μg／ml时，SKOV3／DDP．MTRRi组细胞的凋亡率[（26．2±1．4）％]明显高于SKOV3／DDP－NC组和SKOV3／DDP组[分别为（14．8±2．4）％、（14．2±214）％；P〈0．05]；免疫荧光法检测显示，随着顺铂浓度增加，SKOV3／DDP－MTRRi组细胞中LC 展开更多
关键词 卵巢肿瘤 抗药性 多药 铁氧化还原蛋白NADP还原酶 顺铂 自噬 细胞 凋亡
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蛋氨酸合成酶还原酶基因多态性与不明原因复发性流产的相关性 被引量：4
4
作者 郭谦楠 廖世秀 +4 位作者 康冰 张菊新 王睿丽 丁雪冰 张卫华 《中华妇产科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期742-746,共5页
目的探讨蛋氨酸合成酶还原酶（MTRR）A66G基因多态性与不明原因复发性流产（URSA）的相关性。方法采用PCR限制性片段长度多态性分析（PCR—RFLP）方法，对200对河南汉族URSA夫妇（URSA组）及76对有健康生育史的河南汉族夫妇（对照组）... 目的探讨蛋氨酸合成酶还原酶（MTRR）A66G基因多态性与不明原因复发性流产（URSA）的相关性。方法采用PCR限制性片段长度多态性分析（PCR—RFLP）方法，对200对河南汉族URSA夫妇（URSA组）及76对有健康生育史的河南汉族夫妇（对照组）的基因型进行分析。结果（1）MTRRA66G等位基因频率：MTRRA66G等位基因A和G的频率URSA组分别为男性76．5％（153／200）、女性72．8％（146／200）；男性23．5％（47／200）、女性27．2％（54／200）；对照组分别为男性78．9％（60／76）、女性78．3％（59／76）；男性21．1％（16／76）、女性21．7％（16／76）。MTRRA66G等位基因频率在各组不同性别者及两组同性别者间比较，差异均无统计学意义（P〉0．05）。（2）MTRRA66G基因型频率：MTRRA66G基因型AA、AG、GG频率URSA组分别为男性57．0％（114／200）、女性52．0％（104／200）；男性39．0％（78／200）、女性41．5％（83／200）；男性4．0％（8／200）、女性6．5％（13／200）；对照组分别为男性59．2％（45／76）、女性59．2％（50／76）；男性39．5％（30／76）、女性38．2％（29／76）；男性1．3％（1／76）、女性2．6％（2／76）。MTRRA66G基因型频率在各组不同性别者及两组同性别者间比较，差异也无统计学意义（P〉0．05）。（3）联合基因型频率：夫妇联合基因型GG＋GG、GG＋AG、GG＋AA、AG＋AG、AG＋AA、AA＋AA频率URSA组分别为1．0％（2／200）、2．5％（5／200）、6．0％（12／200）、20．0％（40／200）、38．O％（76／200）、32．5％（65／200）；对照组分别为0、1．3％（1／76）、2．6％（2／76）、17．1％（13／76）、42．1％（32／76）、36．8％（28／76）；两组夫妇联合基因型比较，差异也无统计学意义（P〉0．05）。结论MTRRA66G位点多态性与URSA的发生无明显相关性，不是URSA的遗传易感基因。 展开更多
关键词 铁氧化还原蛋白NADP还原酶 流产 习惯性 多态现象 遗传 聚合酶链 反应
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下调MTRR基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌SKOV3细胞体内外生物学特性的影响 被引量：3
5
作者 陈佳 王琪 +1 位作者 张玮 李力 《中华妇产科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期126-134,共9页
目的探讨下调甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌（卵巢癌）SKOV3／DDP细胞体内外生物学特性的影响。方法（1）MTRR基因下调的SKOV3／DDP细胞系的构建及鉴定：设计4个针对MTRR基因不同靶序列的短发夹状RNA（... 目的探讨下调甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌（卵巢癌）SKOV3／DDP细胞体内外生物学特性的影响。方法（1）MTRR基因下调的SKOV3／DDP细胞系的构建及鉴定：设计4个针对MTRR基因不同靶序列的短发夹状RNA（shRNA），分别为U6-GFP-Neo-homo-1106、U6-GFP—Neo-homo-1931、U6-GFP—Neo-homo-419、U6-GFP-Neo—homo-1460，蛋白印迹（western blot）法筛选干扰效果最好的针对MTRR基因的shRNA连接至pSicoR质粒，建立重组慢病毒干扰载体（即pSicoR-1106）并感染SKOV3／DDP细胞，流式细胞仪筛选稳定转染的细胞，逆转录（RT）-PCR技术及western blot法验证转染后细胞中MTRR mRNA和蛋白的表达。（2）体外实验：实验分为3组，重组慢病毒干扰载体pSicoR-1106、阴性对照质粒pSicoR-NC及包装质粒采用脂质体法分别转染肾上皮细胞系293T细胞，所得病毒上清液感染SKOV3／DDP细胞，所得感染后细胞即为下调MTRR基因的SKOV3／DDP-MTRRi细胞（SKOV3／DDP-MTRRi组）以及阴性对照SKOV3／DDP-NC细胞（SKOV3／DDP-NC组，作为阴性对照）和未转染的SKOV3／DDP细胞（SKOV3／DDP组，作为空白对照）。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定3组细胞的生长情况及其对顺铂的耐药性[以50％抑制浓度（IC50）表示]；不同浓度（0、1、2、4μg／m1）的顺铂作用后，克隆形成实验检测3组细胞的克隆形成情况，流式细胞仪检测3组细胞的细胞周期比例。（3）体内实验：将上述3组细胞接种于裸鼠的腹股沟皮下，建立卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型。以2．5mg/kg顺铂腹腔注射（每2天1次，共21次）后，观察3组（每组8只）裸鼠移植瘤的生长情况，采用免疫组化SP法检测3组裸鼠移植瘤组织中MTRR、细胞增殖相关核抗原（Ki-67）蛋白的表达。结果（1western blot法筛选的干扰效果最好的针对MTRR基因的shRNA为U6-GFP-Neo-homo-1106，以此建立重 展开更多
关键词 卵巢肿瘤 细胞系 肿瘤 铁氧化还原蛋白NADP还原酶 顺铂 细胞周期
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嗜水气单胞菌FNR的表达、纯化及酶活分析
6
作者 张凯 陈湖星 +3 位作者 余金辉 严佳丽 刘德立 熊丽 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期1003-1007,共5页
铁氧还蛋白还原酶(Ferredoxin-NADP+reductases,FNR)是一种在生物体的多种代谢中起着重要作用的黄素酶.为探讨嗜水气单胞菌(Aeromona s hydrophila)XS91-4-1中FNR的功能和结构,通过克隆其FNR基因,构建重组表达载体pET42a-fnr,表达并分... 铁氧还蛋白还原酶(Ferredoxin-NADP+reductases,FNR)是一种在生物体的多种代谢中起着重要作用的黄素酶.为探讨嗜水气单胞菌(Aeromona s hydrophila)XS91-4-1中FNR的功能和结构,通过克隆其FNR基因,构建重组表达载体pET42a-fnr,表达并分离纯化了具有活性的GST-FNR融合蛋白,根据米曼氏动力学测定了纯化蛋白对NADPH及EDTA-Fe3+的酶活力,采用生物信息学方法对XS91-4-1 FNR蛋白序列进行系统学分析,并初步预测了该蛋白三维结构.结果表明:重组质粒能够在宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中获得高效可溶性表达,经镍柱亲和层析法可纯化出电泳均一的目的蛋白,蛋白浓度为67.3μg/mL;纯化蛋白对NADPH的比活力为1.78 U/mg,对EDTA-Fe3+的比活力为1.13 U/mg,比活力比粗酶分别提高了约29和22倍;生物信息学分析表明XS91-4-1 FNR分布在Bacterial-class FNR分支上且具有与此类FNR相似的结构特点.上述结果显示嗜水气单胞菌FNR具有与已报道的FNR相似的基本特性,并推测其可能属于Bacterial-class FNR. 展开更多
关键词 嗜水气单胞菌 铁氧还蛋白还原酶 可溶性表达 蛋白纯化 酶活 二三维结构
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